小白菊內(nèi)酯通過抑制Piezo1 表達對機械牽張應(yīng)力作用下軟骨細胞凋亡的影響及其機制

［摘 要］ 目的：探討小白菊內(nèi)酯 （PTL） 通過調(diào)控機械敏感性離子通道蛋白1（Piezo1） 表達對機械牽張應(yīng)力作用下軟骨細胞凋亡的影響，并闡明其相關(guān)作用機制。方法：按照拉伸性變量將軟骨細胞分為0%、5%、10%、15% 和20% 拉伸組。另取軟骨細胞，分為對照組、20% 拉伸組、20% 拉伸+5 μmol·L-1 PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L-1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L-1 PTL 組。使用Piezo1短發(fā)夾RNA （shRNA） 干擾慢病毒（sh-Piezo1） 或shRNA-NC 慢病毒感染軟骨細胞，將軟骨細胞分為sh-Piezo1 組和sh-NC 組，另設(shè)置空白對照組。另將軟骨細胞分為20% 拉伸組、20% 拉伸+PTL 組、20% 拉伸+sh-Piezo1 組和20% 拉伸+sh-Piezo1+PTL 組。Hoechst 33258 熒光染色觀察各組細胞核形態(tài)表現(xiàn)，流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率，分光光度法檢測各組細胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3 活性， CCK-8 法檢測各組細胞增殖率， Fluo-4/AM 熒光探針法檢測各組細胞中鈣離子（Ca2+） 水平，實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測各組細胞中Piezo1 mRNA 表達水平，Westernblotting法檢測各組細胞中Piezo1蛋白表達水平。結(jié)果：Hoechst 33258熒光染色觀察，隨著拉伸量逐漸增加，0%、5%、10%、15% 和20% 拉伸組軟骨細胞細胞核呈碎塊狀致密濃染的軟骨細胞數(shù)量逐漸增加。流式細胞術(shù)檢測，與0% 拉伸組比較，5%、10%、15% 和20% 拉伸組軟骨細胞凋亡率均明顯升高（Plt;0. 01）； 與對照組比較， 20% 拉伸組軟骨細胞中細胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 05）； 與20% 拉伸組比較， 20% 拉伸+5 μmol·L-1 PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L-1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L-1 PTL 組軟骨細胞細胞凋亡率均明顯降低（Plt;0. 05）；與20% 拉伸組比較，20% 拉伸+PTL 組和20% 拉伸+ sh-Piezo1 組軟骨細胞凋亡率均明顯降低（Plt;0. 05）。分光光度法檢測，與0%拉伸組表示，5%、10%、15% 和20% 拉伸組軟骨細胞中Caspase-3 活性均明顯升高（Plt;0. 01）；與對照組比較，20% 拉伸組軟骨細胞中Caspase-3 活性明顯升高（Plt;0. 05）；與20% 拉伸組比較，20%拉伸+5 μmol·L－1 PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L－1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L－1 PTL 組軟骨細胞中Caspase-3 活性均明顯降低（Plt;0. 05）；與20% 拉伸組比較，20% 拉伸+PTL 組和20% 拉伸+sh-Piezo1 組軟骨細胞中Caspase-3 活性均明顯降低（Plt;0. 05）。CCK-8 法檢測，與0 μmol·L－1 PTL 組比較， 40. 00、80. 00 和160. 00 μmol·L-1 PTL 組軟骨細胞增殖率均明顯降低（Plt;0. 05）， 提示20. 00 μmol·L-1 PTL 為最高無毒性作用濃度。Fluo-4/AM 熒光探針法檢測，與對照組比較，20% 拉伸組軟骨細胞中Ca2+水平明顯升高（Plt;0. 05）；與20% 拉伸組比較，20% 拉伸+5 μmol·L－1 PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L－1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L－1 PTL 組軟骨細胞中Ca2+水平均明顯降低（Plt;0. 05）；與20% 拉伸組比較，20% 拉伸+PTL 組和20% 拉伸+sh-Piezo1 組軟骨細胞中Ca2+水平均明顯降低（Plt;0. 05）。RT-qPCR 法檢測，與空白對照組和sh-NC 組比較，sh-Piezo1 組軟骨細胞中Piezo1 mRNA 表達水平明顯降低（Plt;0. 05）。Western blotting 法檢測，與對照組比較，20% 拉伸組軟骨細胞中Piezo1 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 05）；與20% 拉伸組比較，20% 拉伸+5 μmol·L－1PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L－1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L－1 PTL 組軟骨細胞中Piezo1 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）；與空白對照組和sh-NC 組比較，sh-Piezo1 組軟骨細胞中Piezo1 蛋白表達水平明顯降低 （Plt;0. 05）。結(jié)論：PTL可抑制高強度周期性機械牽張應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡，其作用機制可能與抑制Piezo1 介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流引起的細胞凋亡有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 小白菊內(nèi)酯； 機械敏感離子通道蛋白1； 機械牽張應(yīng)力； 軟骨細胞； 細胞凋亡

