油茶兩個響應(yīng)干旱NAC轉(zhuǎn)錄因子的克隆、亞細(xì)胞定位及自激活檢測

摘 要：" 干旱脅迫是影響油茶生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)的一類主要的非生物脅迫。NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)干旱、鹽堿等非生物脅迫反應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用。為探究NAC轉(zhuǎn)錄因子在油茶響應(yīng)干旱脅迫中的調(diào)控機制，該文以兩年生油茶苗為材料，通過TA克隆得到CoNAC5與CoNAC79的CDS序列，對其進行生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位及自激活分析，并采用qRT-PCR檢測CoNAC5與CoNAC79基因表達(dá)的組織特異性及PEG模擬干旱和ABA處理下的表達(dá)模式。結(jié)果表明：（1）基因結(jié)構(gòu)分析顯示，CoNAC5與CoNAC79的CDS長分別為1 044 bp和990 bp，分別編碼348個和330個氨基酸，理論等電點分別為8.86和8.57，蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)分別為41.35和37.47，均無跨膜結(jié)構(gòu)域，分別與柿子和荔枝的同源性最高。亞細(xì)胞定位顯示CoNAC5與CoNAC79的均定位在細(xì)胞核上。（2）酵母自激活檢測顯示，CoNAC5與CoNAC79的全長蛋白和N端結(jié)構(gòu)域無自激活活性，但C端結(jié)構(gòu)域均具有自激活活性。（3）CoNAC5與CoNAC79表達(dá)具有明顯的組織特異性，主要在根和種仁中高表達(dá)；PEG模擬干旱和外源施加ABA處理油茶苗發(fā)現(xiàn)，CoNAC5和CoNAC79表達(dá)量均顯著高于對照；CoNAC79的表達(dá)量在ABA處理48 h后下降，在PEG處理下顯著高于對照。綜上認(rèn)為，CoNAC5與CoNAC79其N端可能存在抑制區(qū)域，從而阻礙了全長序列的轉(zhuǎn)錄；油茶兩個NAC基因可能通過ABA合成途徑間接參與干旱脅迫響應(yīng)過程；在脅迫持續(xù)發(fā)生時，CoNAC79還可能通過其他途徑直接參與干旱脅迫響應(yīng)過程。該研究結(jié)果為進一步探究NAC轉(zhuǎn)錄因子在油茶響應(yīng)干旱脅迫過程中的作用提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 克隆，干旱脅迫，亞細(xì)胞定位，酵母自激活，ABA途徑

中圖分類號：" Q943"文獻標(biāo)識碼：" A

文章編號：" 1000-3142（2024）12-2242-13

Cloning， subcellular localization， and self-activation detection of two NAC transcription factors in response"to drought for Camellia oleifera

ZHAO Nahong1， CAO Ruilan1， SU Wenjuan1， XIE Huiqing1， ZENG Jin2， LIU Juan1*

（ 1. College of Forestry， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045， China; 2. School of Nuclear Technologyand Chemical Biology， Hubei University of Science and Technology， Xianning 437100， Hubei， China）

