玉米巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因SPINDLY的克隆及表達(dá)分析

摘 要：" SPINDLY（SPY）是植物中特有的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，其介導(dǎo)的O-巖藻糖基化修飾作用在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和調(diào)控植物生長發(fā)育等過程中發(fā)揮了重要作用。為探究玉米（Zea mays）巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因（ZmSPY）的功能，該研究采用生物信息學(xué)方法對ZmSPY蛋白的保守結(jié)構(gòu)域、氨基酸序列以及理化性質(zhì)等進(jìn)行分析，并從玉米根系組織中克隆該基因，構(gòu)建GFP融合蛋白表達(dá)載體，分析其蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位，同時通過外源激素處理分析ZmSPY對不同激素［赤霉素（GA）、吲哚乙酸（IAA）、6-氨芐基嘌呤（6BA）、脫落酸（ABA）］的應(yīng)答。結(jié)果表明：（1） ZmSPY蛋白歸屬于TPR和SPY超家族，主要由TPR結(jié)構(gòu)域以及催化結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。（2） SPYs高度保守，ZmSPY與高粱（Sorghum bicolor） SbSPY的序列同源性最高。（3） ZmSPY 編碼序列（coding sequence，CDS）區(qū)為2 736 bp，編碼911個氨基酸，所編碼蛋白為親水蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)域，二級、三級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主，并含有33個糖基化位點。（4） 亞細(xì)胞定位研究顯示，ZmSPY主要定位于細(xì)胞核。（5） ZmSPY表達(dá)水平受GA、IAA、6BA、ABA等外源激素信號調(diào)控，并呈現(xiàn)出不同程度的響應(yīng)。該研究結(jié)果為玉米SPY的功能探究提供了數(shù)據(jù)支撐，也為植物中O-巖藻糖基化修飾的相關(guān)研究提供了理論參考。

關(guān)鍵詞： 玉米， ZmSPY， 基因克隆， 亞細(xì)胞定位， 激素應(yīng)答

中圖分類號：" Q943"文獻(xiàn)標(biāo)識碼：" A

文章編號：" 1000-3142（2024）12-2255-10

Cloning and expression analysis of maize fucosyltransferase gene SPINDLY

LI Bowen， WANG Zhiqin， ZHU Xiaona， ZHU Zhenyu， GAO Xiaoxiao*

（ College of Biotechnology， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， Liaoning， China ）

Abstract：" SPINDLY （SPY） is a novel nucleocytoplasmic protein O-fucosyltransferase that regulates target protein activity or stability via O-fucosylation. Previous studies have indicated that the SPY protein regulates plant growth and development by modulating various intracellular processes in Arabidopsis thaliana. Its mediated O-fucosylation plays an important role in maintaining cell homeostasis and regulating plant growth and development， however protein O-fucosylation regulated by SPY in other plants largely remain unknown. Maize （Zea mays ） is one of the most important cereals crops for supplying foods， fibers， and fuels to humans. In order to explore the function of maize fucosyltransferase gene （ZmSPY）， this study first analyzed the conserved domain， amino acid sequence and physicochemical properties of ZmSPY protein by bioinformatics method， and cloned the gene from maize root tissue to construct the GFP fusion protein expression vector. The subcellular localization of ZmSPY was analyzed， and its response to different hormone treatments （GA， IAA， 6BA， ABA） was determined by exogenous hormone application. The results were as follows： （1） ZmSPY proteins belonged to the TPR and SPY superfamilies， and structural analysis demonstrated that ZmSPY had TPR （Tetratricopeptide repeat） and catalytic domains. （2） Phylogenetic analysis showed that SPYs were highly conserved， and ZmSPY exhibited strong homology to SPY in Sorghum bicolor. （3） Sequence analysis showed that the CDS region of ZmSPY was 2 736 bp. Physicochemical analysis indicated that ZmSPY， which contained 911 amino acids and 33 glycosylation sites， was hydrophilic and non-secretory. Its secondary and tertiary structures were largely composed of alpha helix and random coil. （4） The subcellular localization of ZmSPY was predominantly observed in the nucleus. （5） The expression of ZmSPY was induced by phytohormones including GA， IAA， 6BA and ABA， and exhibited various expression patterns. This study provides foundational information on SPY in maize， which contributes to further investigation of SPY and its effect on O-fucosylation in cereal plants.