［中圖分類號］ R681. 3 ［文獻標志碼］ A

骨關(guān)節(jié)炎是一種非炎癥性的退行性關(guān)節(jié)病，患者行動過程中會引發(fā)關(guān)節(jié)疼痛和僵硬，其生活質(zhì)量受到嚴重影響［1-2］。骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制復(fù)雜，機械負荷是其發(fā)展過程中的重要因素之一。適度機械負荷能促進軟骨細胞生長發(fā)育，增強細胞合成代謝。但過度機械負荷會導(dǎo)致軟骨細胞凋亡，進而引發(fā)軟骨細胞丟失和骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生［3］。因此，抑制過度機械負荷后軟骨細胞的凋亡是防治骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵。機械敏感性離子通道蛋白1 （piezo typemechanosensitive ion channel component 1， Piezo1）是一種機械敏感性離子通道蛋白，可感受細胞膜機械力的變化， 包括壓縮、拉伸、重力和流體剪切等，通過增強鈣離子（calcium ion，Ca2+） 內(nèi)流改變膜電位進而將胞外機械信號轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)生物信號，參與調(diào)節(jié)發(fā)育、腫瘤發(fā)生和骨重塑等多種細胞生命進程［4-6］。然而，過度的機械應(yīng)力刺激可導(dǎo)致Piezo1 高表達， 造成Ca2+ 大量內(nèi)流， 引起細胞凋亡。陳墨龍等［7］ 發(fā)現(xiàn)： 過度機械牽拉應(yīng)力通過激活Piezo1 和下游需鈣蛋白酶2 （calpain 2，CAPN2） /B 細胞淋巴瘤2 相關(guān)X 蛋白（B-celllymphoma-2-associated X protein， BAX） /含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specificproteinase， Caspase）-3 通路誘導(dǎo)肌腱細胞凋亡。WANG 等［8］ 發(fā)現(xiàn)：Piezo1 在小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型和機械牽張應(yīng)力作用下的人軟骨細胞模型中高表達，抑制其表達可降低Ca2+水平并上調(diào)谷胱甘肽過氧化物酶4 （glutathione peroxidase 4， GPX4） 表達，從而減少小鼠骨關(guān)節(jié)炎程度和人軟骨細胞凋亡水平。Piezo1 可能是治療機械性骨關(guān)節(jié)炎的潛在靶點。小白菊內(nèi)酯（parthenolide，PTL） 是一種倍半萜烯內(nèi)酯類天然產(chǎn)物，來源于艾菊和觀光木等藥用植物，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎和抗動脈粥樣硬化等多種重要的藥理活性，臨床上常用于治療偏頭痛、發(fā)熱和類風濕性關(guān)節(jié)炎等［9］。研究［10-11］ 發(fā)現(xiàn)：PTL 可通過抗炎途徑發(fā)揮改善膝骨關(guān)節(jié)炎模型動物關(guān)節(jié)損傷的作用。然而， PTL 與Piezo1 的關(guān)系及其對高強度的機械牽張應(yīng)力作用下軟骨細胞凋亡的影響尚未完全闡明。本研究探討PTL 對機械牽張應(yīng)力作用下軟骨細胞中Piezo1 的調(diào)控作用及干擾Piezo1 對細胞凋亡的影響， 并闡明其相關(guān)作用機制，為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供參考。