Abstract：" Drought stress is a major abiotic stress for the development， yield and quality of Camellia oleifera. NAC transcription factors play an important role in plant response to abiotic stresses such as drought and salinity. To explore the role of NAC transcription factors in the drought stress response of C. oleifera， two-year oil tea seedlings were used as materials. The CDS sequences of CoNAC5 and CoNAC79 were obtained from through TA cloning. Bioinformatics， subcellular localization and self-activation were performed. qRT-PCR was used to determine the tissue specificity of CoNAC5 and CoNAC79 gene expression and the expression PEG and ABA at different treatment time. The results were as follows： （1） Gene structure analysis showed that length of CoNAC5 and CoNAC79 were 1 044 bp and 990 bp， respectively， encoding 348 and 330 amino acids. Their theoretical isoelectric points were 8.86 and 8.57， respectively. The instability coefficients of the proteins were 41.35 and 37.47， respectively. No transmembrane domain was found between the two genes， the highest homology with persimmon and lychee， respectively. Subcellular localization showed that both CoNAC5 and CoNAC79 were located in the nucleus. （2） Yeast self-activation detection analysis revealed that CoNAC5 and CoNAC79 did not have self-activation activity in the full-length proteins and N-terminal domain. However， the C-terminal domain exhibited self-activation activity. （3） The expression of CoNAC5 and CoNAC79 had significant tissue specificity and mainly expressed in roots and kernels; when PEG simulated drought and exogenous ABA treated C. oleifera seedlings， the expression levels of CoNAC5 and CoNAC79 were significantly higher than the control; the expression level of CoNAC79 decreased after 48 h under ABA treatment， and significantly higher than the control under PEG treatment. In summary， it is believed that there may be an inhibitory region at the N-terminal of CoNAC5 and CoNAC79， which hinders the transcription of the full-length sequence; indicating that the two NAC genes in C. oleifera may be probably indirectly involved in drought stress response through pathway of ABA synthesis; CoNAC79 can also directly participate in the drought stress response through other" pathways. This study provided a scientific reference for further exploring the role of NAC transcription factors in the response of C. oleifera to drought stress.

Key words： cloning， drought stress， subcellular localization， yeast self-activation， ABA pathway

油茶（Camellia oleifera），隸屬于山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia L.），是我國特有的木本食用油料樹種。茶油單不飽和脂肪酸高達(dá)80%，具有很高的保健價值。油茶在我國已有2 000多年的栽培歷史，主要種植在我國長江流域及其以南的山地、丘陵地區(qū)（丁少凈等，2017）。干旱脅迫是影響植物生長發(fā)育的一類主要非生物脅迫。我國南方地區(qū)雖然降水量充沛，但是降水量在不同季節(jié)分配極度不均勻，5—6月多雨，8—10月常出現(xiàn)季節(jié)性高溫干旱天氣（何方，2011）。民間俗語“7月干球，8月干油”，指在每年陰歷7到9月是油茶果實膨大和種子油脂積累的關(guān)鍵時期，而此時油茶主產(chǎn)區(qū)常出現(xiàn)持續(xù)干旱高溫，導(dǎo)致油茶產(chǎn)量及出油率大幅降低（吳少強等，2022）。當(dāng)受到干旱脅迫時，植物會產(chǎn)生應(yīng)答機制來減弱或消除水分缺失造成的傷害，這一過程涉及多個基因、多種信號途徑及代謝產(chǎn)物，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控起承上啟下的作用（張幸媛等，2021）。

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，其啟動子區(qū)富含低溫、缺水、損傷等逆境響應(yīng)元件（Han et al.， 2015）。大量研究已證實，NAC轉(zhuǎn)錄因子參與植物對干旱、冷害、低氧等非生物脅迫響應(yīng)（Bu et al.， 2008）。例如，OsNAC2/OsNAC6基因的過表達(dá)植株顯著增強了水稻對干旱、鹽分以及稻瘟病的耐受力，其中干旱脅迫下過表達(dá)OsNAC9植株的籽粒產(chǎn)量可提高30%（Liu et al.， 2016）；Hu等（2018）發(fā)現(xiàn)水稻OsNAC1能顯著提高花期的抗旱性，過表達(dá)植株結(jié)實率提高22%～34%且育性提高17%～24%；Takasaki等（2010）通過對水稻干旱脅迫誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)OsNAC5在過表達(dá)水稻中上調(diào)表達(dá)，并通過上調(diào)脅迫誘導(dǎo)基因OsLEA3增強過表達(dá)植株的抗旱性。眾多研究表明，脫落酸ABA作為一種植物脅迫激素，是植物應(yīng)對干旱脅迫響應(yīng)并及時優(yōu)化水分利用效率的重要調(diào)控因子（Huang et al.， 2016），而NAC轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是ABA信號途徑中的重要轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控因子（Wang et al.， 2016）。例如，Chen等（2014）發(fā)現(xiàn)過表達(dá)水稻OsNAC可通過ABA介導(dǎo)的氣孔關(guān)閉以降低葉片失水率，顯著提高水稻抗旱性；Shang等（2020）發(fā)現(xiàn)GhirNAC2通過調(diào)控GhNCED3a/3c的表達(dá)，控制ABA的生物合成和氣孔關(guān)閉，從而在棉花抗旱性中發(fā)揮積極作用。