Key words： maize， ZmSPY， gene cloning， subcellular localization， hormone response

蛋白質(zhì)糖基化修飾在動植物糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演著關(guān)鍵角色，對于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡以及生長發(fā)育調(diào)控至關(guān)重要。蛋白質(zhì)氧連糖基化（O-glycosylation）是糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵機(jī)制，其中O-巖藻糖基化修飾是蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯后糖基化修飾的主要部分之一，該環(huán)節(jié)主要表現(xiàn)在將巖藻糖殘基結(jié)合到N-聚糖、O-聚糖以及糖脂分子上（Park et al.， 2020）。在動物體內(nèi)，O-巖藻糖基化修飾普遍存在且具有特異性，已經(jīng)被證實與動物胚胎發(fā)育、細(xì)胞遷移、腫瘤生長、病灶轉(zhuǎn)移等重要生理活動密切相關(guān)（Ajima et al.， 2017; Chabanais et al.， 2018; Leng et al.， 2018）。植物中有關(guān)蛋白質(zhì)糖基化的工作開展相對較晚，目前僅在模式植物中報道較多。Aizezi等（2023）研究顯示，擬南芥中有兩種O-糖基化修飾，是由SPINDLY（SPY）及其同源蛋白SECRET AGENT（SEC）分別介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)蛋白的巖藻糖（O-fucose）和乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）糖基化修飾。SPY已被證實是一種作用于核質(zhì)蛋白的新型O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（protein O-fucosyltransferase），在植物的生長發(fā)育中起到關(guān)鍵作用。SPY為糖基轉(zhuǎn)移酶GT41家族成員（Cui et al.， 2014），盡管與人源N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶OGT高度同源，但與人源OGT功能存在差異。除植物以外，SPY同源蛋白還存在于原核生物、原生生物和藻類中，表明SPY所催化的蛋白發(fā)生O-巖藻糖基化修飾對于上述物種調(diào)控胞內(nèi)蛋白功能可能具有重要作用（Zhu et al.， 2022）。已有的研究顯示，SPY能夠通過參與植物響應(yīng)赤霉素、細(xì)胞分裂素等內(nèi)源激素信號及轉(zhuǎn)導(dǎo)過程來調(diào)節(jié)植物生長、發(fā)育和生殖等生理過程（Bi et al.， 2023），在植物的種子萌發(fā)（Liang et al.， 2018）、莖的生長（An et al.， 2012）、開花誘導(dǎo)（Tseng et al.， 2004）等過程中發(fā)揮著重要作用。SPY還參與調(diào)控植物光信號（Zentella et al.， 2017）、生物鐘與節(jié)律（Wang et al.， 2020; Xu et al.， 2022）、應(yīng)答生物與非生物脅迫（Qin et al.， 2011）等過程。此外，SPY突變體的多效性表型表明SPY可能在調(diào)節(jié)多種細(xì)胞途徑的關(guān)鍵蛋白中發(fā)揮作用（Steiner et al.， 2012）。

玉米（Zea mays）是禾本科玉蜀黍?qū)?年生草本植物，是世界上分布最廣泛的糧食作物之一，其不僅是我國畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等行業(yè)的重要飼料來源，而且還是食品、醫(yī)療衛(wèi)生和輕工業(yè)以及化工業(yè)等行業(yè)的重要原料（高文成等，2016；許青青等，2023）。目前，有關(guān)作物中蛋白糖基化的研究還鮮有報道。Xu等（2019）對小麥的研究顯示，O-GlcNAc信號能夠通過調(diào)控冬小麥VRNs加速春化作用，進(jìn)而促進(jìn)開花，揭示了O-GlcNAc對于作物開花，乃至結(jié)實的重要作用。當(dāng)前，尚未見有關(guān)作物蛋白O-巖藻糖基化修飾的報道。因此，本研究以玉米為研究對象，擬探討：（1）ZmSPY進(jìn)化關(guān)系、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征與理化性質(zhì)；（2）ZmSPY蛋白亞細(xì)胞定位特征；（3）ZmSPY對外源激素信號的應(yīng)答及其在激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的潛在功能。本研究結(jié)果將為禾本科植物中巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因ZmSPY的功能挖掘提供理論基礎(chǔ)，也為植物蛋白的O-巖藻糖基化修飾相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

