雞marco穩(wěn)轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞系的構(gòu)建與鑒定

摘 要： 旨在通過(guò)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)marco基因的HD11細(xì)胞系，為研究marco基因的抗病毒免疫功能提供重要工具。首先，以HD11細(xì)胞為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得marco基因編碼區(qū)序列，并將其克隆到慢病毒載體上，獲得重組慢病毒質(zhì)粒pLV3-CMV-MCS-Puro-marco；其次，利用四質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)將重組質(zhì)粒pLV3-CMV-MCS-Puro-marco與輔助質(zhì)粒pLP1、pLP2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，構(gòu)建含雞marco基因的重組慢病毒。最后，用包裝成功的重組慢病毒感染HD11細(xì)胞72 h后進(jìn)行嘌呤霉素（2 μg·mL-1）篩選，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)marco基因表達(dá)后最終確認(rèn)獲得穩(wěn)定表達(dá)雞marco基因的HD11細(xì)胞系。本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)雞marco基因的HD11細(xì)胞系，為后續(xù)深入研究marco基因的功能提供了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： marco細(xì)胞系；穩(wěn)定表達(dá)；慢病毒

中圖分類號(hào)：S831.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）11-5310-07

收稿日期：2024-05-13

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX（21）1001）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31602032）

作者簡(jiǎn)介：郭 旺（1999-），男，河南西平人，碩士生，主要從事家禽遺傳資源的評(píng)價(jià)與利用，E-mail： 2715857896@qq.con

*通信作者：徐 琪，主要從事家禽遺傳資源的評(píng)價(jià)與利用，E-mail：xuqi@yzu.edu.cn

Construction and Identification of the Chicken marco-stable Macrophage Cell Line

GUO" Wang， PENG" Guangzhong， HUANG" Hongao， WU" Huixian， HU" Xuming， ZHANG" Yu， ZHANG" Yang， CHEN" Guohong， XU" Qi*

（College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225009， "China）

Abstract：" The study aimed to establish the HD11 cell line with a stable expression of the marco gene through the lentivirus expression system， providing a crucial tool for investigating the antiviral immune function of the marco gene. Initially， the marco gene coding sequence was amplified by PCR using HD11 cells as a template and cloned into the lentiviral vector to generate the recombinant lentiviral plasmid pLV3-CMV-MCS-Puro-marco. Subsequently， the recombinant plasmid pLV3-CMV-MCS-Puro-marco was co-transfected with helper plasmids pLP1， pLP2， and pMD2.G into 293T cells using a tetra-plasmid lentivirus packaging system， resulting in the construction of recombinant lentivirus carrying the chicken marco gene. The successfully packaged recombinant lentivirus was then used to infect HD11 cells， followed by puromycin （2 μg·mL-1） selection for 72 h. The stable expression of the chicken marco gene in the HD11 cell line was confirmed by RT-qPCR analysis， indicating the successful establishment of a stable cell line expressing the chicken marco gene. This study successfully established a stable HD11 cell line expressing the chicken marco gene， providing a crucial basis for further exploration of the marco gene’s function.

Key words： marco cell line; stable expression; lentivirus

*Corresponding author： XU Qi， E-mail：xuqi@yzu.edu.cn

巨噬細(xì)胞（macrophages）具有抵御病原體攻擊、清除代謝廢物以及幫助身體組織進(jìn)行修復(fù)等多種生物學(xué)功能，因此在維持宿主生理環(huán)境穩(wěn)態(tài)上起到了不可忽視的作用［1-2］。值得注意的是，巨噬細(xì)胞能識(shí)別并清除對(duì)機(jī)體有害的內(nèi)源性及外源性物質(zhì)，從而充當(dāng)“清除劑”角色［3-4］。清道夫受體（scavenger receptors， SRs）通常會(huì)在巨噬細(xì)胞表面大量表達(dá)，它們可以直接與革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分結(jié)合產(chǎn)生相互作用［5-6］。根據(jù)它們分子構(gòu)成中不同的結(jié)構(gòu)域，清道夫受體被分成了8個(gè)類別，即A到H型。其中，膠原樣結(jié)構(gòu)巨噬細(xì)胞受體（macrophage receptor with collagenous structure， marco）屬于A型清道夫受體家族［7］。

