金萱炒青綠茶中揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體分析方法的優(yōu)化及應(yīng)用

摘要：為探究揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體在炒青綠茶干燥過程中的變化規(guī)律，以金萱炒青綠茶為研究對(duì)象，優(yōu)化了基于頂空固相微萃取-對(duì)映選擇性-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Headspace solid phase microextraction-enantioselective-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-Es-GC-MS）分析揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體的方法，對(duì)120 ℃不同干燥時(shí)間（30、60、90 min和120 min）處理的4個(gè)炒青綠茶樣品進(jìn)行了對(duì)映異構(gòu)體定性定量分析和化學(xué)計(jì)量學(xué)分析。結(jié)果顯示，HS-SPME的最佳條件為添加NaCl（3 mL，3 mol·L-1，料液體積比為1︰6）、萃取溫度60 ℃、萃取時(shí)間25 min。Es-GC-MS的最佳升溫程序?yàn)槌跏紲囟?5 ℃，保持2 min；以4 ℃·min-1升溫至110 ℃，保持10 min；以4 ℃·min-1升溫至210 ℃。采用優(yōu)化方法分析4個(gè)炒青綠茶樣品，共檢出8種對(duì)映異構(gòu)體，且種類不隨干燥時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生改變，其中R-（-）-芳樟醇、S-（+）-芳樟醇含量隨干燥進(jìn)程增加，其余6種對(duì)映異構(gòu)體含量在超過60 min或90 min時(shí)開始下降。層次聚類分析和偏最小二乘法判別分析結(jié)果顯示，不同干燥時(shí)間樣品被明顯分成4組，根據(jù)變量投影重要性（Variable importance in projection，VIP）＞1和差異顯著性分析篩選出4種差異對(duì)映異構(gòu)體，按VIP值從大到小分別為R-（-）-芳樟醇、（2R，5S）-茶螺烷B、（2R，5R）-茶螺烷A、S-（+）-芳樟醇。本研究可為炒青綠茶干燥過程中香氣品質(zhì)的提升及干燥工藝選擇提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：炒青綠茶；頂空固相微萃??；對(duì)映選擇性-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；揮發(fā)性成分；對(duì)映異構(gòu)體

中圖分類號(hào)：S571.1；TS272.7 " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A " " " " " " " " " " " " 文章編號(hào)：1000-369X（2024）06-973-12

Optimization and Application of Analysis Method for Volatile Enantiomers in ‘Jinxuan’ Roasted Green Tea

ZHANG Shuyi1， MA Chengying2， CHEN Wei2， MIAO Aiqing2， QIAO Xiaoyan2，

LIN Dongchun2， XIA Hongling2*， XU Jingyi1*

1. College of Horticulture， Sichuan Agricultural University， Tea Refining and Innovation Key Laboratory of Sichuan Province， Chengdu 611130， China; 2. Tea Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangdong Key Laboratory of Tea Plant Resources Innovation and Utilization， Guangzhou 510640， China

Abstract： To investigate the changes in volatile enantiomers during the drying of ‘Jinxuan’ roasted green tea， an optimized method using headspace solid-phase microextraction-enantioselective-gas chromatography-mass spectrometry （HS-SPME-Es-GC-MS） was applied for qualitative and quantitative enantiomer analysis. The chemometric evaluation was also performed on four roasted green tea samples dried at 120 ℃ for different durations （30 min， 60 min， 90 min and 120 min）. The optimal HS-SPME conditions were found to be： addition of NaCl （3 mL， 3 mol·L-1， solid-to-liquid ratio of 1∶6， extraction temperature of 60 ℃， and extraction time of 25 min. The optimal temperature program for Es-GC-MS was as follows： initial temperature at 35 ℃ held for 2 min， then ramped up to 110 ℃ at 4 ℃ min-1 and held for 10 min， followed by a further increase to 210 ℃ at 4 ℃ min-1. Using an optimized method to analyze four ‘Jinxuan’ roasted green tea samples， a total of 8 enantiomers were detected， with no change in the types as drying time increased. Among them， the contents of R-（-）-linalool and S-（+）-linalool increased with the drying process， while the contents of the other 6 enantiomers began to decline after 60 min or 90 min. Hierarchical cluster analysis and partial least squares discrimination analysis show that the samples with different drying times were obviously classified into four groups. Based on variable importance in projection （VIP） gt;1 and significance analysis， four different enantiomers were screened， and their VIP values were ranked in descending order as R-（-）-linalool， （2R，5S）-theaspirane B， （2R，5R）-theaspirane A， and S-（+）-linalool. This study provided a reference for improving aroma quality and selecting drying processes during the roasting of green tea.

