雞chNHE1精準(zhǔn)基因編輯細(xì)胞系的構(gòu)建及其抗ALV-J感染的研究

摘 要： 旨在構(gòu)建ALV-J受體分子chNHE1精準(zhǔn)基因編輯細(xì)胞系，本研究利用熒光標(biāo)記的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在DF-1細(xì)胞中將chNHE1介導(dǎo)ALV-J進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵氨基酸V33進(jìn)行突變，W38進(jìn)行缺失，同時(shí)將編碼第34-37位氨基酸的密碼子同義替換。通過流式細(xì)胞分選獲得48株單克隆細(xì)胞系，PCR及測序分析結(jié)果顯示，其中有14株單克隆細(xì)胞系的chNHE1成功發(fā)生V33突變、W38缺失以及34-37位氨基酸的密碼子同義替換，基因編輯效率為29%。為了驗(yàn)證chNHE1基因編輯DF-1細(xì)胞系的遺傳穩(wěn)定性及增殖水平，對傳至第25代的細(xì)胞系進(jìn)行測序分析，結(jié)果顯示，chNHE1基因未發(fā)生回復(fù)性突變；進(jìn)一步細(xì)胞計(jì)數(shù)分析結(jié)果顯示，chNHE1基因編輯細(xì)胞系增殖水平未受到影響；為了評價(jià)chNHE1基因編輯細(xì)胞系抗ALV-J感染的能力，分別利用ALV-J熒光報(bào)告病毒（ALV-J-GFP）及ALV-J原型毒株（HPRS-103）對其進(jìn)行病毒感染試驗(yàn)，熒光觀察結(jié)果及流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，chNHE1基因編輯細(xì)胞系可完全抵抗0.1 MOI ALV-J-GFP的感染；進(jìn)一步間接免疫熒光試驗(yàn)、PCR擴(kuò)增試驗(yàn)以及病毒滴度測定試驗(yàn)結(jié)果顯示，chNHE1基因編輯細(xì)胞系可完全抵抗0.1 MOI HPRS-103毒株及0.1 MOI JL08CH3-1毒株的感染。本研究利用熒光標(biāo)記的CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合流式細(xì)胞分選，成功構(gòu)建了chNHE1基因編輯細(xì)胞系，其可完全抵抗ALV-J的感染，且該細(xì)胞系遺傳穩(wěn)定性及增殖活性良好，為建立抗ALV-J感染的新技術(shù)提供了理論支持及基因編輯靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞： DF-1；chNHE1；ALV-J；基因編輯

中圖分類號： Q78；S852.659.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-5238-09

收稿日期：2024-01-05

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（32230105）；國家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-41）；國家農(nóng)業(yè)重大科技項(xiàng)目（NK2022100103）

作者簡介：張學(xué)富（1998-），女，新疆伊犁人，碩士生，主要從事禽免疫抑制病研究，E-mail：zxf18197502991@163.com

*通信作者：李留安，主要從事畜禽營養(yǎng)生理生化研究，E-mail：anliuli2003@163. com；高玉龍，主要從事禽免疫抑制病研究，E-mail：gaoyulong@caas.cn

Construction of Chicken chNHE1 Gene Editing Cell Line and Analysis of Its Resistance

to ALV-J Infection

ZHANG" Xuefu1，2， CHEN" Yuntong2， FAN" Wenrui2， ZHANG "Zibo2， YU" Mengmeng2， WANG" Suyan2，

QI" Xiaole2， LI" Liuan1*， GAO" Yulong2*

（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine， Tianjin Agricultural University， Tianjin

300384，" China;

2.Avian Immunosuppressive Diseases Division， State Key Laboratory for

Animal Disease Control and Preventinon， Harbin Veterinary Research Institute，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150069，" China）

