血葉蘭化學(xué)成分及其生物活性研究

摘 要：" 為探究血葉蘭（Ludisia discolor）的化學(xué)成分和生物活性，該研究利用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析乙醇提取物石油醚萃取相的化合物，利用硅膠、Sephadex LH-20和半制備高效液相等多種色譜技術(shù)對乙酸乙酯萃取相進(jìn)行分離純化，運(yùn)用質(zhì)譜和核磁共振波譜分析鑒定化合物結(jié)構(gòu)，并對分離得到的化合物進(jìn)行抗炎和抗氧化活性測試。結(jié)果表明：（1）從石油醚萃取相中共鑒定出17個(gè)化合物，其中棕櫚酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯、2-單棕櫚酸甘油4個(gè)化合物具有較高的相對含量。（2）從乙酸乙酯萃取相中分離得到15個(gè)化合物，其結(jié)構(gòu)分別鑒定為羅漢松脂素（1）、（+）-松脂素（2）、callyspongidipeptide A（3）、環(huán)- ［（S）-脯氨酸-（R）-亮氨酸］（4）、epi-boscialin（5）、對苯二甲酸二丁酯（6）、對香豆酸甲酯（7）、對羥基苯乙酮（8）、對羥基苯甲醇（9）、對羥基苯甲醛（10）、香草醛（11）、4-（甲氧基甲基）苯酚（12）、β-谷甾醇（13）、肉豆蔻酸（14）和棕櫚酸（15），化合物1-15均為首次從血葉蘭中分離得到。（3）化合物1和化合物2具有一定抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7產(chǎn)生NO的作用，其IC50分別為（37.76±2.68）和（53.14±1.63） μmol·L-1" ［陽性對照槲皮素IC50 值為（9.32±0.36） μmol·L-1］；抗氧化結(jié)果顯示，化合物1和化合物2對DPPH自由基具有一定清除能力，IC50值分別為（51.22±1.07）和（79.22±7.44） μg·mL-1" ［陽性對照維生素C IC50值為（6.01±0.17） μg·mL-1］；同時(shí)，這兩個(gè)化合物對ABTS·＋自由基表現(xiàn)出強(qiáng)于陽性對照trolox" ［IC50 =（34.65±0.53） μg·mL-1］的清除能力，其IC50值分別為（2.21±0.01）和（3.58±0.17） μg·mL-1。該研究豐富了血葉蘭的化學(xué)成分，進(jìn)一步明確了其抗氧化和抗炎活性成分，為后續(xù)藥理活性的深入研究提供了化學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 血葉蘭屬， 血葉蘭， 化學(xué)成分， 抗炎活性， 抗氧化活性

中圖分類號：" Q946"文獻(xiàn)標(biāo)識碼：" A

Chemical constituents and their biological activities of Ludisia discolor

SHEN Ying1，2， CHEN Huiqin2， WU Fei2， MEI Wenli2， ZHONG Yunfang1，F(xiàn)ENG Xueping1*， DAI Haofu2*

（1." Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and Ornamental Plant， Ministry of Education， College of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou 570228， China; 2. Key Laboratory of Natural Products Research and Development of Li Folk Medicine of Hainan Province amp; Key Laboratory for Biology and Genetic Resources of Tropical Crops of Hainan Province， Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 571101， China ）

Abstract：" In order to explore the chemical constituents and their biological activities of Ludisia discolor， gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） was carried out to analyze the chemical constituents of petroleum ether fraction of ethanol extracts. Meanwhile， the compounds were isolated from the ethyl acetate fraction by using various column chromatography including silica gel， Sephadex LH-20， and semi-preparative HPLC. MS and nuclear mgnetic resonance （NMR） spectroscopic analysis were used to identify the structure of the compounds. And then the isolated compounds were tested for anti-inflammatory with RAW 264.7 cells， and antioxidant activities were carried out with DPPH and ABTS·＋ free radical scavenging ability. The results showed as follows： （1） A total of 17 compounds were identified from the petroleum ether fraction of L. discolor， in which， methyl palmitate， methyl linoleate， methyl linolenic acid， and 2-monopalmitin had a relatively high content. （2） A total of 15 compounds were isolated from the ethyl acetate fraction， their structures were identified as matairesinol （1）， （＋）-pinoresinol （2）， callyspongidipeptide A （3）， cyclo- ［（S）-Pro-（R）-Leu］ （4）， epi-boscialin （5）， dibutyl terephthalate （6）， methyl 4-hydroxycinnamate （7）， 1-（4-hydroxyphenyl） ethanone （8）， 4-hydroxybenzyl alcohol （9）， p-hydroxy-benzaldehyde （10）， vanillin （11）， 4-（methoxym-ethyl） phenol （12）， β-sitosterol （13）， tetradecanoic acid （14）， and palmitic acid （15）， respectively. Compounds 1-15 were isolated from L. discolor for the first time. （3） Phenylpropanoid compounds 1 and 2 showed moderate inhibition on NO production from RAW 264.7 cells induced by LPS， with IC50 values of （37.76 ± 2.68） μmol·L-1 and （53.14 ± 1.63） μmol·L-1 ［（quercetin as the positive control， with IC50 value of （9.32 ± 0.36） μmol·L-1］， respectively. Antioxidant results showed that compounds 1 and 2 had moderate DPPH free radical scavenging ability， with IC50 values of （51.22 ± 1.07） μg·mL-1 and （79.22 ± 7.44） μg·mL-1" ［vitamin C as the positive control， with IC50 value of （6.01±0.17） μg·mL-1］， respectively. Meanwhile， they had stronger ABTS·＋ free radical scavenging ability than the positive control trolox" ［IC50 = （34.65 ± 0.53） μg·mL-1］， with IC50 values of （2.21 ± 0.01） μg·mL-1 and （3.58 ± 0.17） μg·mL-1， respectively. Overall， this study enriched the chemical constituents of L. discolor， and it was further clarified that phenolic compounds are the active antioxidant constituents in L. Discolor， and phenylpropanoid compounds have certain anti-inflammatory activities， which provides a chemical structure basis for subsequent in-depth pharmacological research.