Keywords： roasted green tea， HS-SPME， Es-GC-MS， volatile components， enantiomers

綠茶發(fā)展歷史悠久，品質(zhì)獨(dú)特，保健功效突出[1-2]，在我國(guó)一直深受消費(fèi)者喜愛，產(chǎn)量和銷量位居六大茶類之首[3]。根據(jù)殺青和干燥方式，綠茶分為蒸青、炒青、烘青和曬青4種類型，其中炒青綠茶是我國(guó)市場(chǎng)消費(fèi)的主要綠茶品類[4]。因茶樹品種、加工工藝等條件的不同，炒青綠茶具有多種香型[3，5-6]，栗香是炒青綠茶的優(yōu)質(zhì)香型之一。栗香的關(guān)鍵揮發(fā)性成分包括3-甲基丁醛、（E）-3-戊醇烯-2-酮、芳樟醇、檸檬烯、芳樟氧化物、壬醛、萜品醇、α-紫羅蘭酮等[7-9]，其中芳樟醇、檸檬烯、芳樟醇氧化物、萜品醇和α-紫羅蘭酮等的分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)或多個(gè)手性碳原子，形成了一對(duì)或多對(duì)對(duì)映異構(gòu)體。對(duì)映異構(gòu)體的氣味特征通常存在差異，如S-（+）-芳樟醇具有甜香、花香，以及類似橙葉的香氣；而R-（-）-芳樟醇呈現(xiàn)木香和類似薰衣草的香氣[10]。對(duì)映異構(gòu)體以不同比例混合物的形式存在于茶葉中，最終影響茶葉整體香氣[8]。然而，炒青綠茶的關(guān)鍵揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體組成和含量尚不清楚。研究表明，對(duì)映異構(gòu)體的組成和含量受茶樹生長(zhǎng)環(huán)境、茶樹品種、加工過程、貯藏條件等因素影響[11-13]，其中加工過程的干燥工序已被報(bào)道顯著影響綠茶中對(duì)映異構(gòu)體的含量[14]。近期對(duì)炒青綠茶的研究發(fā)現(xiàn)，炒干過程促進(jìn)了芳樟醇、芳樟醇氧化物（呋喃型）、β-紫羅蘭酮等重要揮發(fā)性成分的形成[3，15]。然而，在高溫長(zhǎng)時(shí)間干燥過程中，這些揮發(fā)性成分的不同構(gòu)型對(duì)映異構(gòu)體組成和含量變化規(guī)律鮮有報(bào)道。

頂空固相微萃取-對(duì)映選擇性-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Headspace solid phase micro-extraction-enantioselective-gas chromatography-

mass spectrometry，HS-SPME-Es-GC-MS）可用于檢測(cè)揮發(fā)性成分中的對(duì)映異構(gòu)體。其中頂空固相微萃取法具有靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，但萃取效率易受提取溶液中的電解質(zhì)、溫度、時(shí)間等因素的影響。氣相色譜法是一種高效的化合物分離方法，它利用色譜柱固定相與各化合物相互作用，將萃取到的揮發(fā)物分離以便質(zhì)譜檢測(cè)分析[16]，其分離程度與色譜柱固定相、程序升溫等密切相關(guān)。茶葉中揮發(fā)性成分種類繁多，不同組分之間化學(xué)性質(zhì)各異且含量差異大，分子式相同但構(gòu)型不同的對(duì)映異構(gòu)體之間卻有相似的理化性質(zhì)[16]，因此茶葉中揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體的提取和分離受到了研究人員關(guān)注。Zhu等[11]通過優(yōu)化頂空固相微萃取的料液比、萃取時(shí)間、萃取溫度等條件提高了對(duì)映異構(gòu)體的萃取效率。Mu等[13]比較了不同類型的手性毛細(xì)管色譜柱，發(fā)現(xiàn)固定相為β-環(huán)糊精衍生物的CHIRALDEX B-DM手性柱能將其他手性柱無法分離的橙花叔醇、茉莉酮酸甲酯和香茅醇對(duì)映異構(gòu)體分離開來?？梢?，茶葉中對(duì)映異構(gòu)體檢測(cè)方法的優(yōu)化有助于對(duì)茶葉揮發(fā)性成分的深入研究。