Abstract：" This study aimed to construct a precise gene-edited cell lines for the ALV-J receptor molecule chNHE1. In DF-1 cells， key amino acids V33 and W38 facilitating ALV-J entry into host cells via chNHE1 were mutated and deleted， respectively. Meanwhile， the codon encoding amino acids 34-37 of chNHE1 were synonymously replaced. Forty-eight monoclonal cell lines were obtained through flow cytometry sorting， and PCR identification and sequencing analysis revealed that 14 of these cell lines had chNHE1 mutations in V33， W38 deletions， and synonymous substitution of codons at amino acids 34-37， with a gene editing efficiency of 29%. In order to verify the genetic stability and proliferation of the chNHE1 gene-edited cell lines， sequencing analysis was performed on the cells lines that were continuously passaged for 25 generations， and the results showed no revertant mutations in the chNHE1 gene. Further cell count analysis showed no revertant mutations in the chNHE1 gene. Further cell count analysis showed that the proliferation level of chNHE1 gene-edited cell lines was unaffected. In order to verify the anti ALV-J infection ability of the chNHE1 gene-edited cell line， ALV-J fluorescent reporter virus （ALV-J-GFP） and ALV-J prototype strain （HPRS-103） were used for virus challenge experiment. The fluorescence observation and flow cytometry analysis results showed that the chNHE1 gene-edited cell line completely resisted the infection of ALV-J fluorescent strain; Furthermore， the results of indirect immunofluorescence assays， PCR amplification assays， and virus titer determination assays showed that the chNHE1 gene-edited cell line completely resisted the infection of HPRS-103 strain. This study utilized a fluorescence labeled CRISPR/Cas9 system combined with flow cytometry sorting to successfully construct a chNHE1 gene-edited cell line， which showed complete resistance to ALV-J infection， and exhibited good genetic stability and proliferation activity. This provides theoretical support and gene editing targets for establishing new technologies against ALV-J infections.

Key words： DF-1;" chNHE1; ALV-J; gene editing

*Corresponding authors：" LI Liuan， E-mail：anliuli2003@163.com; GAO Yulong， E-mail：gaoyulong@caas.cn

禽白血?。╝vian leukosis， AL）是由禽白血病病毒（avian leukosis virus， ALV）引起的具有傳染性的多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱。該病主要通過垂直傳播，在全球各地均有發(fā)生，臨床上表現(xiàn)為雞群的生產(chǎn)性能下降、免疫抑制以及不同臟器和組織的腫瘤等［1］。根據(jù)宿主范圍、病毒囊膜基因以及血清學(xué)交叉反應(yīng)性的不同，目前，ALV被劃分為A～K共11個(gè)亞群（ALV-A～ALV-K）［2］，不同亞群ALV對雞的致病性存在差異，其中J亞群ALV（ALV-J）致病性強(qiáng)且傳播范圍最廣。我國于1999年首次在肉雞中分離到ALV-J［3］，隨后ALV-J在我國商品肉雞、蛋雞和地方品種雞中廣泛流行，導(dǎo)致一些大型祖代場倒閉，不僅給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重威脅我國家禽種源安全。因此，禽白血病被列為《全國畜禽遺傳改良計(jì)劃（2021—2035年）》中的優(yōu)先防控對象和疾病凈化目標(biāo)。然而，目前還沒有有效的疫苗和藥物來預(yù)防或控制禽白血病，只能通過對種雞群的凈化，因此，探究ALV的新型防控策略具有重要意義。

ALV屬于α逆轉(zhuǎn)錄病毒屬，具有典型禽逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)，為有囊膜的RNA病毒。ALV通過其囊膜蛋白與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合是其建立感染的關(guān)鍵一步。不同亞群ALV的囊膜蛋白存在較大差異，因此其所識(shí)別的細(xì)胞受體也不完全相同，其中，Tva屬于低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白家族，為A亞群ALV及K亞群ALV的細(xì)胞受體，Tvb屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族，為B亞群ALV、D亞群ALV及E亞群ALV的細(xì)胞受體，Tvc屬于免疫球蛋白超家族，為C亞群ALV的細(xì)胞受體，禽Ⅰ型Na+/H+交換蛋白（chNHE1）為ALV-J的細(xì)胞受體［4］。NHE1作為細(xì)胞鈉氫交換泵，在細(xì)胞膜上廣泛存在，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的pH，對細(xì)胞的增殖與存活具有重要意義［5-7］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究鑒定出chNHE1的第30、33、38及39位氨基酸是其與ALV-J結(jié)合并介導(dǎo)ALV-J入侵的關(guān)鍵氨基酸［8］。為了進(jìn)一步研究chNHE1與ALV-J結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸在ALV-J感染中的作用，本研究擬構(gòu)建chNHE1基因編輯的DF-1細(xì)胞系，對chNHE1與ALV-J結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)突變，使其喪失作為ALV-J受體的功能，而不影響其維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的正常生理功能，為進(jìn)一步研究chNHE1在ALV-J感染中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒及病毒毒株