Key words： Ludisia， Ludisia discolor， chemical constituents， anti-inflammatory activity， antioxidant activity

血葉蘭（Ludisia discolor）是蘭科（Orchidaceae）血葉蘭屬多年生草本植物，因其根狀莖匍匐，莖節(jié)明顯，好似蠶臥于石上，因此又名“石蠶”“石上藕”（林振興， 2012）。血葉蘭為常綠植物，既可賞花又可觀葉，國內(nèi)主要分布于海南、廣東、廣西、福建等地，喜生于山坡或溝谷常綠闊葉林陰濕處（中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì)， 1999）。血葉蘭全草入藥，為藥食同源植物，其味甘微澀、性涼（黃澤豪和沈賢娟， 2013），《中華本草》記載其功效：“潤肺、健脾、安神，主治肺結(jié)核咯血、神經(jīng)衰弱、食欲不振等”（國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì)， 1999），海南黎族同胞常將適量血葉蘭用水煎服或洗凈后生咀服或搗汁服（戴好富和梅文莉， 2010）。前期僅采用高效液相色譜法對血葉蘭及其近緣種金線蓮（Anoectochilus roxburghii）進(jìn)行指紋圖譜對比，發(fā)現(xiàn)血葉蘭中含有蘆丁、水仙苷、槲皮素、異槲皮苷等黃酮及其苷類化合物（楊漪等， 2021; 王沙等， 2023），至今尚未有對血葉蘭中具體化學(xué)成分以及藥理活性的相關(guān)報(bào)道。因此，為深入了解血葉蘭中的化學(xué)成分，探究其活性物質(zhì)，本研究對血葉蘭乙醇提取物石油醚萃取相進(jìn)行了GC-MS檢測分析，同時(shí)對乙酸乙酯萃取相進(jìn)行分離純化，并對分離得到的單體化合物進(jìn)行抗炎和抗氧化活性測試，為血葉蘭資源的開發(fā)利用提供一定依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

血葉蘭成年植株樣品于2022年6月購自福建省熱帶作物科學(xué)研究所，人工栽培種。經(jīng)福建省熱帶作物科學(xué)研究所鄭濤研究員鑒定其為蘭科血葉蘭屬血葉蘭（Ludisia discolor）。憑證標(biāo)本（XYL202206）存放于海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院。

1.2 儀器與試劑

Heidolph Laborta 20大型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國 Heidolph 公司）；安捷倫1260分析型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；安捷倫1260半制備型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；半制備色譜柱C18（4.6 mm ID×250 mm，日本 COSMOSIL 公司）；7820-5977氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫科技公司）；EYELA N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；BD-100A自動(dòng)接樣器（上海青浦滬西儀器廠）；Bruker AV-500型超導(dǎo)核磁儀（德國 Bruker 公司）；BP221S萬分之一分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；ELX-800 酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；薄層層析硅膠板和層析柱硅膠G（60～80目，200～300目，青島海洋化工集團(tuán)公司）；MCI柱色譜小孔樹脂（日本東京三菱化學(xué)公司）；凝膠Sephadex LH-20（德國 Merck 公司）；維生素C（德國 Sigma-Aldrich 公司）；Trolox（美國 MedChemExpress 公司）；K2S2O8、DPPH（上海麥克林生化科技有限公司）；ABTS（北京索萊寶科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)室所用常規(guī)試劑均為分析純。

1.3 樣品的提取

血葉蘭樣品（鮮重30.0 kg）切成約1 cm的小段后用95%乙醇室溫下浸提4次，得到465.5 g提取物，加入適量純水制成懸濁液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，分別得到石油醚萃取物39.8 g、乙酸乙酯萃取物40.1 g、正丁醇萃取物254.5 g。

1.4 GC-MS分析條件

氣相色譜條件：采用HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane （30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱；柱子的初始溫度50 ℃，以5 ℃·min-1的速度升溫到310 ℃，保持10 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純度的氦氣 （99.999%），流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量1.0 μL，采用的進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，溶劑延遲時(shí)間4 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI），能量70 eV，接口溫度280 ℃，EI溫度230 ℃，四極桿的溫度150 ℃，調(diào)諧方式為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧，電子倍增電壓1 718 kV，質(zhì)量掃描范圍m/z 20～800（劉欣怡等， 2022）。