通過預(yù)試驗(yàn)和查閱文獻(xiàn)，本研究確定了目標(biāo)揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體，并對(duì)HS-SPME的提取條件（有無NaCl、萃取溫度、萃取時(shí)間）和氣相色譜升溫程序進(jìn)行優(yōu)化。隨后，采用優(yōu)化的方法分析炒青綠茶干燥過程樣品中的揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體。最后結(jié)合層次聚類分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）和偏最小二乘法判別分析（Partial least squares discrimination analysis，PLS-DA），探究對(duì)映異構(gòu)體在炒青綠茶干燥過程的變化規(guī)律，以期為今后炒青綠茶加工中的香氣品質(zhì)調(diào)控提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

對(duì)映異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品：S-（-）-檸檬烯（＞95%）、R-（+）-檸檬烯（≥95%）、（±）-檸檬烯（≥95%）、R-（-）-芳樟醇（≥95%）、（±）-芳樟醇（≥98%）、芳樟醇氧化物（呋喃型，A、B異構(gòu)體混合物，＞97%）、（±）-茶螺烷（A、B異構(gòu)體混合物，≥90%），購自Aladdin試劑公司（上海）。

化學(xué)試劑：C7～C30飽和正構(gòu)烷烴（色譜純，Meker公司，德國(guó)），氯化鈉（分析純，Sigma-Aldrich公司，上海），純凈水（娃哈哈集團(tuán)有限公司，杭州）。

1.2 儀器與設(shè)備

YS-6CST-90I滾筒型燃?xì)鈿⑶鄼C(jī)、YS-6CRT-40型茶葉揉捻機(jī)（福建省泉州裕盛機(jī)械有限公司）；Milli-Q凈水系統(tǒng)（Merck Millipore公司，德國(guó)）；DVB/CarbonWR/PDMS

Smart SPME Arrow萃取頭（1.1 mm，120/20 μm）、多功能自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)RTC120（CTC Analytics AG公司，瑞士）；CYCLOSIL-B手性毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、8890-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent公司，美國(guó)）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶樣制備

供試茶樹品種為金萱，種植在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所英德基地茶園內(nèi)，于2023年9月按一芽二三葉標(biāo)準(zhǔn)采摘鮮葉。采用當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)炒青綠茶加工方式加工炒青綠茶，加工流程：鮮葉→攤放（鼓風(fēng)機(jī)頻率23.0 Hz，室溫24.5 ℃，空氣濕度70%，攤放厚度2～3 cm，13.5 h）→殺青（滾筒殺青機(jī)10 r·min-1，280 ℃，6 min）→揉捻（揉捻機(jī)空揉5 min，輕壓5 min，空揉2 min，中壓5 min，空揉下機(jī)）→炒二青（滾筒殺青機(jī)25 r·min-1，280 ℃，13 min）→干燥（滾筒殺青機(jī)5 r·min-1，120 ℃，120 min），干燥時(shí)每30 min取樣1次，得到干燥時(shí)間為30、60、90、120 min的4個(gè)樣品。

1.3.2 揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體提取

將4個(gè)炒青綠茶樣品等量混合并研磨成粉。準(zhǔn)確稱取茶粉（0.500±0.005） g置于20 mL頂空瓶中，添加3 mL純凈水或3 mL的3 mol·L-1 NaCl溶液，擰緊瓶蓋；然后將頂空瓶置于加熱振蕩器中，在60 ℃下平衡15 min；隨后使用DVB/CarbonWR/PDMS萃取頭在60 ℃下萃取20 min。然后依次優(yōu)化萃取溫度、萃取時(shí)間，當(dāng)優(yōu)化某一條件時(shí)，其他條件保持不變。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體檢測(cè)