課題組前期基于二倍體油茶基因組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)手段分析鑒定了油茶NAC基因家族成員并對部分成員開展干旱脅迫下表達(dá)模式分析（曹瑞蘭等，2021）。進一步對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)ATNAC3亞組的CoNAC5、CoNAC79在干旱脅迫下表達(dá)量均上調(diào)，而系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)同組的擬南芥AtNAC019、AtNAC055、AtNAC072基因，被證實參與逆境脅迫過程（Tran et al.， 2004; Jiang et al.， 2009），因此推測CoNAC5、CoNAC79可能參與油茶干旱脅迫調(diào)控過程，但是其轉(zhuǎn)錄活性和調(diào)控機制尚不清楚。本研究采用TA克隆獲得CoNAC5和CoNAC79的CDS序列，通過生物信息學(xué)、亞細(xì)胞定位、酵母自激活和熒光定量PCR分析，擬探討以下問題：（1）兩個油茶NAC基因的結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系及其亞細(xì)胞定位；（2）自激活活性及其具體的激活區(qū)域；（3）兩個油茶NAC基因在不同組織和干旱脅迫下表達(dá)模式差異及其可能參與干旱響應(yīng)的信號途徑。本研究旨在為深入探究油茶響應(yīng)干旱脅迫分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供參考，為油茶抗逆分子育種計劃提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、生長條件以及脅迫處理

選取長勢一致的兩年生“長林18”油茶嫁接苗為試驗材料，在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院校內(nèi)實踐基地（28°46′ N、115°55′ E）溫室大棚開展盆栽試驗。采用水培法，將油茶根部浸潤在30%聚乙二醇（PEG6000）溶液中模擬干旱；ABA處理則采用葉面噴施法，在油茶葉面噴灑濃度為200 ng·mL-1的ABA溶液。于12、24、36、48 h采集各處理和對照的嫩葉，每個處理設(shè)置3次重復(fù)。采集根、莖、葉、花、幼果、種仁各部位材料，置于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 CoNAC5和CoNAC79基因的克隆

基于油茶全基因組數(shù)據(jù)（https：//github.com/Hengfu-Yin/CON_genome_data），獲得CoNAC5、CoNAC79基因序列，利用SnapGene軟件進行基因特異性引物設(shè)計（表1）?？俁NA采用TastPureUniversal Plant Total RNA Isolation Kit Vazyme Cat（RC411-01，諾唯贊）試劑盒提取，方法按照說明書。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，Eppendorf μCuvette G1.0核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度。使用HiScriPT lll All-in-one RT-SuperMix Perfect for qPCR（R333，諾唯贊）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按說明書描述的方法操作。以獲得的cDNA為模板，KL-CoNAC5-F/R與KL-CoNAC79-F/R為引物（表1），利用Ex PremierTM DNA Polymerase Dye plus（TaKaRa，大連）高保真酶，進行PCR擴增。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，59～62 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保溫。將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶回收純化后將其連接至pMD19-T克隆載體，并轉(zhuǎn)大腸桿菌DH5α中，PCR檢測出陽性克隆，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序并比對測序結(jié)果，保菌并使用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit（EM101-01，全式金）質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。