1.5 化合物的分離

將乙酸乙酯萃取物（40.1 g）經(jīng)硅膠減壓柱色譜，以石油醚∶乙酸乙酯 ［100∶1→1∶1，V/V（下同）］和氯仿∶甲醇（100∶1→1∶1）混合溶劑依次進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)薄層層析色譜（TLC）檢測，合并后得到23個(gè)組分（Fr.1-Fr.23）。

Fr.8 （252.6 mg）經(jīng)Sephadex LH-20 色譜柱以氯仿∶甲醇（1∶1）洗脫后得到3個(gè)組分（Fr.8.1-Fr.8.3）。Fr.8.1 （33.1 mg）經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚∶乙酸乙酯（40∶1）為洗脫劑，分離得到化合物 13 （8.2 mg）；Fr.8.2 （49.0 mg）經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚∶氯仿∶異丙醇（100∶100∶0.01）為洗脫劑，分離得到化合物 14 （5.9 mg）；Fr.8.3 （170.5 mg） 經(jīng)反復(fù)正向硅膠柱色譜、Sephadex LH-20 色譜柱（甲醇），分離得到化合物12 （2.9 mg） 和化合物15 （38.6 mg）；剩余組分（40.5 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜（C18柱，甲醇∶水=23∶77恒梯度洗脫；流速 4 mL·min-1；檢測波長 210 nm），得到化合物 11 （23.0 mg，tR=16.2 min）和化合物10 （3.4 mg，tR=7.0 min）。Fr.10 （135.5 mg）依次經(jīng)Sephadex LH-20 （氯仿-甲醇1∶1）、正向硅膠柱色譜（石油醚-乙酸乙酯60∶1）分離純化，得到化合物 9 （12.4 mg）；剩余組分（8.0 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜（C18柱，甲醇∶水= 40∶60恒梯度洗脫；流速 4 mL·min-1；檢測波長 280 nm），分離得到化合物 7 （0.5 mg，tR=35.0 min）。Fr.11 （113.0 mg）依次經(jīng)Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）、半制備高效液相色譜（C18柱，甲醇∶水= 30∶70恒梯度洗脫；流速 4 mL·min-1；檢測波長 280 nm），分離得到化合物 8 （0.5 mg，tR=16.0 min）。Fr.13 （153.0 mg）依次經(jīng)Sephadex LH-20 （甲醇）、正向硅膠色譜柱（氯仿）分離純化，得到化合物 6 （3.0 mg）。Fr.16 （4.2 g）經(jīng)小孔吸附樹脂柱（MCI）以甲醇∶水（1∶9→1∶0）梯度洗脫得到11個(gè)組分（Fr.16.1-Fr.16.11）。Fr.16.2 （34.0 mg）經(jīng)硅膠柱色譜以氯仿為洗脫劑，得到組分Fr.16.2.1 （9.8 mg），經(jīng)半制備高效液相色譜（C18柱，甲醇∶水= 40∶60恒梯度洗脫；流速 4 mL·min-1；檢測波長 230 nm），分離得到化合物 2 （3.2 mg，tR=15.4 min）和化合物1 （4.5 mg，tR=17.2 min）；Fr.16.4 （210.4 mg）依次經(jīng)Sephadex LH-20 （甲醇）、半制備高效液相色譜（C18柱，甲醇∶水= 23∶77恒梯度洗脫；流速 4 mL·min-1；檢測波長 210 nm），分離得到化合物 3 （1.7 mg，tR=27.0 min）、化合物4 （2.2 mg，tR=31.2 min）和化合物5 （3.0 mg，tR=49.1 min）。

1.6 抗炎活性測試

抗炎活性測試參考胡夢君（2017）的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測試。

選取RAW 264.7細(xì)胞，空白組為含脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的培養(yǎng)基，對照組為槲皮素，陰性對照組為DMSO，實(shí)驗(yàn)組加入單體化合物。用酶標(biāo)儀在540 nm波長下每組平行測定3次，計(jì)算NO的抑制率。將初篩活性良好的化合物倍半稀釋5個(gè)梯度，分別計(jì)算其抑制率，并計(jì)算其IC50。抑制率的公式如下：

抑制率（%）=（A2-A1） / （A2-A0）×100；

式中：A0表示空白對照組（不加LPS）吸光度值；A1表示實(shí)驗(yàn)組的吸光度值；A2表示陰性對照組（加LPS）的吸光度值。

1.7 DPPH法抗氧化能力測試

準(zhǔn)確配制0.1 mol·mL-1 DPPH儲(chǔ)備液，冷藏儲(chǔ)存。配制維生素C（200 μg·mL-1）DMSO溶液作為陽性對照，稱取樣品用DMSO溶液溶解并配制成樣品溶液（200 μg·mL-1）作為待測樣品組，將對照組和待測組均稀釋7個(gè)梯度。