色譜條件：進(jìn)樣口溫度為250 ℃；采用不分流進(jìn)樣模式；載氣為氦氣（99.999%），流量為1 mL·min-1。初始溫度35 ℃，保持2 min；以4 ℃·min-1升溫至210 ℃?；虺跏紲囟?5 ℃，保持2 min；以4 ℃·min-1分別升溫至120 ℃、110 ℃或115 ℃，保持5 min（110 ℃增設(shè)保持時(shí)間10 min）；以4 ℃·min-1升溫至210 ℃。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源，電子能

量70 eV；傳輸線溫度和離子源溫度均為230 ℃，四極桿溫度150 ℃；運(yùn)行全掃描模式，掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）35～300；溶劑延遲時(shí)間4 min。

1.3.4 揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體定性定量

定性依據(jù)為保留指數(shù)（Linear retention index，LRI）和質(zhì)譜匹配度。樣品中對(duì)映異構(gòu)體的LRI根據(jù)相同檢測(cè)條件下正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間（Retention time，RT）計(jì)算，計(jì)算公式如式（1）[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同HS-SPME條件下?lián)]發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體檢測(cè)結(jié)果

不同HS-SPME條件對(duì)揮發(fā)性成分中對(duì)映異構(gòu)體種類和峰面積的影響見表2。在不添加NaCl和添加NaCl的前處理樣品中，分別檢測(cè)到6種和7種對(duì)映異構(gòu)體，添加NaCl的前處理樣品可檢出（S）-（-）-檸檬烯。添加NaCl時(shí)，對(duì)映異構(gòu)體的總峰面積達(dá)到459 670，高于其在不添加NaCl樣品中的數(shù)值（429 240），但差異不顯著。

添加NaCl、萃取時(shí)間為20 min時(shí)，不同萃取溫度（50、60、70 ℃）的樣品分別檢測(cè)到6、7、6種對(duì)映異構(gòu)體，僅60 ℃處理檢測(cè)到S-（-）-檸檬烯。從總峰面積來看，60 ℃的總峰面積最高，且差異極顯著（P＜0.01）。50 ℃和70 ℃的總峰面積分別為208 596和211 139，兩個(gè)處理間差異不顯著，但與60 ℃相比分別下降了54.62%和54.07%。

添加NaCl、萃取溫度為60 ℃時(shí)，不同萃取時(shí)間（15、20、25 min）的樣品均檢測(cè)到7種對(duì)映異構(gòu)體，從對(duì)映異構(gòu)體的總峰面積來看，隨著萃取時(shí)間的增加總峰面積逐步增大。25 min處理的總峰面積最大，為654 559，與其他兩個(gè)時(shí)間處理相比差異極顯著（P＜0.01）。但20 min和15 min兩個(gè)處理間的總峰面積分別為459 670和418 086，差異不顯著。