1 材料與方法

1. 1 細胞、主要試劑和儀器 永生化人關(guān)節(jié)軟骨細胞及其專用培養(yǎng)液購自上?？道噬锟萍加邢薰?。4% 多聚甲醛固定液、Hoechst 33258 染色液、Caspase-3 活性檢測試劑盒和Ca2+ 熒光探針（Fluo-4/AM） 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PTL 購自美國MCE 公司， CCK-8 檢測試劑盒和Annexin Ⅴ -FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自翌圣生物科技（上海） 股份有限公司，Piezo1 抗體購自美國ThermoFisher Scientific 公司，GAPDH 抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公，Piezo1 引物、Piezo1 短發(fā)夾RNA （short hairpin RNA， shRNA）干擾慢病毒（sh-Piezo1，滴度：3. 12×108 TU·mL－1）及其陰性對照慢病毒（shRNA-NC，滴度：1. 36×108 TU·mL-1） 由上海和元生物技術(shù)有限公司提供。張力系統(tǒng)（型號： Flexcell-5000） 購自美國Flexcell 公司， CO2 培養(yǎng)箱（型號： 311） 和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ 型號： CL750） 購自美國ThermoFisher Scientific 公司， 倒置熒光顯微鏡（型號：CKX41） 購自日本Olympus 公司，流式細胞儀（型號：FACSCtoⅡ） 購自美國BD 公司，多功能酶標儀（ 型號： HH34000000） 購自美國Perkinelmer 公司。

1. 2 細胞培養(yǎng) 永生化人關(guān)節(jié)軟骨細胞采用專用培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度生長至90% 時， 棄去培養(yǎng)基， 加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS） 清洗1 次，加入1 mL 胰蛋白酶室溫消化2 min，待大部分細胞變圓脫落后，加入2 mL 軟骨細胞專用培養(yǎng)液終止消化，收集細胞離心后分瓶培養(yǎng)并用于后續(xù)實驗。

1. 3 慢病毒感染 收集對數(shù)生長期軟骨細胞，以每孔1×105個細胞的密度接種至6 孔細胞培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中過夜。以病毒感染復(fù)數(shù)200 加入64. 1 mLsh-Piezo1 或147. 1 μL shRNA-NC 慢病毒， 將細胞分為sh-Piezo1 組和sh-NC 組，另設(shè)置空白對照組。同時，加入5 mg·L-1 Polybrene 促進病毒感染，8 h 后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，72 h 后收集細胞進行后續(xù)檢測。

1. 4 周期性機械牽張應(yīng)力刺激細胞 取對數(shù)生長期人軟骨細胞，按照每孔1×105個細胞的密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞生長至約80% 融合度時，采用Flexcell-5000 張力系統(tǒng)對軟骨細胞進行周期性機械拉伸［4］，以3 s 受力和3 s 放松為1 個周期，進行機械拉伸，頻率設(shè)置為0. 5 Hz，拉伸性變量為5%～20%，拉伸36 h。

1. 5 細胞分組和處理 按照拉伸性變量將軟骨細胞分為0%、5%、10%、15% 和20% 拉伸組。另取軟骨細胞，分為對照組、20% 拉伸組、20% 拉伸+5 μmol·L－1 PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L-1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L-1 PTL 組。其中對照組不作任何處理；20% 拉伸組軟骨細胞給予拉伸性變量為20% 的周期性機械牽張應(yīng)力刺激36 h； 20% 拉伸+5 μmol·L-1 PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L-1PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L-1 PTL 組軟骨細胞在20% 拉伸的基礎(chǔ)上分別給予5、10 及20 μmol·L-1PTL 處理。

另取軟骨細胞，將其分為20% 拉伸組、20% 拉伸+PTL 組、20% 拉伸+sh-Piezo1組和20% 拉伸+sh-Piezo1+PTL 組。其中20% 拉伸+PTL 組軟骨細胞進行拉伸性變量為20% 的周期性機械牽張應(yīng)力刺激36 h，同時給予20 μmol·L-1 PTL；20% 拉伸+sh-Piezo1 組軟骨細胞感染sh-Piezo1 慢病毒后再進行拉伸性變量為20% 的周期性機械牽張應(yīng)力刺激36 h 處理； 20% 拉伸+sh-Piezo1+PTL 組軟骨細胞感染sh-Piezo1 慢病毒后再進行拉伸性變量為20% 的周期性機械牽張應(yīng)力刺激和20 μmol·L-1PTL 干預(yù)36 h。

1. 6 Hoechst 33258熒光染色觀察各組細胞核形態(tài)表現(xiàn) 取對數(shù)生長期軟骨細胞，以每孔3×104個細胞的密度接種至6 孔細胞培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中過夜，給予拉伸性變量為0%～20% 的周期性機械牽張應(yīng)力刺激36 h。取出培養(yǎng)板，經(jīng)4% 多聚甲醛固定液室溫固定10 min ， PBS 緩沖液清洗3 次，每孔加入500 μL Hoechst 33258 染色液，室溫避光孵育5 min， PBS 緩沖液清洗3 次， 熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)表現(xiàn)。