將稀釋7個(gè)濃度的待測溶液分別取320 μL于1.5 mL離心管中，再加入320 μL DPPH儲(chǔ)備液，搖勻后避光放置30 min，取200 μL加入96孔板中，重復(fù)3次；若樣品顏色較深則需要減去樣品本底吸收，本底組為320 μL DMSO溶液，加入乙醇溶液320 μL，取200 μL于96孔板中，重復(fù)3次。利用酶標(biāo)儀檢測在517 nm波長下每個(gè)孔的OD值（Hu et al.， 2018）。

計(jì)算化合物抗氧化能力的公式如下：

清除率（%） = （1-OD樣品－OD本底OD空白）×100；

式中：OD本底表示本底的吸光度值；OD樣品表示待測樣品的吸光度值；OD空白表示空白的吸光度值。

1.8 TEAC法測定ABTS·+清除活性

稱取19.54 mg的ABTS·＋溶于5 mL雙蒸水中，3.32 mg的K2S2O8溶于88 μL雙蒸水中，將兩種溶液充分混勻后30 ℃避光處理12 h后，加入約200 mL蒸餾水稀釋，通過酶標(biāo)儀檢測在734 nm波長處的吸光度，直至稀釋到其OD值為（0.70 ± 0.02），配制成ABTS·+溶液。配制trolox（200 μg·mL-1）DMSO溶液作為陽性對照，稱取樣品用DMSO溶液溶解并配制成樣品溶液（200 μg·mL-1）作為待測樣品組，將對照組和待測組均稀釋7個(gè)梯度。

將稀釋的7個(gè)濃度的待測液體分別取160 μL于1.5 mL離心管中，再加入480 μL ABTS·+溶液，搖勻后避光放置6 min，取200 μL加入96孔板中，重復(fù)3次；若樣品顏色較深則需要減去樣品本底吸收，本底組為160 μL DMSO溶液，加入乙醇溶液320 μL，取200 μL于96孔板中，重復(fù)3次。利用酶標(biāo)儀檢測在734 nm波長下每個(gè)孔的OD值（Payet et al.， 2005）。

計(jì)算化合物抗氧化能力的公式同1.7。

2 結(jié)果與分析

2.1 石油醚相GC-MS分析結(jié)果

按上述GC-MS條件對石油醚萃取相的化學(xué)成分進(jìn)行分析，得到總離子流色譜圖（圖1）。運(yùn)用峰面積歸一法計(jì)算化合物的相對百分含量，所鑒定出的化學(xué)成分及其含量分析結(jié)果見表1，共鑒定出17個(gè)化學(xué)成分，占總相對含量的81.35%。結(jié)果顯示，相對含量較高的化學(xué)成分為棕櫚酸甲酯（13.50%）、亞油酸甲酯（12.73%）、亞麻酸甲酯（8.74%）、2-單棕櫚酸甘油（5.28%），共占相對含量的40.25%。其中，2，2′-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）為塑化劑（程暢等， 2021），可能由于在樣品初期提取時(shí)用塑料桶浸泡所致。GC-MS結(jié)果顯示石油醚相的主要成分均為脂肪酸類化合物。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

利用硅膠、Sephadex LH-20 柱色譜和半制備高效液相色譜等各種色譜技術(shù)對乙酸乙酯萃取相進(jìn)行分離純化得到15個(gè)化合物，經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振波譜分析，化合物結(jié)構(gòu)鑒定如圖2所示。

化合物1 淡黃色粉末（甲醇），分子式為C20H22O6，ESI-MS m/z： 359.4" ［M + H］+。1H-NMR （500 MHz， CD3OD） δH： 6.71 （1H， d， J =8.0Hz， H-5）， 6.69 （1H， d， J =2.0 Hz， H-2）， 6.68 （1H， d， J =8.0 Hz， H-5′）， 6.60 （1H， dd， J =8.0， 2.0 Hz， H-6）， 6.58 （1H， d， J =1.9 Hz， H-2′）， 6.53 （1H， dd， J =8.0， 1.9 Hz， H-6′）， 4.18 （1H， dd， J =9.0， 7.1 Hz， H-9a′）， 3.94 （1H， dd， J =9.1， 7.4 Hz， H-9b′）， 3.81 （3H， s， 3′-OCH3）， 3.80 （3H， s， 3-OCH3）， 2.91 （1H， dd， J =14.0， 5.4 Hz， H-7a）， 2.84 （1H， dd， J =14.0， 7.0 Hz， H-7b）， 2.68 （1H， m， H-8）， 2.55 （2H， d， J =8.3 Hz， H-7′）， 2.51 （1H， m， H-8′）; 13C-NMR （125 MHz， CD3OD） δC： 181.6 （C-9）， 149.0 （C-3）， 149.0 （C-3′）， 146.4 （C-4）， 146.4 （C-4′）， 131.4 （C-1′），130.8 （C-1）， 123.1 （C-6）， 122.2 （C-6′）， 116.2 （C-5′）， 116.1 （C-5）， 113.9 （C-2）， 113.3 （C-2′）， 72.9 （C-9′）， 56.4 （3-OCH3）， 56.4 （3′-OCH3）， 47.8 （C-8）， 42.6 （C-8′）， 38.9 （C-7′）， 35.4 （C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（程艷剛等， 2022）報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物1為羅漢松脂素。