2.2 不同升溫程序下?lián)]發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體分離效果

調(diào)整升溫程序可減少化合物色譜峰重疊，從而增強(qiáng)分離效果。5種升溫程序?qū)?duì)映異構(gòu)體的分離效果如表3所示。110 ℃（10 min）升溫程序可分離檢測(cè)到8種對(duì)映異構(gòu)體，種類最多；0 min、120 ℃（5 min）、115 ℃（5 min）和110 ℃（5 min）均為7種。從表3和圖1可看出，S-（-）-檸檬烯（編號(hào)1）在0 min升溫程序未完全分離，分離度僅為1.06；通過優(yōu)化升溫程序可提高分離度，其在110 ℃（10 min）達(dá)到最大值1.49。R-（+）-檸檬烯在0 min升溫程序未出峰，在其他4種升溫程序出峰且分離度均大于1.5，與非目標(biāo)峰完全分離。（2S，5S）-芳樟醇氧化物A在0 min未出峰，在其他4種升溫程序出峰，其中在110 ℃（5 min）和110 ℃（10 min）的分離度分別為1.80和2.02，實(shí)現(xiàn)完全分離。（2R，5S）-芳樟醇氧化物B僅在0 min升溫程序出峰，分離度為0.70，分離效果較差。（2S，5R）-芳樟醇氧化物B在0 min的分離度僅為1.03，在另外4種升溫程序的分離度均大于1.5，其中在110 ℃（5 min）和110 ℃（10 min）均大于2.00。R-（-）-芳樟醇在5種升溫程序的分離度相差很大，最小分離度為115 ℃（5 min）的0.72，最大為110 ℃（10 min）的3.75。除0 min，S-（+）-芳樟醇在其他升溫程序的分離度均大于1.5，且峰的對(duì)稱性好。（2R，5R）-茶螺烷A在5種升溫程序的分離度相差較大，最大分離度2.15出現(xiàn)在120 ℃（5 min），最小分離度0.85出現(xiàn)在115 ℃（5 min）。（2R，5S）-茶螺烷B僅在0 min和110 ℃（10 min）出峰，后者分離度大于1.5。綜上，從對(duì)映異構(gòu)體種類數(shù)目和分離度考慮，110 ℃（10 min）升溫程序最為理想。

2.3 揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體的定量方法建立及其可靠性驗(yàn)證

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法實(shí)現(xiàn)樣品中揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體的精確定量（表1）。8種對(duì)映異構(gòu)體的線性質(zhì)量濃度為1.29～39.78 μg·L-1，R2均達(dá)到0.99以上，滿足精確定量要求。由于在低于線性范圍下限的濃度未能檢測(cè)到目標(biāo)對(duì)映異構(gòu)體，而濃度為線性范圍下限時(shí)能檢出目標(biāo)對(duì)映異構(gòu)體并實(shí)現(xiàn)定量，因此，直接采用線性范圍的下限作為L(zhǎng)OD和LOQ[8，11，18]。結(jié)果顯示，LOD和LOQ為1.29～3.73 μg·L-1，表明儀器靈敏度良好。為了評(píng)估方法的可靠性和重現(xiàn)性，測(cè)定了8種目標(biāo)對(duì)映異構(gòu)體的回收率和RSD。如表1所示，對(duì)映異構(gòu)體的回收率為86.30%～

128.53%，RSD值為0.04%～0.22%，說明該方法可靠性較強(qiáng)，重現(xiàn)性好，滿足試驗(yàn)需求。

2.4 干燥對(duì)炒青綠茶中揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體的影響

2.4.1 揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體在干燥過程中的變化

圖2A～2D展示8種對(duì)映異構(gòu)體的含量在干燥過程中的變化情況。R-（-）-芳樟醇、S-（+）-芳樟醇在干燥過程中含量逐步增加，120 min時(shí)R-（-）-芳樟醇、S-（+）-芳樟醇分別達(dá)到最大值6.55 μg·L-1、9.31 μg·L-1，顯著（P＜0.05）高于30 min的濃度。另外6種對(duì)映異構(gòu)體呈先增加后減少的趨勢(shì)。（2R，5R）-茶螺烷A、（2R，5S）-茶螺烷B在60 min時(shí)含量最高，隨后開始下降，（2R，5S）-茶螺烷B的降幅達(dá)到了15%，與60 min比較差異顯著（P＜0.05）。其余4種對(duì)映異構(gòu)體均在90 min達(dá)到各自的最高水平后開始下降。

2.4.2 不同干燥時(shí)間樣品中揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體的差異

采用無監(jiān)督HCA對(duì)樣品進(jìn)行分類，結(jié)果如圖3A所示。當(dāng)聚類距離在4～6時(shí)，12個(gè)樣品被明顯分為4類，分別是干燥30、60、90 min和120 min的樣品，說明不同干燥時(shí)間樣品的對(duì)映異構(gòu)體分布存在差異。當(dāng)聚類距離大于6時(shí)，60 min和120 min的樣品首先聚為一類，之后與90 min的樣品聚為一類，最后在距離大于12后與30 min的樣品聚為一類。然后通過有監(jiān)督的PLS-DA進(jìn)一步分析，從圖3B可看出12個(gè)樣品被劃分成4組（R2Y=0.597，Q2=0.328），其中90 min和120 min樣品的分布距離最近，30 min樣品與其他樣品距離最遠(yuǎn)。按變量投影重要性（Variable importance in projection，VIP）值高于1和P＜0.05篩選出4種差異對(duì)映異構(gòu)體（圖3C），分別是R-（-）-芳樟醇、（2R，5S）-茶螺烷B、（2R，5R）-茶螺烷A、S-（+）-芳樟醇。模型檢驗(yàn)使用200次排列檢驗(yàn)，結(jié)果如圖3D～3G所示，4個(gè)樣品的Q2回歸線的截距均小于零，說明PLS-DA模型不存在過擬合現(xiàn)象，可用于篩選差異對(duì)映異構(gòu)體。