B73玉米與本生煙草（Nicotiana tabacum）培養(yǎng)于大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院溫室；大腸桿菌（Escherichia coli） XL-10 Gold以及根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens） GV3101由本實驗室保藏；定位載體pBIGD-GFP為本實驗室構(gòu)建保藏；植物RNA提取試劑TRIzol、DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司；2×TransStart Top Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PrimeSTAR HS DNA Polymerase、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Ex Taq DNA Polymerase、限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、瓊脂糖凝膠、DNA回收試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；GA、ABA、IAA、6BA購自北京索萊寶科技有限公司；所需引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 ZmSPY生物信息學(xué)分析 使用DTU Health Tech網(wǎng)站中的TMHMM、SignalP、YinOYang-1.2功能來預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽、糖基化位點等；使用SOPMA網(wǎng)站預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；使用Phyre2在線網(wǎng)站預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)；使用Expasy-ProScale網(wǎng)站對蛋白質(zhì)進(jìn)行親疏水性預(yù)測分析；使用DNAMAN 8.0軟件對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對；使用MEGA 11.0軟件的ClustalW算法進(jìn)行序列比對，并以Maximum-Likelyhood法構(gòu)建多種植物間的系統(tǒng)進(jìn)化樹；使用Wolf Psort網(wǎng)站進(jìn)行亞細(xì)胞定位的預(yù)測。

1.2.2 ZmSPY基因的克隆和亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建 從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得玉米ZmSPY的核苷酸FASTA序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計目的基因克隆所需引物（表1），送至北京六合華大基因科技有限公司合成。利用TRIzol法提取玉米B73根系的總RNA，選取完整性較好和純度較高的RNA，通過Reverse Transcriptase M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以此為模板使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase和特異性引物擴(kuò)增ZmSPY基因編碼區(qū)全長片段，通過1%的瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物。

將目的片段膠塊切下，并回收純化，使用BamHⅠ和KpnⅠ兩種內(nèi)切酶同時酶切純化后的PCR產(chǎn)物與亞細(xì)胞定位所需的pBIGD-GFP載體，通過T4 DNA連接酶將ZmSPY片段與pBIGD-GFP載體按照3∶1的比例于16 ℃下過夜連接，連接完成后通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并將菌體涂布至LB-Kan抗性的平板上，挑取生長狀態(tài)較好的單菌落于LB-Kan液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)約4 h，待菌液渾濁后，以此為模板進(jìn)行菌落PCR鑒定，選擇陽性菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒pBIGD-ZmSPY-GFP，并進(jìn)行酶切鑒定，最后送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行全長測序。

1.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和煙草侵染 參照CaCl2法制備根瘤農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，將pBIGD-GFP（對照質(zhì)粒）與pBIGD-ZmSPY-GFP質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)驗證正確后保藏菌種備用。另取200 μL菌液接種于50 mL含Kan（50 mg·mL-1）、Gen（40 mg·mL-1）和Rif（20 mg·mL-1）LB液體培養(yǎng)基中，并加入10 mmol·L-1 MES和20 mmol·L-1乙酰丁香酮，在28 ℃和180 r·min-1條件下擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600在0.6左右，將菌體重懸于侵染緩沖液（5 g·L-1葡萄糖、50 mmol·L-1 MES、2 mmol·L-1 Na3PO4·12H2O，100 μmol·L-1 ACE）中，調(diào)菌液OD600在1.2左右，28 ℃孵育3 h，用注射器將侵染液注射至本生煙草葉片中，避光培養(yǎng)2～3 d，通過激光共聚焦顯微鏡觀察煙草表皮細(xì)胞，判斷ZmSPY蛋白的定位情況。

1.2.4 實時熒光定量PCR表達(dá)分析 通過RT-qPCR檢測ZmSPY表達(dá)量的變化，從而探究其對不同激素處理的響應(yīng)。分別于培養(yǎng)液中施加100 μmol·L-1的赤霉素（GA）、吲哚乙酸（IAA）、6-氨芐基嘌呤（6BA）、脫落酸（ABA），處理玉米B37根系3、6、12 h。提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并稀釋cDNA濃度至100 ng·uL-1左右，以此為模板，以ZmUBQ為內(nèi)參基因，使用實時熒光定量PCR檢測ZmSPY基因的表達(dá)量。反應(yīng)體系（20 μL）：TransStart Top Green qPCR Super Mix 10 μL，Primer F 0.4 μL，Primer R 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。按照反應(yīng)體系于冰上加樣至96孔板，每個基因檢測3組平行。實時熒光定量PCR設(shè)定程序如下：95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 20 s，退火50 ℃" 15 s，延伸72 ℃ 15 s，以上循環(huán)45次；72 ℃繼續(xù)延伸10 min。待程序運(yùn)行完成后，將目標(biāo)基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增所得的Ct值，代入公式2-△△Ct，計算得出基因的相對表達(dá)量，并進(jìn)行分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 所有指標(biāo)的檢測至少重復(fù)進(jìn)行3次，實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmSPY保守結(jié)構(gòu)域與氨基酸序列比對分析