化合物2 無色油狀（甲醇），分子式為C20H22O6，ESI-MS m/z： 359.4" ［M + H］+。1H-NMR （500 MHz， CD3OD） δH： 6.97 （2H， d， J =1.9 Hz， H-2， 2′）， 6.83 （2H， dd， J =8.1， 1.9 Hz， H-6， 6′）， 6.79 （2H， d， J =8.1 Hz， H-5， 5′）， 4.73 （2H， d， J =4.0 Hz， H-7， 7′）， 4.25 （2H， m， H-9a， 9′a）， 3.88 （6H， s， 3-OCH3， 3′-OCH3）， 3.85 （2H， d， J =3.4 Hz， H-9b， 9′b）， 3.16 （2H， m， H-8， 8′）; 13C-NMR （125 MHz， CD3OD） δC： 149.1 （C-3， 3′）， 147.3 （C-4， 4′）， 133.8 （C-1， 1′）， 120.1 （C-6， 6′）， 116.1 （C-5， 5′）， 111.0 （C-2， 2′）， 87.6 （C-7， 7′）， 72.6 （C-9， 9′）， 56.4 （3-OCH3， 3′-OCH3）， 55.4 （C-8， 8′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（In et al.， 2015; 魏云霞等， 2023）報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物2為（+）-松脂素。

化合物3 白色粉末（甲醇），分子式為C11H18N2O3，ESI-MS m/z： 249.3" ［M + Na］+。1H-NMR （500 MHz， CD3OD） δH： 4.22 （1H， ddd， J =9.5， 6.6， 2.1 Hz， H-9）， 4.09 （1H， d， J =2.3 Hz， H-6）， 3.59 （1H， m， H-3a）， 3.53 （1H， m， H-3b）， 2.34 （1H， m， H-5a）， 2.18 （1H， m， H-10）， 2.07 （1H， d， J =9.2 Hz， H-4a）， 2.03 （1H， d， J =14.6 Hz， H-4b）， 1.96 （1H， m， H-5b）， 1.46 （1H， m， H-11a）， 1.34 （1H， m， H-11b）， 1.09"（3H， d， J =7.2 Hz， H-12）， 0.95 （3H， t， J =7.5 Hz， H-13）; 13C-NMR （125 MHz， CD3OD） δC： 172.4 （C-1）， 167.2 （C-7）， 61.3 （C-6）， 60.0 （C-9）， 46.2 （C-3）， 37.1 （C-11）， 29.6 （C-5）， 25.5 （C-10）， 23.2 （C-4）， 15.6 （C-12）， 12.6 （C-13）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（Yang et al.， 2009）報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物3為callyspongidipeptide A。

化合物4 白色粉末（甲醇），分子式為C11H18N2O2，ESI-MS m/z： 233.3" ［M + Na］+。1H-NMR （500 MHz， CD3OD） δH： 4.28 （1H， ddd， J =9.3， 7.0， 1.8 Hz， H-9）， 4.15 （1H， t， J =5.8 Hz， H-6）， 3.53 （2H， m， H-3a， 3b）， 2.34 （1H， m， H-5a）， 2.07 （1H， m， H-11）， 2.03（1H， s， H-4b）， 1.99 （1H， m， H-10a）， 1.95 （1H， m， H-5b）， 1.91 （1H， d， J =3.4 Hz， H-4a）， 1.54 （1H， d， J =8.0 Hz， H-10b）， 0.99 （3H， d， J =6.3 Hz， H-12）， 0.97 （3H， d， J =6.3 Hz， H-13）; 13C-NMR （125 MHz， CD3OD） δC： 172.8 （C-1）， 168.9 （C-7）， 60.3 （C-6）， 54.7 （C-9）， 46.4 （C-3）， 39.4 （C-10）， 29.1 （C-5）， 25.8 （C-11）， 23.6 （C-4）， 23.3 （C-12）， 22.2 （C-13）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（張夢雪等， 2021）報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物4為環(huán)- ［（S）-脯氨酸-（R）-亮氨酸］。

化合物5 白色粉末（甲醇），分子式為C13H22O3，ESI-MS m/z： 227.3" ［M + H］+。1H-NMR （500 MHz， CD3OD） δH： 6.91 （1H， d， J =16.0 Hz， H-7）， 6.36 （1H， d， J =16.0 Hz， H-8）， 3.85 （1H， tt， J =11.6， 4.6 Hz， H-4）， 2.30 （3H， s， H-10）， 2.12 （1H， m， H-6）， 1.71 （2H， m， H-5）， 1.44 （2H， m， H-3）， 1.07 （3H， s， H-11）， 0.87 （3H， s， H-12）， 0.83 （3H， d， J =6.8 Hz， H-13）; 13C-NMR （125 MHz， CD3OD） δC： 200.8 （C-9）， 154.4 （C-7）， 131.6 （C-8）， 78.9 （C-1）， 67.2 （C-4）， 45.7 （C-3）， 41.0 （C-2）， 39.6 （C-5）， 35.3 （C-6）， 27.4 （C-10）， 25.9 （C-11）， 25.2 （C-12）， 16.5 （C-13）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（Pauli et al.， 1990；何珊等， 2015）報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物5為epi-boscialin。