DF-1細(xì)胞、表達(dá)綠色熒光蛋白的重組病毒ALV-J-GFP毒株、ALV-A-GFP毒株及ALV-J國內(nèi)蛋雞分離株JL08CH3-1為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存［9-10］、HPRS-103毒株由Venugopal Nair教授饋贈(zèng)；pMJ920質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

4A3鼠源單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備［11］；綠色熒光標(biāo)記的Alexa Fluor 488羊抗鼠抗體購自Thermo公司；TIANamp Genomic DNA提取試劑盒購自Tiangen公司；pMD18-T載體購自TaRaKa公司。

1.3 載體構(gòu)建

使用E-CRISP在線軟件（http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/designcris/html）設(shè)計(jì)chNHE1敲除引導(dǎo)RNA（gRNA）序列（CCCCACGGCTGCTCCCAGGT），插入到pMD-18T載體，構(gòu)建chNHE1-sgRNA敲除質(zhì)粒。根據(jù)NCBI （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中chNHE1基因序列，設(shè)計(jì)ssODN（GCCCGCTGCTGCCCGGCCAGCGCTTGCAGGC-CGACGCCACGCGTGGATCGGAACCGACGGAG-CAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCG-CCGCCCCGCTGGCCACGGCCCAGGAGGTGCACC-CGCTGAACAAACAGCACCACAACCACTC），將chNHE1基因所編碼的38位氨基酸缺失表達(dá)、33位氨基酸突變表達(dá)及34-37位氨基酸密碼子同義替換。

1.4 r-chNHE1細(xì)胞系的構(gòu)建及篩選

將pMJ920質(zhì)粒、chNHE1-sgRNA質(zhì)粒及ssOND共轉(zhuǎn)入DF-1細(xì)胞內(nèi)，培養(yǎng)48 h后，使用流式細(xì)胞分選儀篩選帶有GFP熒光的細(xì)胞，按照5細(xì)胞·孔―1的稀釋比例將其接入96孔板中，7 d后于倒置顯微鏡下觀察篩選單克隆細(xì)胞系（r-chNHE1）并擴(kuò)大培養(yǎng)。使用基因組提取試劑盒提取r-chNHE1細(xì)胞系的基因組，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。首先，根據(jù)chNHE1基因序列，在sgRNA靶點(diǎn)下游設(shè)計(jì)下游引物P3（GCATTTGGGTGCTCAAGGGG），然后根據(jù)chNHE1編碼的33—38位氨基酸的突變序列，設(shè)計(jì)一條上游引物P1（CGCGTGG-ATCGGAACCGACG），以P1和P3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定r-chNHE1細(xì)胞系是否突變成功。根據(jù)chNHE1編碼的33—38位氨基酸的野生型序列設(shè)計(jì)一條上游引物P2（CGCGTGTCTC-CGAGCCCACC），以P2和P3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定r-chNHE1細(xì)胞系是否存在未成功突變的chNHE1基因序列。以chNHE1-CX-F（CCCT-TCCCTGGGCTCTGCTGC）及chNHE1-CX-R（TGTTCAGCGGGTGCACCTCC）為引物擴(kuò)增替換序列，回收擴(kuò)增產(chǎn)物連接pMD-18T進(jìn)行測序鑒定替換是否成功。

1.5 r-chNHE1細(xì)胞系遺傳穩(wěn)定性的檢測

收集培養(yǎng)至第25代的r-chNHE1細(xì)胞，使用基因組提取試劑盒提取r-chNHE1細(xì)胞系的基因組，以P1及P3為引物，鑒定替換序列是否仍然存在，以P2及P3為引物鑒定r-chNHE1單克隆細(xì)胞中是否存在野生型的chNHE1基因序列。