1. 7 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率 收集各組細胞，加入400 μL Annexin Ⅴ-FITC 結(jié)合液重懸細胞，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 染色液，輕輕吹打混勻，再加入10 μL PI 染色液，輕輕吹打混勻，室溫（20 ℃～25 ℃） 避光孵育20 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1. 8 分光光度法檢測各組細胞中 Caspase-3活性 收集各組細胞，PBS 緩沖液清洗1 次，加入100 μL裂解液于冰上裂解15 min， 4 ℃ 、20 000 g 離心10 min， 取上清， 參照Caspase-3 活性檢測試劑盒檢測說明書操作， 同時設(shè)置標準品組。采用酶標儀檢測波長405 nm 處吸光度（A） 值，根據(jù)標準品A 值和標準品濃度繪制標準曲線，計算各組細胞中Caspase-3 活性。Caspase-3 活性= 實驗孔A 值/對照孔A 值。

1. 9 CCK-8法檢測各組細胞增殖率 收集對數(shù)生長期軟骨細胞，以每孔3×103個細胞的密度接種至96 孔細胞培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中過夜。給予0、1. 25、2. 50、5. 00、10. 00、20. 00、40. 00、80. 00 和160. 00 μmol·L-1 PTL 處理36 h， 并設(shè)置空白孔，提前4 h 取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK-8 工作液， 37 ℃ 孵育4 h， 采用多功能酶標儀檢測波長450 nm 處A 值。細胞增殖率= ［ （實驗孔A值－ 空白孔A 值） / （對照孔A 值－ 空白孔A值）］ ×100%。

1. 10 Fluo-4/AM 熒 光 探 針 法 檢 測 各 組 細 胞 中Ca2+水平 收集各組細胞，PBS緩沖液清洗 3次，加入500 μL 1 μmol·L-1 Fluo-4/AM 工作液， 37 ℃避光孵育45 min，PBS 緩沖液清洗3 次，流式細胞儀檢測細胞中Fluo-4 熒光強度，以Fluo-4 熒光強度代表細胞中Ca2+水平。

1. 11 實時熒光定量 PCR（real-time fluorescencequantitative PCR，RT-qPCR）法檢測各組細胞中Piezo1 mRNA 表達水平 收集各組細胞，加入TRIzol 裂解液，于冰上提取總RNA。多功能酶標儀檢測RNA 濃度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 并擴增。以β-actin 為內(nèi)參，采用2－△△Ct 法計算Piezo1 mRNA 表達水平。引物序列： Piezo1 F5'-ATCGCCATCATCTGGTTCCC-3'， R 5'-TGGTGAACAGCGGCTCATAG-3'； β -actin F 5'-GCCGCCAGCTCACCAT-3'， R 5'-TCGTCGCCCACATAGGAATC-3'。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，共40 次循環(huán)。

1. 12 Western blotting 法檢測各組細胞中 Piezo1蛋白表達水平 收集各組細胞，加入RIPA裂解液，冰上孵育30 min 提取總蛋白，4 ℃、12 000 r·min－1離心5 min 收集上清， 金屬浴煮沸10 min。采用BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度， 每組細胞取30 μg 蛋白上樣、電泳和轉(zhuǎn)膜處理后， 50 g·L-1 脫脂奶粉室溫孵育1 h，加入Piezo1 抗體（1∶1 000）和β-actin （1∶10 000） 抗體4 ℃孵育過夜，TBST 溶液清洗3次，加入HRP標記的羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，滴加顯影液，凝膠成像儀顯影。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 蛋白條帶灰度值。

1. 13 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 26. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組細胞凋亡率、細胞增殖率、細胞中Ca2+水平、Caspase-3 活性和Piezo1 mRNA 及蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以x±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 各組軟骨細胞核形態(tài)表現(xiàn) 凋亡細胞的細胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染， 熒光亮度增強。隨著拉伸量逐漸增加，0%、5%、10%、15%和20% 拉伸組軟骨細胞的細胞核呈碎塊狀致密濃染的軟骨細胞數(shù)量逐漸增加。見圖1。