化合物6 黃色油狀（甲醇），分子式為C16H22O4，ESI-MS m/z： 265.3" ［M + H］+。1H-NMR （500 MHz， CD3OD） δH： 7.75 （2H， d， J =5.7 Hz， H-3， 5）， 7.65 （2H， d， J =5.7 Hz， H-2， 6）， 4.31 （4H， t， J =6.6 Hz， H-9， 9′）， 1.59 （4H， m， H-10， 10′）， 1.33 （4H， m， H-11， 11′）， 1.00 （6H， t， J =7.5 Hz， H-12， 12′）; 13C-NMR （125 MHz， CD3OD） δC： 169.3 （C-7， 7′）， 133.6 （C-1）， 132.4 （C-4）， 132.3 （C-2， 6）， 129.9 （C-3， 5）， 66.7 （C-9， 9′）， 30.8 （C-10， 10′）， 20.3 （C-11， 11′）， 14.4 （C-12， 12′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（孫玉林等， 2013）報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物6為對苯二甲酸二丁酯。

化合物7 無色晶體（甲醇），mp 138 ～ 140 ℃，分子式為C10H10O3，ESI-MS m/z： 201.2" ［M + Na］+。1H-NMR （500 MHz， CD3OD） δH： 7.64 （1H， d， J =15.9 Hz， H-7）， 7.46 （2H， d， J = 8.6 Hz， H-2， 6）， 6.80 （2H， d， J = 8.6 Hz， H-3， 5）， 6.32 （1H， d， J =15.9 Hz， H-8）， 3.79 （3H， s， OCH3）; 13C-NMR （125 MHz， CD3OD） δC： 168.9 （C-9）， 162.6 （C-4）， 146.8 （C-7）， 131.2 （C-3， 5）， 126.5 （C-1）， 116.0 （C-2， 6）， 114.3 （C-8）， 51.7 （C-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（龔小見等， 2009）報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物7為對香豆酸甲酯。

化合物8 白色晶體（甲醇），mp 132 ～ 135 ℃，分子式為C8H8O2，ESI-MS m/z： 137.2" ［M + H］+。1H-NMR （500 MHz， CD3OD） δH： 7.90 （2H， d， J = 8.8 Hz， H-2， 6）， 6.84 （2H， d， J = 8.8 Hz， H-3， 5）， 2.54 （3H， s， CH3）; 13C-NMR （125 MHz， CD3OD） δC： 197.8 （C-7）， 161 （C-4）， 132.2 （C-2， 6）， 131.6 （C-1）， 116.4 （C-3， 5）， 26.3 （C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（Lu et al.， 2009; 馬宏宇等， 2010）報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物8為對羥基苯乙酮。

化合物9 白色晶體（甲醇），mp 114 ～ 122 ℃，分子式為C7H8O2，ESI-MS m/z： 125.1" ［M + H］+。1H-NMR （500 MHz， CD3OD） δH： 7.16 （2H， d， J =8.5 Hz， H-2， 6）， 6.74 （2H， J =8.5 Hz， H-3， 5）， 4.48 （2H， s， 7-CH2）; 13C-NMR （125 MHz， CD3OD） δC： 153.7 （C-1）， 129.8 （C-4）， 129.8 （C-2， 6）， 115.7 （C-3， 5）， 65.1 （-CH2）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（張偉和宋啟示， 2010）報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物9為對羥基苯甲醇。

化合物10 白色粉末（甲醇），分子式為C7H6O2，ESI-MS m/z： 123.1" ［M + H］+。1H-NMR （500 MHz， CD3OD） δH： 9.53 （1H， s， -CHO）， 7.63 （2H， d， J =8.6 Hz， H-2， 6）， 6.68 （2H， d， J =8.6 Hz， H-3， 5）; 13C-NMR （125 MHz， CD3OD） δC： 192.1 （-CHO）， 163.4 （C-4）， 131.7 （C-2， 6）， 130.1 （C-1）， 115.7 （C-3， 5）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（徐寅鵬等， 2013）報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物10為對羥基苯甲醛。

化合物11 白色粉末（甲醇），分子式為C8H8O3，ESI-MS m/z： 175.1" ［M + Na］+。1H-NMR （500 MHz， CD3OD） δH： 9.74 （1H， s， -CHO）， 7.44 （1H， br s， H-2）， 7.43 （1H， d， J =7.8 Hz， H-6）， 6.94 （1H， d， J =7.8 Hz， H-5）， 3.92 （3H， s， 3-OCH3）; 13C-NMR （125 MHz， CD3OD） δC： 192.8 （-CHO）， 155.2 （C-4）， 149.8 （C-3）， 130.9 （C-1）， 128.0 （C-2）， 116.4 （C-5）， 111.3 （C-6）， 56.4 （3-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（陳根振等， 2022）報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物11為香草醛。