1.6 r-chNHE1細(xì)胞系生長水平的檢測

各取r-chNHE1細(xì)胞系及野生型DF-1細(xì)胞系，以2×105細(xì)胞·孔―1的密度鋪至12孔板。鋪板后12、24、36、48及60 h使用胰酶分別消化兩個(gè)細(xì)胞系的3個(gè)平行孔，各使用1 mL培養(yǎng)基重懸后分別進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析，數(shù)據(jù)之間的方差使用T檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算，Plt;0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.7 r-chNHE1細(xì)胞系抗ALV-J-GFP毒株感染水平的檢測

各取r-chNHE1細(xì)胞系及野生型DF-1細(xì)胞系，以5×105細(xì)胞·孔―1的密度鋪至12孔板，16 h后分別按照0.1 MOI的接毒劑量感染ALV-J-GFP毒株及ALV-A-GFP毒株，各設(shè)置3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)未感染r-chNHE1細(xì)胞系作為陰性對照。接毒72 h后通過倒置熒光顯微鏡觀察GFP熒光比例。進(jìn)一步，對接毒72 h后的細(xì)胞，使用胰酶消化后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測r-chNHE1細(xì)胞系及野生型DF-1細(xì)胞系感染ALV-J-GFP毒株及ALV-A-GFP毒株的比例。并設(shè)野生型細(xì)胞的熒光毒感染率為100%，計(jì)算r-chNHE1細(xì)胞系對熒光毒的相對感染率。使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析，數(shù)據(jù)之間的方差使用T檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算，Plt;0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.8 r-chNHE1細(xì)胞系抗ALV-J野生型毒株感染水平的檢測

各取r-chNHE1細(xì)胞系及野生型DF-1細(xì)胞系，以5×105細(xì)胞·孔―1的密度鋪至12孔板，16 h后分別感染ALV-J（HPRS-103）毒株及ALV-J（JL08CH3-1）毒株，0.1 MOI·孔―1，每組設(shè)置3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)未感染r-chNHE1細(xì)胞系作為陰性對照，接毒72 h后用4%多聚甲醛固定，以4A3鼠源單克隆抗體（1∶100倍稀釋）為一抗，以Alexa Fluor 488羊抗鼠抗體（1∶1 000倍稀釋）為二抗，利用間接免疫熒光技術(shù)（IFA）檢測r-chNHE1細(xì)胞系及野生型DF-1細(xì)胞系感染ALV-J（HPRS-103）毒株及ALV-J（JL08CH3-1）毒株的比例。

各取r-chNHE1細(xì)胞系及野生型DF-1細(xì)胞系，以5×105細(xì)胞·孔―1的密度鋪至12孔板，16 h后分別感染ALV-J（HPRS-103）毒株及ALV-J（JL08CH3-1）毒株，0.1 MOI·孔―1，每組設(shè)置3個(gè)平行孔，接毒72 h后提取細(xì)胞基因組，并以其為模板，以ALV-J基因組擴(kuò)增的特異性引物PF（CGGAGAAGACACCCTTGCT）和JR（CGAA-CCAAAGGTAACACACG）為引物［12］，通過PCR擴(kuò)增鑒定r-chNHE1細(xì)胞系及野生型DF-1細(xì)胞系是否感染ALV-J（HPRS-103）毒株及ALV-J（JL08CH3-1）毒株。

各取r-chNHE1細(xì)胞系及野生型DF-1細(xì)胞系，以5×105細(xì)胞·孔―1的密度鋪至12孔板，16 h后分別感染ALV-J（HPRS-103）毒株及ALV-J（JL08CH3-1）毒株，0.1 MOI·孔―1，每組設(shè)置3個(gè)平行孔，接毒72 h后收集細(xì)胞上清即病毒原液，分別測定其病毒滴度，鑒定r-chNHE1細(xì)胞系及野生型DF-1細(xì)胞系是否感染ALV-J（HPRS-103）毒株及ALV-J（JL08CH3-1）毒株。具體來說：將收集的病毒原液，使用含2%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM 10倍倍比稀釋，接種于96孔板的DF-1細(xì)胞，感染168 h后，將96孔板的DF-1細(xì)胞反復(fù)凍融，使用禽白血病病毒ELISA抗原檢測試劑盒檢測其是否為陽性，確定陽性孔數(shù)及所對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算TCID50，即病毒滴度。使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析，數(shù)據(jù)之間的方差使用T檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算，Plt;0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 r-chNHE1細(xì)胞系的構(gòu)建及篩選