1.3 CoNAC5和CoNAC79基因的生物信息學(xué)分析

利用Expasy-ProtParam對測序正確的CoNAC5與CoNAC79基因編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)進行在線分析，利用DNAMAN軟件將油茶CoNAC5與陸地棉（Gossypium hirsutum，XP_016732489.2）、君遷子（Diospyros lotus，XP_052206324.1）、柿子（Diospyros kaki，AZL_19402.1）、胡桃（Juglans regia，XP_018851445.1）等序列，CoNAC79與荔枝（Litchi chinensis，UKF_18671.1）、獼猴桃（Actinidia chinensis，QQG_64095.1）、柑橘（Citrus reticulata，AYC_35383.1）、馬鈴薯（Solanum tuberosum，ATD_50216.1）等序列進行比對，并利用TBtools軟件構(gòu)建進化樹和保守基序。

1.4 EGFP-CoNAC5和EGFP-CoNAC79的載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

使用SnapGene軟件設(shè)計同源重組引物CZ-ECoNAC5-F/R和CZ-ECoNAC79-F/R（表1），以油茶cDNA為模板進行擴增，利用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（C115，諾唯贊）同源重組酶，構(gòu)建EGFP-CoNAC5與EGFP-CoNAC79植物表達(dá)載體。提取含有增強綠色熒光蛋白EGFP的植物表達(dá)載體質(zhì)粒，在37 ℃下kpn I酶切1 h，純化后使用同源重組酶，50 ℃下連接15 min，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，并涂布在含有卡納抗性和氨芐抗性的LB培養(yǎng)基上。挑選單菌落進行PCR驗證，將陽性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序，比對測序結(jié)果并保菌。對含有EGFP-CoNAC5與EGFP-CoNAC79載體的大腸桿菌提取質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到GV3101農(nóng)桿菌中，將農(nóng)桿菌注射到健康生長的煙草葉片中，培養(yǎng)2 d，用激光共聚焦顯微鏡（FV3000，Olympus）觀察EGFP在煙草細(xì)胞中的分布情況。

1.5 pGBKT7-CoNAC5和pGBKT7-CoNAC79的載體構(gòu)建[BT）]

使用CZ-BDCoNAC5-F/R和CZ-BDCoNAC79-F/R引物（表1），以油茶cDNA為模板，構(gòu)建pGBKT7-CoNAC5與pGBKT7-CoNAC79載體。提取pGBKT7載體質(zhì)粒，在37 ℃下使用EcoR I和BamH I雙酶切1 h，純化后使用同源重組酶在50 ℃下連接15 min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，并涂布在含有卡納霉素的新鮮LB固體培養(yǎng)基上，對單菌落進行PCR檢驗并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，比對測序結(jié)果并保菌。

1.6 酵母的轉(zhuǎn)化及酵母自激活活性分析

使用質(zhì)粒提取試劑盒，從測序正確的大腸桿菌中提取pGBKT7-CoNAC5和pGBKT7-CoNAC79質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGoId酵母菌株中，涂布在SD/-Leu-Trp固體培養(yǎng)基上，并放置于28 ℃培養(yǎng)箱2～3 d，以pGADT7為陰性對照，以pGADT7-T和pGBKT-P53為陽性對照，PCR檢測陽性單菌落后保存pGBKT7-CoNAC5和pGBKT7-CoNAC79酵母菌株。

挑取成功轉(zhuǎn)化的pGBKT7-CoNAC5和pGBKT7-CoNAC79酵母單克隆菌株，稀釋重懸，將菌液濃度OD600調(diào)整到0.02、0.002和0.000 2，吸取5 μL濃度梯度點涂于SD/-Leu-Trp和SD/-Leu-Trp-His-Ade酵母培養(yǎng)基上，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察誘餌菌株的生長狀況。