化合物12 白色粉末（甲醇），分子式為C8H10O2，ESI-MS m/z： 139.2" ［M + H］+。1H-NMR （500 MHz， CD3OD） δH： 7.15 （2H， d， J =8.5 Hz， H-3， 5）， 6.76 （2H， d， J =8.5Hz， H-2， 6）， 4.33 （2H， s， H-7）， 3.31 （3H， s， OCH3）; 13C-NMR （125 MHz， CD3OD） δC： 158.3 （C-1）， 130.8 （C-3， 5）， 130.0 （C-4）， 116.1 （C-2， 6）， 75.5 （C-7）， 57.8 （C-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（劉新橋等， 2011）報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物12為4-（甲氧基甲基）苯酚。

化合物13 白色結(jié)晶（氯仿），mp 136 ～ 140 ℃，分子式為C29H50O，ESI-MS m/z： 415.7" ［M + H］+。1H-NMR （500 MHz， CDCl3） δH： 3.55 （1H， tt， J=11.5， 4.8 Hz， H-3）， 5.37 （1H， m， H-6）， 1.03 （3H， s， H-19）， 0.94 （3H， d， J=6.6 Hz， H-21）， 0.86 （3H， t， J=7.5 Hz， H-29）， 0.85 （3H， d， J=6.8 Hz， H-27）， 0.82 （3H， d， J=6.8 Hz， H-26）， 0.71 （3H， s， H-18）; 13C-NMR （125 MHz， CDCl3） δC： 140.9 （C-5）， 121.9 （C-6）， 72.0 （C-3）， 56.9 （C-14）， 56.2 （C-17）， 50.3 （C-9）， 46.0 （C-24）， 42.5 （C-13）， 42.4 （C-4）， 39.9 （C-12）， 37.4 （C-1）， 36.7 （C-10）， 36.3 （C-20）， 34.1 （C-22）， 32.1 （C-8）， 32.0 （C-7）， 31.8 （C-2）， 29.3 （C-23）， 28.4 （C-16）， 26.6 （C-25）， 24.5 （C-15）， 23.2 （C-28）， 21.2 （C-11）， 20.0 （C-27）， 19.6 （C-19）， 19.2 （C-21）， 18.9 （C-26）， 12.1 （C-18）， 12.0 （C-29）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（徐寅鵬等， 2013）報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物13為β-谷甾醇。

化合物14 白色粉末（氯仿），分子式為C14H28O2，ESI-MS m/z： 229.4" ［M + H］+。1H-NMR （500 MHz， CDCl3） δH： 2.37 （2H， t， J =7.5 Hz， α-CH2）， 1.65 （2H， m， β-CH2）， 0.90 （3H， t， J =6.9Hz， 14-CH3）; 13C-NMR （125 MHz， CDCl3） δC： 179.4 （C-1）， 34.1 （C-2）， 32.1 （C-12）， 29.9 ～ 29.2 （C-4 ～ 11）， 24.8 （C-3）， 22.1 （C-13）， 14.3 （C-14）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（郭華等， 2018）報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物14為肉豆蔻酸。

化合物15 白色晶體（氯仿），mp 61 ～ 62.5 ℃，分子式為C16H32O2，ESI-MS m/z： 257.4" ［M + H］+。1H-NMR （500 MHz， CDCl3） δH： 2.37 （2H， t， J =7.5 Hz， H-2）， 1.65 （2H， m， H-3）， 1.25 （24H， m， 12×CH2， H-4 ～ 15）， 0.91 （3H， td， J =6.8， 4.7 Hz， H-16）; 13C-NMR （125 MHz， CDCl3） δC： 179.8 （C-1）， 34.2 （C-2）， 32.1 （C-3）， 29.9 ～ 29.2 （C-4 ～ 13）， 24.8 （C-14）， 22.8 （C-15）， 14.3 （C-16）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（郭華等， 2018）報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物15為棕櫚酸。

2.3 生物活性測試

對化合物1-6和化合物8-12進(jìn)行抗炎活性[HJ1.9mm]篩選，以抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7產(chǎn)生NO為模型，以槲皮素 ［IC50 =（9.32±0.36） μmol·L-1］為陽性對照。初篩時(shí)化合物濃度為100 μmol·L-1，對抑制率大于50%（圖3：A）的苯丙素類化合物1和化合物2進(jìn)行復(fù)篩，測得其IC50值分別為（37.76±2.68） μmol·L-1和（53.14±1.63） μmol·L-1。