2. 2 各組軟骨細胞凋亡率 與 0% 拉伸組比較，5%、10%、15% 和20% 拉伸組軟骨細胞凋亡率均明顯升高（Plt;0. 01）。與對照組比較，20% 拉伸組軟骨細胞中細胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 05）； 與20% 拉伸組比較，20% 拉伸+5 μmol·L－1 PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L－ 1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L－1 PTL 組軟骨細胞細胞凋亡率均明顯降低（Plt;0. 05）。與 20% 拉伸組（36. 36%±2. 61%）比較，20% 拉伸 + PTL 組（18. 80%±1. 41%） 和20% 拉伸+sh-Piezo1 組（11. 34%± 2. 49%） 軟骨細胞凋亡率均明顯降低（Plt;0. 05）；與20% 拉伸+sh-Piezo1 組比較， 20% 拉伸+sh-Piezo1+PTL 組（11. 86%±2. 17%） 軟骨細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見圖2～6。

2. 3 各組軟骨細胞中Caspase-3活性 與0%拉伸組比較，5%、10%、15% 和20% 拉伸組軟骨細胞中Caspase-3 活性均明顯升高（Plt;0. 01）。與對照組比較，20% 拉伸組軟骨細胞中Caspase-3 活性明顯升高（Plt;0. 05）；與20% 拉伸組比較，20% 拉伸+5 μmol·L－1 PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L－1PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L－1 PTL 組軟骨細胞中Caspase-3 活性均明顯降低（Plt;0. 05）。與20%拉伸組比較， 20% 拉伸+PTL 組和20% 拉伸+sh-Piezo1 組軟骨細胞中Caspase-3 活性均明顯降低（Plt;0. 05），20% 拉伸+sh-Piezo1+PTL 組軟骨細胞中Caspase-3 活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05）。與20% 拉伸+sh-Piezo1 組比較， 20% 拉伸+sh-Piezo1+PTL 組軟骨細胞中Caspase-3 活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見圖7～9。

2. 4 各組軟骨細胞增殖率 與0 μmol·L－1 PTL 組比較，1. 25、2. 50、5. 00、10. 00 和20. 00 μmol·L－1PTL 組軟骨細胞增殖率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05）， 40. 00、80. 00 和160. 00 μmol·L－1 PTL 組軟骨細胞增殖率均明顯降低（Plt;0. 05），提示20. 00 μmol·L－ 1 PTL 為最高無毒性作用濃度。見圖10。

2. 5 各組軟骨細胞中 Ca2+水平 與對照組比較，20% 拉伸組軟骨細胞中Ca2+水平升高（Plt;0. 05）；與20%拉伸組比較，20%拉伸+5 μmol·L－1 PTL 組、20% 拉伸+10 μ mol·L － 1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L－ 1 PTL 組軟骨細胞中Ca2+ 水平均明顯降低（Plt;0. 05）。與20% 拉伸組比較，20% 拉伸+PTL 組和20% 拉伸+sh-Piezo1 組軟骨細胞中Ca2+水平均明顯降低（ Plt;0. 05），20%拉伸+sh-Piezo1+PTL 組軟骨細胞中Caspase-3 活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05）； 與20% 拉伸+sh-Piezo1 組比較，20% 拉伸+sh-Piezo1+PTL 組軟骨細胞中Ca2+ 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見圖11～14。

2. 6 各組細胞中Piezo1 mRNA表達水平 與空白對照組（0. 99±0. 03） 和sh-NC 組（0. 95±0. 05）比較， sh-Piezo1 組軟骨細胞中Piezo1 mRNA 表達水平（0. 20±0. 08） 明顯降低（Plt;0. 05）。

2. 7 各組軟骨細胞中 Piezo1蛋白表達水平 與對照組比較， 20% 拉伸組軟骨細胞中Piezo1 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 05）；與20% 拉伸組比較，20% 拉 伸 + 5 μmol·L－ 1 PTL 組、20% 拉 伸+10 μmol·L－ 1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L－ 1PTL 組軟骨細胞中Piezo1 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）。與空白對照組（0. 43±0. 05） 和sh-NC 組（0. 42±0. 06） 比較， sh-Piezo1 組軟骨細胞中Piezo1 蛋白表達水平（0. 07±0. 03） 明顯降低（Plt;0. 05）， 提示軟骨細胞中Piezo1 基因表達被成功干擾。見圖15 和16。