通過NCBI網(wǎng)站的Conserved Domain Search Service （CD Search）模塊對ZmSPY蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，由圖1： A可知，ZmSPY歸屬于TPR和SPY超家族，主要由TPR（tetratricopeptide repeats）結(jié)構(gòu)域以及C端的催化結(jié)構(gòu)域（catalytic domain）構(gòu)成。之后，利用NCBI數(shù)據(jù)庫檢索獲得擬南芥（Arabidopsis thaliana， At）、高粱（Sorghum bicolor， Sb）、水稻（Oryza sativa， Os）、小麥（Triticum aestivum， Ta）等植物的SPY蛋白質(zhì)序列，并進(jìn)行多序列比對分析。由圖1： B可知，不同物種中SPY蛋白高度保守，不同物種間的序列差異主要集中于蛋白結(jié)構(gòu)的C末端附近。

2.2 ZmSPY蛋白質(zhì)進(jìn)化樹分析

為了探究SPY在不同物種之間的親緣關(guān)系及玉米ZmSPY的潛在生物學(xué)功能，使用MEGA11.0軟件構(gòu)建關(guān)于SPY蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖2可知，8個物種被分為兩大類，玉米、高粱、柳枝稷（Panicum virgatum）、小麥、水稻、擬南芥為一組；狗尾草（Setaria viridis）、小米（Setaria italica var. germanica）為一組。其中，玉米與同為禾本科植物的高粱屬同一支，說明氨基酸序列一致性最高，親緣關(guān)系最近；其次玉米與禾本科植物柳枝稷進(jìn)化關(guān)系密切。

2.3 ZmSPY蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

Expasy-ProtParam分析結(jié)果顯示，ZmSPY共由911個氨基酸組成，分子式為C4476H7040N1204O1351S54，相對分子質(zhì)量約為101.07 kD，理論等電點為5.62，正負(fù)電荷殘基總數(shù)分別為111和92，不穩(wěn)定系數(shù)為39.45（lt;40），脂溶性指數(shù)為87.85，總平均親水性為-0.20。分析蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)，可為蛋白功能研究提供基礎(chǔ)支撐（耿柳婷等，2023）。ZmSPY蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（圖3： A）顯示，ZmSPY蛋白由58.62%的α-螺旋、7.24%的延伸鏈、5.93%的β-轉(zhuǎn)角和28.21%的無規(guī)卷曲共同組成。ZmSPY蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（圖3： B）顯示，α-螺旋是ZmSPY蛋白的主要構(gòu)成元件。

Expasy-ProScale預(yù)測結(jié)果（圖4： A）顯示，ZmSPY蛋白屬于親水性蛋白，在氨基酸序列第334個位點處，親水性最高；在氨基酸序列第145個位點處，疏水性最高。TMHMM 2.0 Server預(yù)測結(jié)果顯示，ZmSPY蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。YinOYang 1.2 Server預(yù)測結(jié)果（圖4： B）顯示，ZmSPY蛋白共有33個糖基化位點。Wolf Psort預(yù)測ZmSPY蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，該蛋白可能定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中，并且定位于細(xì)胞核的可能性更大。