用DPPH法對血葉蘭中分離得到的化合物1-12進(jìn)行抗氧化作用測試，以維生素C" ［IC50 =（6.01±0.17） μg·mL-1］為陽性對照。先對化合物進(jìn)行初篩，濃度為200 μg·mL-1，繼而對清除率大于50%（圖3：B）的化合物1和化合物2進(jìn)行復(fù)篩，測得其IC50值分別為（51.22±1.07） μg·mL-1和（79.22±7.44） μg·mL-1。用TEAC法對分離得到的化合物1-12進(jìn)行抗氧化作用測試，以trolox" ［IC50 =（34.65±0.53） μg·mL-1］為陽性對照。先對化合物進(jìn)行初篩，濃度為200 μg·mL-1，再對清除率大于50%（圖3：C）的化合物進(jìn)行復(fù)篩，并測定其IC50值。其結(jié)果表明，化合物7、化合物9和化合物12均具有清除ABTS·＋自由基的能力，其IC50值分別為（41.36±0.40） μg·mL-1、（56.23±3.39） μg·mL-1和（50.72±2.24） μg·mL-1；苯丙素類化合物1和化合物2則表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性，其IC50值分別為（2.21±0.01） μg·mL-1和（3.58±0.17） μg·mL-1?；衔?、化合物9和化合物12在DPPH法測試中未檢測到抗氧化能力，可能是由于不同檢測方法中化合物對不同的自由基清除力不同，因此有待進(jìn)一步用其他方法驗(yàn)證。

3 討論與結(jié)論

對血葉蘭的石油醚萃取相進(jìn)行GC-MS分析結(jié)果顯示其相對含量較高的化學(xué)成分為棕櫚酸甲酯（13.50%）、亞油酸甲酯（12.73%）、亞麻酸甲酯（8.74%）、2-單棕櫚酸甘油（5.28%），占相對含量的40.25%，均為脂肪酸類化合物。

從血葉蘭的乙酸乙酯萃取相中分離鑒定了15個(gè)化合物，分別是羅漢松脂素（1）、（+）-松脂素（2）、callyspongidipeptide A（3）、環(huán)- ［（S）-脯氨酸-（R）-亮氨酸］（4）、epi-boscialin（5）、對苯二甲酸二丁酯（6）、對香豆酸甲酯（7）、對羥基苯乙酮（8）、對羥基苯甲醇（9）、對羥基苯甲醛（10）、香草醛（11）、4-（甲氧基甲基）苯酚（12）、β-谷甾醇（13）、肉豆蔻酸（14）和棕櫚酸（15）， 均為首次從血葉蘭中分離得到。在抗炎活性方面，化合物1和化合物2具有較弱的抗炎活性，其IC50值分別為 （37.76±2.68）μmol·L-1和（53.14±1.63） μmol·L-1。

天然物質(zhì)的抗運(yùn)動(dòng)性疲勞活性的內(nèi)在機(jī)理主要包括抑制神經(jīng)遞質(zhì)的累積、增加機(jī)體能量物質(zhì)儲(chǔ)備、維持氧化還原穩(wěn)態(tài)、減少代謝物堆積等（倪冰倩等， 2023）。植物活性物質(zhì)的抗氧化與抗疲勞性具有相關(guān)性（薛勇闖等， 2020）。石鶴坤等（2016）研究表明血葉蘭的提取液具有較好的抗運(yùn)動(dòng)性疲勞活性，李秋靜等（2021）通過多酚含量測定、DPPH清除率測定等證明血葉蘭60%醇提液在體內(nèi)外具有明顯的抗氧化活性。本研究對分離得到的化合物進(jìn)行了抗氧化活性測試，其中化合物1、化合物2、化合物7、化合物9和化合物12均顯示具有一定的抗氧化活性，而這些化合物結(jié)構(gòu)上均屬于酚類化合物，進(jìn)一步明確了血葉蘭中的抗氧化活性成分，也為后續(xù)的深入研究提供了化學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在ABTS·＋清除活性測試中，化合物9和化合物12顯示出一定的抗氧化活性，通過構(gòu)效關(guān)系分析表明，化合物8-12結(jié)構(gòu)相似，但化合物9和化合物12具有對羥基苯乙基基團(tuán)。因此推測，對羥基苯乙基基團(tuán)可能是該類化合物的抗氧化活性基團(tuán)。

血葉蘭為血葉蘭屬（Ludisia）的旗艦物種，兼具觀賞和藥用價(jià)值，極具開發(fā)潛力。目前，對血葉蘭的研究主要集中在生物學(xué)性狀（李洪燕等， 2014）、物候（吳文碟等， 2019）、野生資源分布狀況（張澤宏等， 2014）、菌根研究（Poobathy et al.， 2019）以及栽培研究現(xiàn)狀（陳耀麗等， 2023）等。本研究從血葉蘭乙醇提取物的乙酸乙酯相中分離得到的化合物結(jié)構(gòu)多樣，包括甾體類、脂肪酸類、酚酸類、苯丙素類、環(huán)二肽類、萜類等，后續(xù)將繼續(xù)對血葉蘭中的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化并進(jìn)行相關(guān)生物活性測試，進(jìn)一步完善其在化學(xué)成分和生物活性方面的研究。

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（責(zé)任編輯 李 莉 王登惠）

基金項(xiàng)目：" 海南省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（322MS019）；財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-21）；2022年度海南省研究生創(chuàng)新科研課題（Qhys2022-118）。

第一作者： 沈穎（1998—），碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)，（E-mail） 21220953000027@hainanu.edu.cn。

*通信作者：" 馮雪萍，博士，講師，主要從事植物資源與利用研究，（E-mail） fxp@hainanu.edu.cn； 戴好富，博士，研究員，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究，（E-mail）daihaofu@itbb.org.cn。