3 討論

HS-SPME-Es-GC-MS技術(shù)已被廣泛用于茶葉及其他食品的揮發(fā)性成分分析。但此技術(shù)

的萃取、分離效果易受電解質(zhì)、溫度、時(shí)間、升溫程序等因素影響。因此，本研究以炒青綠茶為研究對(duì)象，對(duì)該技術(shù)的條件進(jìn)行優(yōu)化。研究結(jié)果表明，最佳HS-SPME條件為添加NaCl（3 mL，3 mol·L-1，料液體積比為1∶6）、萃取溫度60 ℃、萃取時(shí)間25 min，在此條件下萃取到的對(duì)映異構(gòu)體種類數(shù)最多，峰面積最高。有研究認(rèn)為NaCl可以增大茶湯的離子強(qiáng)度，使揮發(fā)性成分的溶解度減小，從而提高萃取效率[19-20]，這與本研究的結(jié)果一致。Yang等[21]探究不同HS-SPME條件對(duì)芳樟醇對(duì)映異構(gòu)體的影響發(fā)現(xiàn)，萃取溫度60 ℃的芳樟醇對(duì)映異構(gòu)體峰面積最大，萃取效果最好。這一研究與本研究的最佳萃取溫度相似。Zhu等[11]優(yōu)化HS-SPME的萃取時(shí)間用于分析不同茶類中的萜類化合物，發(fā)現(xiàn)40 min提取到的萜類化合物峰面積最高。這一最優(yōu)萃取時(shí)間與本研究不同，可能與茶粉取樣量相關(guān)。此外，還可能與茶葉樣品本身的揮發(fā)性化合物組成差異有關(guān)。氣相色譜的不同升溫程序結(jié)果顯示，最佳升溫程序?yàn)槌跏紲囟?5 ℃，保持2 min；以4 ℃·min-1升溫至110 ℃，保持10 min；以4 ℃·min-1升溫至210 ℃。此時(shí)分離到的對(duì)映異構(gòu)體種類數(shù)目達(dá)8種，且分離度大，峰型對(duì)稱。

基于最優(yōu)檢測(cè)方法建立了目標(biāo)對(duì)映異構(gòu)體的精確定量曲線，定量曲線的線性濃度范圍較寬（1.29～39.78 μg·L-1）、R2均達(dá)到0.99以上。定量曲線的方法學(xué)考察結(jié)果顯示，LOD（1.29～

3.73 μg·L-1）、LOQ（1.29～3.73 μg·L-1）、回收率（86.3%～128.53%）、RSD（0.04%～0.22%）4項(xiàng)指標(biāo)均符合要求，可用于精確定量揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體。