2.4 ZmSPY基因的克隆和亞細(xì)胞定位研究

蛋白質(zhì)的功能、代謝以及相互作用都與其亞細(xì)胞定位密切相關(guān)，成熟的蛋白質(zhì)只有運(yùn)輸至特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或區(qū)域才能發(fā)揮正確的生物學(xué)功能（Wang amp; Balint-Kurti， 2015）。Wolf Psort預(yù)測結(jié)果顯示，ZmSPY蛋白定位于細(xì)胞核的可能性更大。為了驗證此結(jié)果，通過GFP融合蛋白表達(dá)法來確定ZmSPY蛋白的亞細(xì)胞定位。通過克隆獲得ZmSPY基因編碼區(qū)全長片段（圖5： A），大小為2 736 bp。連接、轉(zhuǎn)化，挑取單菌落驗證及提質(zhì)粒酶切驗證，結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增片段、酶切片段的長度與目的片段大小一致（圖5： B、C），表明成功構(gòu)建了由農(nóng)桿菌（GV3103）介導(dǎo)的pBIGD-ZmSPY-GFP表達(dá)載體。通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化使其在煙草表皮細(xì)胞中瞬時表達(dá)，結(jié)果（圖6）顯示對照組（pBIGD-GFP）胞內(nèi)呈現(xiàn)分散非特異性的熒光信號，實驗組（pBIGD-ZmSPY-GFP）僅在細(xì)胞核上觀察到特異性的熒光信號，與細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色后呈現(xiàn)的藍(lán)色熒光信號重疊，表明ZmSPY蛋白定位于細(xì)胞核中。

2.5 外源激素處理對ZmSPY基因表達(dá)量的影響

為探究ZmSPY可能參與的生物學(xué)過程，我們采用不同外源激素處理玉米根系，通過RT-qPCR檢測ZmSPY表達(dá)量的變化，結(jié)果（圖7）顯示在受到不同外源激素（GA、IAA、6BA、ABA）處理后，ZmSPY表達(dá)水平隨處理時間的變化表現(xiàn)出不同的變化趨勢。在GA實驗組的處理下，ZmSPY表達(dá)量始終表現(xiàn)為下調(diào)趨勢，并且下調(diào)趨勢隨處理時間增長逐漸減弱。IAA、6BA實驗組變化趨勢一致，ZmSPY表達(dá)量整體呈現(xiàn)出隨處理時間的增長先下調(diào)后上調(diào)的趨勢。短時間（3 h）內(nèi)ZmSPY基因表達(dá)水平均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，其中受IAA處理的玉米根系中ZmSPY表達(dá)量下調(diào)幅度最為明顯，當(dāng)外源激素處理時間到達(dá)6 h及以上時，ZmSPY表達(dá)量轉(zhuǎn)為上調(diào)且上調(diào)趨勢逐漸升高。ABA實驗組與IAA、6BA實驗組變化趨勢類似，不同之處在于當(dāng)外源激素處理時間到達(dá)12 h時，ZmSPY表達(dá)量才轉(zhuǎn)為上調(diào)且上調(diào)趨勢不顯著。以上結(jié)果表明，ZmSPY能夠響應(yīng)GA、IAA、6BA、ABA多種外源激素信號，并且表現(xiàn)出不同的應(yīng)答模式。

3 討論

蛋白質(zhì)O-糖基化修飾是實現(xiàn)蛋白質(zhì)功能多樣化、動態(tài)調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號與細(xì)胞生理狀態(tài)的關(guān)鍵過程（Zhang et al.， 2019）。SPY同源蛋白廣泛存在于許多物種，包括原核生物、原生生物、藻類和所有植物，本研究針對玉米SPY的結(jié)構(gòu)和序列分析發(fā)現(xiàn)，ZmSPY蛋白C端的催化結(jié)構(gòu)域包含N端（N-Cat）和C端（C-Cat），二者均具有GT41亞家族成員典型的Rossmann式折疊，此種結(jié)構(gòu)能夠增強(qiáng)酶與蛋白質(zhì)底物結(jié)合的親和力（Kawai et al.， 2011）。C端催化結(jié)構(gòu)域是SPY行使O-巖藻糖基化修飾功能的關(guān)鍵區(qū)域，該處差異可能使其結(jié)合蛋白質(zhì)多樣化，并動態(tài)調(diào)節(jié)其信號整合和生理狀態(tài)。針對擬南芥SPY蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解析的研究顯示，SPY的N-末端無序肽含有反式自體巖藻糖基化位點（trans auto-fucosylation sites），能夠抑制其自身活性（Kumar et al.， 2023）?；赟PY序列與進(jìn)化的高度保守性，推測ZmSPY的N-末端無序肽也可能行使相似的生物學(xué)活性。此外，ZmSPY蛋白的TPR結(jié)構(gòu)域包含12個TPR重復(fù)序列，能夠在空間上形成一個狹長的超螺旋結(jié)構(gòu)。TPRs超螺旋內(nèi)壁上的一系列天冬氨酸負(fù)責(zé)結(jié)合底物蛋白，位于TPRs超螺旋中部的賴氨酸和絲氨酸參與，并決定SPY對蛋白質(zhì)底物的選擇性（Zhu et al.， 2022）。Kumar等（2023）對擬南芥SPY的研究顯示，其TPRs 1-5能夠通過干擾蛋白質(zhì)底物結(jié)合動態(tài)調(diào)節(jié)SPY的活性。同理，對于ZmSPY的TPRs結(jié)構(gòu)域的深入研究也將進(jìn)一步揭示玉米O-巖藻糖基化修飾的底物選擇特征。