前期研究表明，chNHE1的第30位丙氨酸（A30）、第33位纈氨酸（V33）、第38位色氨酸（W38）及第39位精氨酸（R39）為與ALV-J相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)［8］，其中，與ALV-J不易感鳥類NHE1氨基酸序列相比，只有第V33和W38是chNHE1獨(dú)有的。因此，本研究利用CRISPR/Cas9方法對DF-1細(xì)胞的chNHE1進(jìn)行基因編輯，將第33位氨基酸由纈氨酸突變?yōu)楦拾彼幔╒33G），第38位色氨酸缺失表達(dá)（ΔW38）。同時(shí)，為了便于后期對基因編輯細(xì)胞系的鑒定，將chNHE1編碼的34—37位氨基酸密碼子進(jìn)行同義替換，構(gòu)建r-chNHE1細(xì)胞系（圖1A）。根據(jù)chNHE1編碼的33—38位氨基酸序列，設(shè)計(jì)引物對所篩選的細(xì)胞系進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證（圖1B）。結(jié)果顯示，在48個(gè)單克隆細(xì)胞系中，有14株成功獲得了序列替換，其替換效率約為29%。進(jìn)一步選取其中一株細(xì)胞通過PCR鑒定所篩選的單克隆細(xì)胞系成功獲得了序列替換，且無野生型細(xì)胞污染（圖1C）。測序分析結(jié)果顯示替換序列成功插入chNHE1基因中。結(jié)果表明成功獲得chNHE1 V33和W38突變的細(xì)胞系（r-chNHE1）（圖1A）。

2.2 r-chNHE1細(xì)胞系遺傳穩(wěn)定性檢測

為了檢測chNHE1基因編輯細(xì)胞系的遺傳穩(wěn)定性，將r-chNHE1細(xì)胞系連續(xù)傳代至第25代，收集細(xì)胞，以第25代r-chNHE1細(xì)胞系的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增的方式進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示第25代r-chNHE1細(xì)胞系替換序列未發(fā)生回復(fù)性突變（圖2）。

2.3 r-chNHE1細(xì)胞系增殖水平的檢測

為了檢測chNHE1基因編輯后是否影響DF-1細(xì)胞的增殖活性，將r-chNHE1細(xì)胞系及野生型DF-1細(xì)胞系分別接種至12孔板中，每12 h對其進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，結(jié)果顯示r-chNHE1細(xì)胞系與野生型DF-1細(xì)胞系的增殖水平無顯著性差異（圖3）。

2.4 r-chNHE1細(xì)胞系抗ALV-J-GFP毒株感染水平的檢測

為了檢測r-chNHE1細(xì)胞系是否可以完全抵抗ALV-J熒光毒株的感染，將r-chNHE1細(xì)胞系及野生型DF-1細(xì)胞系分別感染ALV-J熒光毒株（ALV-J-GFP），同時(shí)，感染A亞群ALV熒光毒（ALV-A-GFP）作為陽性對照，感染后72 h觀察GFP熒光比例。結(jié)果顯示，感染ALV-J-GFP毒株的r-chNHE1細(xì)胞系無明顯GFP熒光，感染的野生型DF-1細(xì)胞系可見明顯GFP熒光（圖4）。而感染ALV-A-GFP毒株后r-chNHE1細(xì)胞系及野生型DF-1細(xì)胞系均可觀察到明顯GFP熒光。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，與野生型細(xì)胞相比，r-chNHE1細(xì)胞系對ALV-J-GFP毒株的相對感染率為0%，而對ALV-A-GFP毒株的相對感染率為100%。表明r-chNHE1細(xì)胞系可特異性的抵抗ALV-J-GFP毒株的感染而不影響ALV-A-GFP毒株的感染。