1.7 CoNAC5和CoNAC79結(jié)構(gòu)域的酵母自激活分析

CoNAC5和CoNAC79是典型的ATNAC3-NAC轉(zhuǎn)錄因子，在N端均含有一段保守結(jié)構(gòu)域且在C端具有轉(zhuǎn)錄激活活性。本研究以位于CoNAC5和CoNAC79 N端1～417 bp構(gòu)建pGBKT7-N載體，以417～1 044 bp、417～990 bp構(gòu)建C端pGBKT7-C載體，并分別轉(zhuǎn)到Y(jié)2H酵母菌中進行篩選和檢測。挑取轉(zhuǎn)化成功的pGBKT7-CoNAC5-N和pGBKT7-CoNAC5-C以及pGBKT7-CoNAC79-N和pGBKT7-CoNAC79-C酵母單菌落，稀釋重懸，調(diào)整菌液濃度并點涂觀察。

1.8 qRT-PCR引物設(shè)計及其驗證

通過SnapGene軟件設(shè)計qPCR引物DL-CoNAC5-F/R與DL-CoNAC79-F/R，內(nèi)參為EF-1α-F/R（表1）。采用25 μL反應(yīng)體系：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q711-02，諾唯贊） 12.5 μL，cDNA模板2.5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各1.5 μL，ddH2O 7 μL。熒光定量儀反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，40個循環(huán)；95 ℃ 5 s；65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s。每個樣品進行3次生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)完成后，用2-ΔΔCt對CoNAC5和CoNAC79基因的表達(dá)量進行計算。

1.9 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0軟件的Duncan法進行顯著性分析，用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1" CoNAC5和CoNAC79基因的克隆

提取油茶葉片總RNA，純化后獲得mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板擴增CoNAC5和CoNAC79序列，得到約1 000 bp的擴增產(chǎn)物（圖1），切膠回收。將純化后的片段連接至pMD19-T載體上，挑取陽性克隆搖菌，將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果比對得出CoNAC5和CoNAC79序列長度為1 044 bp和990 bp，片段長度與PCR擴增反應(yīng)結(jié)果（圖1）相符。

2.2 CoNAC5和CoNAC79基因的生物信息學(xué)分析

通過在線分析網(wǎng)站Expasy-ProtParam分析CoNAC5和CoNAC79蛋白的理化性質(zhì)。CoNAC5編碼氨基酸數(shù)量348，相對分子量為39 114.92 Da，理論等電點為8.86，呈堿性；帶正負(fù)電殘基的數(shù)量分別為35和40，分子式為C1743H2673N483O525S10，蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為41.35，為不穩(wěn)定蛋白；脂溶性指數(shù)為65.29，平均親水系數(shù)為-0.617，為親水性蛋白。CoNAC79編碼氨基酸數(shù)量330，相對分子量37 198.71 Da，理論等電點為8.57，呈堿性；帶正負(fù)電殘基的數(shù)量分別為34和37，分子式為C1670H2535N453O499S8，蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為37.47，為穩(wěn)定性蛋白；脂溶性指數(shù)為62.72，平均親水系數(shù)為-0.605，為親水性蛋白。

2.2.1 CoNAC5和CoNAC79的系統(tǒng)發(fā)育進化樹、保守基序分析 將CoNAC5和CoNAC79氨基酸序列與多個同源氨基酸構(gòu)建進化樹，發(fā)現(xiàn)其分別與柿子和荔枝聚在同一分支，同源性比較高。CoNAC5和CoNAC79都具有保守基序，通過SnapGene軟件構(gòu)建進化樹和保守基序（圖2）。

2.2.2 CoNAC5和CoNAC79同源序列比對 通過MEGA 7.0軟件，選用鄰接法，對CoNAC5和CoNAC79的同源氨基酸序列進行多序列比對，運用BLASTp程序搜索油茶CoNAC5和CoNAC79氨基酸序列的同源序列，發(fā)現(xiàn)與CoNAC5相似度最高的分別為柿子（Diospyros kaki，AZL_19402.1），其次為君遷子（D. lotus，XP_052206324.1）和陸地棉（Gossypium hirsutum，XP_016732489.2），相似度分別達(dá)82.48%、79.53%和78.75%；與CoNAC79相似度最高的為荔枝（Litchi chinensis，UKF_18671.1 ），其次為獼猴桃（Actinidia chinensis，QQG_64095.1）和柑橘（Citrus reticulata，AYC_35383.1），相似度分別達(dá)84.22%、80.46%和80.29%（圖3）。