盡管SPY與人源OGT擁有高度同源的序列結(jié)構(gòu)特征，但SPY被證實在植物中發(fā)揮新型核質(zhì)蛋白O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的功能，與OGT功能相異（Zhu et al.， 2022）。Vasudevan和Haltiwanger（2014）的研究顯示，大多數(shù)催化蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸殘基發(fā)生O-巖藻糖基化修飾，主要由定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)。在擬南芥中的研究結(jié)果顯示，SPY于核質(zhì)均可表達(dá)，并且主要存在于細(xì)胞核內(nèi)（Zentella et al.， 2023）。本文在玉米中的研究結(jié)果顯示，ZmSPY也主要定位于細(xì)胞核。類SPY（SPY-like）蛋白在組織器官水平豐富的表達(dá)，說明O-巖藻糖基化修飾應(yīng)是調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)功能廣泛的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式?，F(xiàn)有的研究結(jié)果顯示，植物O-巖藻糖基化修飾的蛋白主要包括轉(zhuǎn)錄因子、核蛋白、激酶，以及涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、新陳代謝等生理過程的關(guān)鍵蛋白（Mutanwad amp; Lucyshyn， 2022），這些蛋白大部分為核內(nèi)蛋白，暗示SPY介導(dǎo)O-巖藻糖基化修飾的區(qū)室化傾向。胞內(nèi)生理生化過程的區(qū)室化現(xiàn)象在植物體中廣泛存在，其可能對于提高產(chǎn)物穩(wěn)定性（Zhang amp; Fernie， 2021）、降低酶抑制效應(yīng)（Alam et al.， 2017），并防止不必要的催化串?dāng)_（Knudsen et al.， 2018）具有重要意義。因此，我們推測SPY的核內(nèi)定位可能有助于其識別且糖基化底物，從而穩(wěn)定有效地調(diào)控植物體O-巖藻糖基化修飾水平穩(wěn)定。

Jia和Yin（2017）的研究表明SPY在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮了重要作用。在擬南芥中，過表達(dá)SPY能夠抑制種子的萌發(fā)，以及莖的伸長，并造成開花延遲和雄性不育等，呈現(xiàn)出GA生物合成缺陷表型（Bi et al.， 2021）。在轉(zhuǎn)基因矮牽?；ㄖ?，外源施加GA能夠解除SPY異源表達(dá)對GA反應(yīng)的抑制（Izhaki et al.， 2010），進(jìn)一步說明SPY與GA激素信號之間的密切關(guān)聯(lián)。Sun等（2021）的研究結(jié)果顯示，GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)核心抑制因子DELLA受到SPY介導(dǎo)的O-巖藻糖基化修飾后形成活性更高的開放構(gòu)象，進(jìn)而促進(jìn)DELLA與生長相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，抑制植物生長發(fā)育。本研究實時熒光定量PCR的結(jié)果顯示，外源施加GA處理能夠降低ZmSPY的表達(dá)。此外，受到IAA、6BA和ABA處理后，玉米植株ZmSPY表達(dá)水平均隨時間延長呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的表達(dá)趨勢，暗示ZmSPY與這些植物激素可能存在復(fù)雜的交互關(guān)系，并且可能通過介導(dǎo)植物激素信號網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)過程參與玉米的生長發(fā)育與脅迫應(yīng)答，其內(nèi)在機(jī)制仍需更為深入詳細(xì)的研究。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛 王登惠）

基金項目：" 國家自然科學(xué)基金（32102493）。

第一作者： 李博文（1998—），碩士研究生，研究方向為植物生長調(diào)節(jié)因子的機(jī)制和應(yīng)用，（E-mail）1161432391@qq.com。

*通信作者：" 高瀟瀟，博士，講師，研究方向為植物次生代謝途徑調(diào)控，（E-mail）xxgao@dlpu.edu.cn。