采用優(yōu)化后的HS-SPME-Es-GC-MS方法分析炒青綠茶不同干燥時(shí)間（30、60、90 min和120 min）樣品的揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體發(fā)現(xiàn)，4個(gè)樣品均鑒定出8種對(duì)映異構(gòu)體，分別是S-（-）-檸檬烯、R-（+）-檸檬烯、（2S，5S）-芳樟醇氧化物A、（2S，5R）-芳樟醇氧化物B、R-（-）-芳樟醇、S-（+）-芳樟醇、（2R，5R）-茶螺烷A和（2R，5S）-茶螺烷B。定量分析表明，R-（-）-芳樟醇、S-（+）-芳樟醇的含量隨干燥時(shí)間的增加而增加。干燥促進(jìn)了芳樟醇的積累，推測(cè)是高溫促使其他與芳樟醇結(jié)構(gòu)相似的化合物如香葉醇、橙花叔醇、香茅醇等異構(gòu)化形成了芳樟醇[21]。其余6種對(duì)映異構(gòu)體的含量呈先增加后下降趨勢(shì)。檸檬烯和芳樟醇氧化物等萜類異構(gòu)體的形成與糖苷類化合物相關(guān)，干燥過程會(huì)促進(jìn)糖苷前體物質(zhì)的轉(zhuǎn)化[14]，從而提高對(duì)映異構(gòu)體含量；茶螺烷是類胡蘿卜素的主要降解產(chǎn)物之一，β-胡蘿卜素易在高溫過程發(fā)生熱裂解反應(yīng)，生成茶螺烷[22]。同時(shí)，隨著時(shí)間的增加，對(duì)映異構(gòu)體可轉(zhuǎn)變成其他物質(zhì)，并且高溫環(huán)境會(huì)促使化合物揮發(fā)，這二者導(dǎo)致對(duì)映異構(gòu)體的含量下降[23]。因此，對(duì)映異構(gòu)體在高溫干燥過程中因形成和消耗路徑的相互競(jìng)爭(zhēng)，可能引起不同的含量變化。

為了進(jìn)一步說明不同干燥時(shí)間樣品中的差異對(duì)映異構(gòu)體，本研究開展了HCA和PLS-DA分析。HCA結(jié)果中當(dāng)聚類距離為4～6時(shí)，12個(gè)樣品被明顯分為4類，與4種干燥時(shí)間一致，PLS-DA中不同干燥時(shí)間的樣品也被分開，以上結(jié)果均說明對(duì)映異構(gòu)體組成顯示了樣品間的差異。30 min樣品在HCA和PLS-DA分析中均呈現(xiàn)出與其他3種干燥時(shí)間樣品距離遠(yuǎn)的結(jié)果，說明30 min樣品的對(duì)映異構(gòu)體與其他3種樣品差異最大。120 min樣品在HCA和PLS-DA分析中分別與60 min和90 min樣品距離較近，可能由于HCA和PLS-DA統(tǒng)計(jì)分析原理不同。進(jìn)一步根據(jù)PLS-DA模型中VIP值大于1和差異顯著分析P＜0.05篩選出4種差異對(duì)映異構(gòu)體：R-（-）-芳樟醇、（2R，5S）-茶螺烷B、（2R，5R）-茶螺烷A和S-（+）-芳樟醇，它們?cè)诟稍镞^程中含量變化最大，是影響炒青綠茶香氣特征的關(guān)鍵對(duì)映異構(gòu)體。芳樟醇本身帶有花香、甜香等令人愉快的香氣[24]，多項(xiàng)研究指出芳樟醇是綠茶香氣的主要貢獻(xiàn)成分[9，25-26]。研究表明R-（-）-芳樟醇有助于增強(qiáng)綠茶的栗香[8]。本研究中R-（-）-芳樟醇、S-（+）-芳樟醇的香氣活度值（Odor activity value，OAV）分別為8.19、1.26，滿足OAV大于1的要求，被鑒定為金萱炒青綠茶栗香的關(guān)鍵活性對(duì)映異構(gòu)體。（2R，5S）-茶螺烷B具有松針、泥土、草藥味[12]，（2R，5R）-茶螺烷A呈現(xiàn)清香、青草氣和木質(zhì)香[27]，但它們?cè)诰G茶中較少被報(bào)道，二者對(duì)綠茶整體香氣的貢獻(xiàn)尚不清楚。

本研究通過優(yōu)化HS-SPME-Es-GC-MS條件和建立可靠的定量曲線，獲得了高效的對(duì)映異構(gòu)體分析方法，并利用該方法探究了揮發(fā)性對(duì)映異構(gòu)體在炒青綠茶不同干燥階段的變化規(guī)律。研究結(jié)果不僅能加深對(duì)炒青綠茶香氣化合物的認(rèn)識(shí)，還能為綠茶干燥過程中的香氣品質(zhì)調(diào)控提供參考依據(jù)。

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