2.3 CoNAC5和CoNAC79基因的亞細(xì)胞定位

構(gòu)建EGFP-CoNAC5和EGFP-CoNAC79表達(dá)載體，以35S-EGFP-CoNAC5和35S-EGFP-CoNAC79為核定位標(biāo)記，并將其注射到煙草原生質(zhì)體中。結(jié)果在煙草原生質(zhì)質(zhì)體的細(xì)胞核中檢測到綠色熒光，其在相同位置與核定位標(biāo)記共表達(dá)，證明CoNAC5與CoNAC79蛋白均定位在細(xì)胞核中（圖4）。

2.4 CoNAC5和CoNAC79基因的自激活活性測定

NAC轉(zhuǎn)錄因子含有保守的N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C端激活結(jié)構(gòu)域。將CoNAC5和CoNAC79的CDS序列分別克隆到PGBKT-7載體中，并轉(zhuǎn)化到Y(jié)2H酵母菌中，陽性對照分別為pGADT7-T、pGBKT7-P53，AD與BD空載轉(zhuǎn)入酵母菌作為陰性對照，所有這些酵母菌在SD/-Leu-TrP培養(yǎng)基上生長良好，但只有陽性對照在SD/-Leu-Trp-His-Ade生長良好（圖5）。

2.5 CoNAC5和CoNAC79結(jié)構(gòu)域自激活分析

含有pGBKT7-CoNAC5-N和pGBKT7-CoNAC5-C以及pGBKT7-CoNAC79-N和pGBKT7-CoNAC79-C載體質(zhì)粒的酵母菌在SD/-Lue-Trp均能正常生長，但含有pGBKT7-CoNAC5-N和pGBKT7-CoNAC79-N載體質(zhì)粒的酵母菌在SD/-Leu-Trp-His-Ade無法正常生長，說明CoNAC5與CoNAC79的N端不存在轉(zhuǎn)錄激活活性；含有pGBKT7-CoNAC5-C與pGBKT7-CoNAC79-C載體質(zhì)粒的酵母菌在SD/-Leu-Trp-His-Ade可以正常生長，說明CoNAC5和CoNAC79的C端存在轉(zhuǎn)錄激活活性（圖6）。

2.6 CoNAC5和CoNAC79基因的表達(dá)模式分析

對不同組織表達(dá)特異性分析發(fā)現(xiàn)，CoNAC5和CoNAC79在油茶根、莖、葉、花、幼果和種仁6個組織中都有表達(dá)，其中均在根和種仁中表達(dá)較高，在花中表達(dá)最低（圖7）。CoNAC5在根中的表達(dá)量是花的111倍，是莖的90倍，是葉的28倍，是幼果的14倍，是種仁的1.2倍。CoNAC79在種仁中的表達(dá)量是花的580倍，是莖的480倍，是葉的81倍，是幼果的70倍，是根的5倍。

在PEG模擬干旱脅迫中，不同時間段下CoNAC5和CoNAC79的表達(dá)與對照相比，均存在顯著差異（圖8）。PEG處理36 h，CoNAC5的表達(dá)量是對照的76倍，48 h時依然呈現(xiàn)高表達(dá)，為對照的12倍。PEG處理36 h，CoNAC79的表達(dá)量是對照的180倍，48 h時為對照的6.8倍（圖8）。在ABA處理下，CoNAC5和CoNAC79的表達(dá)在24 h出現(xiàn)顯著上調(diào)，分別為對照的1.4倍和1.7倍。ABA處理36 h時，兩者的表達(dá)量均呈現(xiàn)高表達(dá)，分別為對照的11倍和12倍。48 h時，與對照相比，CoNAC5的表達(dá)量增長幅度下降，為對照的3.3倍，而CoNAC79的表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)趨勢，只有對照的85%，但兩者沒有顯著差異。