3 討 論

研究［12］ 顯示：機械負荷過高誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡是誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎的因素之一，長期從事體力勞動人群、肥胖人群及運動員關(guān)節(jié)長期受到過度負荷， 更易導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎。CHANG 等［13］ 發(fā)現(xiàn)： 過度的機械負荷會通過DAN 結(jié)構(gòu)域BMP 拮抗劑家族成員1 （DAN domain BMP antagonist family member 1，gremlin-1） /核因子κB （nuclear factor kappa-B，NF-κB） 途徑促進小鼠骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展。ZHAO 等［14］發(fā)現(xiàn)：機械超負荷誘導(dǎo)的微小RNA （microRNAs，miR）-325-3p 表達水平降低可促進軟骨細胞衰老，加劇小關(guān)節(jié)退變。伍偉挺等［15］ 發(fā)現(xiàn)：高負荷周期性機械應(yīng)力可能通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路加速軟骨細胞凋亡，促進軟骨細胞炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示：在體外培養(yǎng)的軟骨細胞中，周期性機械牽張應(yīng)力可明顯誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡，并上調(diào)Piezo1 表達。PTL 和干擾Piezo1 基因表達均可抑制周期性機械牽張應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡， 同時抑制Ca2+內(nèi)流， 提示PTL 在周期性機械牽張應(yīng)力介導(dǎo)的軟骨細胞凋亡的作用和機制，可能為骨關(guān)節(jié)炎臨床治療提供新方向。

Piezo1 是機械敏感離子通道蛋白，其參與腫瘤細胞、肌腱細胞和軟骨細胞等多種細胞機械負荷誘導(dǎo)的凋亡進程［7，16-17］。Piezo1 在軟骨細胞中穩(wěn)定表達，不僅可以通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatedprotein kinase，MAPK） /細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 （extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2） 的經(jīng)典MAPK 信號通路參與細胞凋亡過程，還可介導(dǎo)機械刺激下Ca2+內(nèi)流，維持細胞內(nèi)游離Ca2+和結(jié)合鈣動態(tài)平衡［18］。過度機械負荷可激活Piezo1 介導(dǎo)細胞內(nèi)Ca2+超載，導(dǎo)致線粒體呼吸功能障礙及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而啟動Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，進而誘導(dǎo)細胞凋亡［19-20］。因此，下調(diào)Piezo1 表達可能抑制胞內(nèi)Ca2+超載增強軟骨細胞機械負載的抵抗閾值，促進細胞活性，從而改善骨關(guān)節(jié)炎。本研究結(jié)果顯示：干擾Piezo1 基因表達可抑制周期性機械牽張應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡，并降低細胞內(nèi)Ca2+水平， 提示Poezo1 激活介導(dǎo)Ca2+超載是周期性機械牽張應(yīng)力誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡的關(guān)鍵因素。

PTL 來源于藥草短舌匹菊的倍半萜內(nèi)酯， 具有抗炎、抗病毒和抗腫瘤等藥理作用。朱芳曉等［21］發(fā)現(xiàn)： PTL 可減輕兔骨關(guān)節(jié)炎癥狀， 可能是通過抑制血清和關(guān)節(jié)腔腫瘤壞死因子α （tumor necrosisfactor alpha， TNF- α） 和 白 細 胞 介 素 1β（interleukin-1β， IL-1β） 等炎癥因子分泌實現(xiàn)的。LIU 等［10］ 發(fā)現(xiàn)： Piezo1 可抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生，并對膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎的進展表現(xiàn)出保護作用。然而，高強度的機械牽張應(yīng)力被認為是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的重要外界致病因素， 但PTL 對高強度的機械牽張應(yīng)力作用下軟骨細胞凋亡的影響尚未完全闡明。本研究結(jié)果顯示： PTL 可以有效抑制周期性機械牽張應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡，并下調(diào)細胞中Piezo1 表達，同時降低軟骨細胞中Ca2+水平和Caspase-3 活性， 而在Piezo1 基因沉默的軟骨細胞中加入PTL 干預(yù)后， 并未進一步抑制周期性機械牽張應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡，提示PTL 通過調(diào)控Piezo1 表達，發(fā)揮抑制周期性機械牽張應(yīng)力誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡的作用。

綜上所述， 周期性機械牽張應(yīng)力可通過調(diào)控Piezo1 介導(dǎo)Ca2+超載促進軟骨細胞凋亡，PTL 可通過下調(diào)Piezo1 表達降低細胞中Ca2+水平，進而抑制軟骨細胞凋亡。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：馬旋參與研究選題、數(shù)據(jù)收集整理和論文撰寫，楊開祥參與實驗操作，鄧海參與數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，黃玉成參與論文審校和指導(dǎo)。

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