2.5 r-chNHE1細(xì)胞系抗ALV-J野生型毒株感染水平的檢測

為了檢測r-chNHE1細(xì)胞系是否可以完全抵抗ALV-J野生型毒株的感染，將r-chNHE1細(xì)胞系及野生型DF-1細(xì)胞系分別感染ALV-J原型毒株HPRS-103及ALV-J國內(nèi)蛋雞分離株JL08CH3-1，感染后72 h進(jìn)行IFA檢測。結(jié)果顯示，感染HPRS-103毒株及JL08CH3-1毒株的r-chNHE1細(xì)胞系無明顯熒光，感染HPRS-103毒株及JL08CH3-1毒株的野生型DF-1細(xì)胞系可見明顯熒光。進(jìn)一步對分別感染HPRS-103及JL08CH3-1毒株的r-chNHE1細(xì)胞系及野生型DF-1細(xì)胞系通過PCR擴(kuò)增試驗(yàn)ALV-J基因組。結(jié)果顯示，r-chNHE1細(xì)胞系在感染HPRS-103毒株及JL08CH3-1毒株后無法檢測到ALV-J基因組，而野生型DF-1細(xì)胞在感染HPRS-103毒株及JL08CH3-1毒株后可檢測到明顯的ALV-J基因組。最后，分別收集感染HPRS-103及JL08CH3-1"" 毒株的r-chNHE1細(xì)胞系及野生型DF-1細(xì)胞系的細(xì)胞上清，通過TCID50的測定檢測其病毒含量，結(jié)果顯示，r-chNHE1細(xì)胞系在感染HPRS-103毒株及JL08CH3-1毒株后的細(xì)胞中無法檢測到病毒滴度，而野生型DF-1細(xì)胞系在感染HPRS-103毒株及JL08CH3-1毒株后的細(xì)胞上清中TCID50分別為102.87·mL-1和103.63·mL-1，表明r-chNHE1細(xì)胞系可抵抗ALV-J野生型毒株的感染（圖5）。

3 討 論

目前，對ALV的防控方式主要依靠凈化種雞群，但是凈化需要多個(gè)世代進(jìn)行多次檢測且持續(xù)進(jìn)行，這個(gè)過程耗費(fèi)大量的時(shí)間、人力和物力。盡管目前采用該方法取得了一定的進(jìn)展，但仍需持續(xù)凈化，尤其在我國地方品種雞群中ALV仍有較高的感染率，防控凈化工作仍然嚴(yán)峻［13-16］，因此，現(xiàn)階段新型高效的ALV防控技術(shù)的研究顯得尤為迫切。種源性疾病的最好防控與根除辦法是建立抗病育種技術(shù)，ALV-J感染是從其囊膜蛋白（gp85）與細(xì)胞受體chNHE1的特異性結(jié)合開始的，因此通過培育ALV受體功能缺陷雞群，直接阻斷病毒侵入宿主細(xì)胞，可以使雞群形成天然的保護(hù)屏障［17］。近年來，基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，CRISPR/Csas9技術(shù)的問世實(shí)現(xiàn)了更精準(zhǔn)的基因編輯。有研究通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，使CD34+造血干細(xì)胞表面HIV-1病毒進(jìn)入細(xì)胞的輔助受體CCR5基因功能性失活，進(jìn)而阻止HIV進(jìn)入細(xì)胞［18］。因此通過基因編輯技術(shù)構(gòu)建抗ALV感染雞對ALV的高效防控具有十分重要的意義。然而多數(shù)受體基因是宿主的看家基因，具有重要的生理功能，不能完全敲除，目前CRISPR/Cas9技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞生長關(guān)鍵基因進(jìn)行突變或部分缺失［19］，從而達(dá)到精準(zhǔn)編輯的目的，既能實(shí)現(xiàn)抗病毒功能，又不影響受體基因生理功能。