3 討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子，也是植物中數(shù)量最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一（Chen et al.， 2022）。NAC轉(zhuǎn)錄因子不僅參與調(diào)控植物生長發(fā)育過程，而且在響應(yīng)逆境脅迫中扮演著重要角色（Sun et al.， 2020）。本研究克隆油茶NAC轉(zhuǎn)錄因子CoNAC5與CoNAC79，屬于ATNAC3亞組，分別與柿子和荔枝的同源性最高且N端均具有NAC轉(zhuǎn)錄因子特有的NAM結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明CoNAC5與CoNAC79蛋白均定位在細(xì)胞核上，屬于核蛋白，表明CoNAC5與CoNAC79作為轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控細(xì)胞核中靶基因的轉(zhuǎn)錄過程，符合轉(zhuǎn)錄因子的特征。

研究發(fā)現(xiàn)NAC蛋白常通過與其他蛋白互作的形式來參與非生物脅迫（Hao et al.， 2011）。確定不同蛋白間相互作用常采用酵母雙雜技術(shù)，其中為降低酵母雙雜篩選時的假陽性概率，首先要確定誘餌蛋白本身是否具有轉(zhuǎn)錄激活功能。若誘餌蛋白具有轉(zhuǎn)錄活性，就能單獨激活下游啟動子調(diào)節(jié)的報告基因，從而造成假陽性。本研究發(fā)現(xiàn)CoNAC5與CoNAC79兩個蛋白沒有轉(zhuǎn)錄激活能力，進一步比較C端和N端結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)這兩個蛋白的C端都含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，而N端沒有激活活性。這可能是由于CoNAC5與CoNAC79蛋白的N端存在轉(zhuǎn)錄激活的抑制區(qū)域，從而干擾了C端激活域及其全長蛋白的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。Hao等（2010）研究大豆的3個NAC基因的轉(zhuǎn)錄激活能力，發(fā)現(xiàn)在N端存在NARD抑制結(jié)構(gòu)域，封閉了其C端激活域的作用。眾多研究也進一步證實，轉(zhuǎn)錄因子NAC蛋白轉(zhuǎn)錄激活能力可能取決于N端的抑制區(qū)域與C端激活結(jié)構(gòu)域的相互作用（Narberhaus et al.， 1995; Huang et al.， 2011）。此外，在G-box、MYB、HRT和ERF等轉(zhuǎn)錄因子中也發(fā)現(xiàn)了對全長序列自激活活性具有抑制作用的抑制結(jié)構(gòu)域（Liu et al.， 1997; Raventos et al.， 1998; Jin et al.， 2000; Ohta et al.， 2001）。這些轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)可能通過與啟動子結(jié)合而阻止其他轉(zhuǎn)錄因子與該啟動子結(jié)合，或與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而抑制其他因子的作用。如Hao等（2010）的研究進一步證實大豆的NAC基因N端抑制結(jié)構(gòu)域可以阻礙WRKY、Dof等其他轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄。因此，油茶CoNAC5與CoNAC79蛋白可能通過其N端抑制區(qū)域與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用或與順式作用元件結(jié)合，從而影響下游功能基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。此外，油茶CoNAC5與CoNAC79全長序列不存在轉(zhuǎn)錄自激活活性，未來可以利用酵母雙雜文庫構(gòu)建和篩選可能的互作蛋白，深入探究油茶兩個NAC基因的功能。

植物受到逆境脅迫時，常通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)激素含量，誘導(dǎo)一系列抗逆相關(guān)的基因表達(dá)來提高抗性（Mao et al.， 2016）。ABA作為觸發(fā)植物對逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)的傳遞體，在調(diào)節(jié)植物抗逆性方面發(fā)揮著重要作用（Aslam et al.， 2021）。研究發(fā)現(xiàn)NAC轉(zhuǎn)錄因子可能通過與ABA響應(yīng)元件結(jié)合來參與干旱脅迫響應(yīng)（Fujita et al.， 2004; Wang et al.， 2021）。Jensen等（2010）研究發(fā)現(xiàn)AtNAC019（AtNAC3亞組）是ABA應(yīng)答的正調(diào)控因子，過表達(dá)AtNAC019顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株對外源ABA敏感性。Yu等（2021）發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)云杉PwNAC11（與AtNAC019近緣）的轉(zhuǎn)基因擬南芥對外源ABA具有高敏感性，進一步發(fā)現(xiàn)該基因能通過與ABA響應(yīng)元件（ABREs）結(jié)合來激活下游ERD1基因表達(dá)，從而提高植株對干旱脅迫的耐受性。在本研究中，CoNAC5與CoNAC79基因在系統(tǒng)發(fā)育進化樹中屬于AtNAC3亞組，與AtNAC019為同源基因。PEG模擬干旱脅迫處理在36 h和外源施加ABA處理油茶24 h時，均顯著誘導(dǎo)了CoNAC5與CoNAC79基因的高表達(dá)且兩個NAC基因在外源施加ABA處理下更早啟動高表達(dá)，說明這兩個NAC基因可能通過參與ABA信號途徑參與干旱脅迫過程。此外，隨著處理時間的增加，不同處理下兩個NAC基因表達(dá)模式存在差異。CoNAC5的表達(dá)量在PEG和ABA處理下在36 h和48 h時均顯著高于對照；CoNAC79的表達(dá)量在PEG處理36 h和48 h以及ABA處理36 h，均顯著高于對照，但是在ABA處理48 h時與對照無顯著差異。這可能是由于在脅迫的不同階段，NAC基因也可能通過非ABA合成依賴的方式直接參與干旱脅迫響應(yīng)過程。在云杉的NAC研究中，PwNAC11也可以通過直接與ABA非依賴的DREB2A基因相互作用，從而激活下游ERD1基因表達(dá)，直接參與干旱脅迫響應(yīng)（Yu et al. 2021）。由此推測，兩個油茶NAC基因參與干旱脅迫的調(diào)控途徑可能存在差異。CoNAC5可能主要通過參與ABA合成的方式間接響應(yīng)干旱脅迫，而CoNAC79可能存在參與ABA合成間接或非依賴ABA合成直接參與干旱脅迫響應(yīng)過程，但是具體調(diào)控機制尚不清楚。

4 結(jié)論

本研究從油茶cDNA中成功克隆了CoNAC5與CoNAC79基因，亞細(xì)胞定位證實兩個蛋白均定位于細(xì)胞核上，為典型的核蛋白。酵母雜交實驗發(fā)現(xiàn)兩個蛋白的N端不具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，而C端均具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，這可能是由于N端存在阻礙全長序列下兩個NAC基因轉(zhuǎn)錄激活的抑制區(qū)段。熒光定量PCR結(jié)果證實CoNAC5與CoNAC79在干旱脅迫下和ABA處理下高表達(dá)，但是隨著處理時間的持續(xù)，不同處理下的基因表達(dá)趨勢存在差異，推測CoNAC5可能通過參與ABA合成途徑間接參與干旱脅迫響應(yīng)，而CoNAC79可以通過ABA合成的方式間接或非ABA依賴途徑的方式直接調(diào)控干旱響應(yīng)過程，但是具體調(diào)控機制尚不清楚，后續(xù)可從酵母雙雜文庫篩選互作蛋白、過表達(dá)或基因敲除等方式進一步研究其功能。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）

基金項目：" 江西省自然科學(xué)基金（20232BAB205054）； 江西省林業(yè)局油茶研究專項（YCYJZX ［2023］114號）； 湖北科技學(xué)院科研啟動金（BK202328）。

第一作者： 趙娜紅（1997—），碩士，研究方向為油茶抗旱分子機制，（E-mail）zhaonahong2021@163.com。

*通信作者：" 劉娟，博士，副教授，研究方向為林木遺傳改良、林木抗逆分子機制，（E-mail） liu_juan1122@163.com。