chNHE1作為ALV-J的受體，其對于細(xì)胞正常生命活動(dòng)至關(guān)重要，chNHE1的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷［5-7］，因此，只能通過對chNHE1發(fā)揮受體作用的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行精準(zhǔn)編輯，使其喪失作為ALV-J受體的功能。目前已有研究構(gòu)建了chNHE1 W38位點(diǎn)缺失的精準(zhǔn)基因編輯雞［20］，盡管該基因編輯雞可以完全抵抗ALV-J的感染，但是，本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，chNHE1 W38位點(diǎn)單獨(dú)缺失不能完全破壞chNHE1與ALV-J的相互作用，A30、V33以及R39在chNHE1與ALV-J的互作中也發(fā)揮重要作用［8］。由于ALV-J的不斷進(jìn)化，僅僅通過對chNHE1 W38這一個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變所構(gòu)建的基因編輯雞可能存在ALV-J再次易感的風(fēng)險(xiǎn)。本研究基于前期鑒定的chNHE1與ALV-J相互作用關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的研究結(jié)果［8］，同時(shí)與ALV-J不易感鳥類NHE1氨基酸序列相比，只有V33和W38是chNHE1獨(dú)有的，因此本研究針對chNHE1高度保守的V33及W38進(jìn)行基因編輯。通過對r-chNHE1細(xì)胞系生長水平的測定，表明在DF-1細(xì)胞將chNHE1的V33及W38位點(diǎn)突變或缺失不影響細(xì)胞的生長，chNHE1保留了維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的生理功能，進(jìn)一步的感染試驗(yàn)證明chNHE1基因編輯細(xì)胞系r-chNHE1可特異性的完全抵抗ALV-J毒株的感染。本研究證明了通過對chNHE1 V33及W38位點(diǎn)突變或缺失從而使其喪失介導(dǎo)ALV-J感染的能力的可行性，進(jìn)一步降低了ALV-J易感的風(fēng)險(xiǎn)，為建立抗ALV-J感染的新技術(shù)提供了精準(zhǔn)的基因編輯靶點(diǎn)。

目前，針對DF-1基因編輯細(xì)胞的構(gòu)建主要通過轉(zhuǎn)染含有藥物抗性的基因編輯質(zhì)粒的方法［19］，該方法通過藥物加壓篩選獲得相應(yīng)的基因編輯細(xì)胞系，藥物的持續(xù)加壓提高了外源抗性基因隨機(jī)整合至宿主基因組的概率，此方法對于構(gòu)建基因編輯雞存在一定的生物安全隱患。本研究通過轉(zhuǎn)染含有熒光標(biāo)記的基因編輯質(zhì)粒，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分選，成功篩選獲得chNHE1基因編輯細(xì)胞系r-chNHE1，降低了轉(zhuǎn)染質(zhì)粒隨機(jī)插入宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)。另外，目前針對DF-1精準(zhǔn)基因編輯細(xì)胞系的鑒定主要通過在對靶位點(diǎn)突變的同時(shí)引入相鄰氨基酸位點(diǎn)的同義突變，使其成為限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，最終對基因編輯細(xì)胞系進(jìn)行酶切鑒定［21］，該方法涉及到PCR擴(kuò)增及酶切等多個(gè)步驟，不僅繁瑣，且無法對細(xì)胞的純凈性進(jìn)行檢測。本研究通過對靶位點(diǎn)突變的同時(shí)引入多個(gè)相鄰氨基酸位點(diǎn)的同義突變，以同義突變區(qū)序列作為鑒定引物通過PCR擴(kuò)增的方式進(jìn)行鑒定，僅PCR擴(kuò)增一步即可對基因編輯結(jié)果進(jìn)行鑒定，同時(shí)還可檢測細(xì)胞的純凈性，提高了基因編輯鑒定的效率。因此，本研究利用熒光作為篩選標(biāo)記的方法為構(gòu)建基因編輯細(xì)胞系提供了新的方法，通過對基因編輯位點(diǎn)引入同義突變的方法為基因編輯細(xì)胞系的鑒定提供了新的思路。

4 結(jié) 論

本研究利用熒光報(bào)告基因標(biāo)記的基因編輯質(zhì)粒結(jié)合流式分選的方法以及對基因編輯位點(diǎn)引入同義突變的方法成功構(gòu)建了chNHE1 V33突變及W38位點(diǎn)缺失的基因編輯DF-1細(xì)胞系，該細(xì)胞系可以完全抵抗ALV-J的感染而不影響細(xì)胞的增殖，為建立抗ALV-J感染的新技術(shù)提供了理論支持及基因編輯靶點(diǎn)。

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（編輯 白永平）