巨噬細(xì)胞受體marco作為一種在細(xì)胞表面表達(dá)的清道夫受體A類蛋白，在先天性抗微生物免疫系統(tǒng)中扮演著重要的角色［8］。巨噬細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的一部分，能夠吞噬和消化病原體，起到清除感染的作用。而marco作為巨噬細(xì)胞上的受體，具有重要的調(diào)控作用。marco是巨噬細(xì)胞重要的先天性免疫活化標(biāo)志物，已被證明參與各種細(xì)菌病原體的識(shí)別。抑制marco介導(dǎo)的先天性免疫增強(qiáng)了對(duì)細(xì)菌二次感染的易感性［9］。近年來(lái)，marco被證明參與病毒識(shí)別、感染和復(fù)制等過(guò)程［10-15］。保持marco的正常功能對(duì)于免疫系統(tǒng)的有效響應(yīng)至關(guān)重要。因此，了解并研究marco可以幫助我們深入了解免疫系統(tǒng)的功能和病原微生物的感染機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新的免疫治療方法提供基礎(chǔ)。

慢病毒（lentivirus）包裝系統(tǒng)可用于構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系來(lái)研究某種宿主因子的功能及其對(duì)病毒增殖的影響［16-17］。本研究使用慢病毒包裝技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)marco的HD11細(xì)胞系。本試驗(yàn)結(jié)果可以為深入研究marco在抗病毒免疫中的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和試劑

慢病毒包裝質(zhì)粒pLV3-CMV-MCS-Puro載體、輔助質(zhì)粒pLP1、pLP2、pMD2.G和雞巨噬細(xì)胞（HD11）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。RNA-easy Isolation Reagent，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix和膠回收試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。大腸桿菌DH5α感受態(tài)和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。MTT試劑盒和嘌呤霉素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。SuperKineTM超敏型細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑（CCK8）購(gòu)自亞科因生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

在NCBI中查詢marco基因序列（Gene ID：395488），設(shè)計(jì)特異性引物marco-F：5′-cctccatagaa-gattATGAAAATTAAGGACAGATGCA-3′（小寫字母為XbaI酶切位點(diǎn)）和marco-R：5′-tccttcgcggccgcgTCAGACACACTCCACGCCGGCG-3′（小寫字母為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）。上述引物購(gòu)自南京擎科生物科技有限公司。

1.3 pLV3-CMV-MCS-Puro-marco重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

使用RNA-easy Isolation Reagent提取HD11細(xì)胞的總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以該cDNA為模板，用特異性引物擴(kuò)增marco的基因片段。將載體pLV3-CMV-MCS-Puro經(jīng)過(guò)雙酶切后進(jìn)行膠回收，與marco擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)重組酶Exnase II進(jìn)行同源重組連接。按照常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液PCR陽(yáng)性菌液挑選出來(lái)并送往公司測(cè)序，擴(kuò)大培養(yǎng)測(cè)序正確的菌液并提取質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒保存于-20℃冰箱。并將測(cè)序正確的重組慢病毒質(zhì)粒命名為pLV3-CMV-MCS-Puro-marco。

1.4 嘌呤霉素最適濃度選擇

通過(guò)MTT和CCK-8試驗(yàn)可以確定嘌呤霉素（0、 0.5、 1、 2 、 4、6、 8、 10 μg·mL-1）的最佳選擇濃度。結(jié)合MTT和CCK-8試驗(yàn)的結(jié)果，綜合評(píng)估細(xì)胞存活率和活力，并確定嘌呤霉素的最適濃度選擇。

1.5 慢病毒包裝

使用轉(zhuǎn)染試劑將重組慢病毒質(zhì)粒pLV3-CMV-MCS-Puro-marco及包裝輔助質(zhì)粒pLP1、pLP2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72 h后收集病毒上清液，保存在-80℃。

1.6 HD11-marco穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的篩選

將“1.5”中72 h后收集的慢病毒液感染HD11細(xì)胞。感染成功后添加嘌呤霉素篩選。每隔2 d更換一次新鮮的含有嘌呤霉素的培養(yǎng)液，直至細(xì)胞不出現(xiàn)死亡后停止篩選。

1.7 嘌呤霉素篩選后的鑒定

將通過(guò)嘌呤霉素篩選后的細(xì)胞進(jìn)行RT-qPCR鑒定，在基因水平檢測(cè)marco的表達(dá)情況，從而證明雞marco穩(wěn)轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞系的建立。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 軟件（version 20.0）對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性統(tǒng)計(jì)分析并以“Mean±SEM”表示，然后通過(guò)Excel GraphPad （Prism 6）軟件進(jìn)行作圖。其中，*表示Plt;0.05，差異顯著；**表示Plt;0.01，差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 成功構(gòu)建pLV3-CMV-MCS-Puro-marco慢病毒載體

以HD11細(xì)胞為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得marco基因編碼區(qū)序列，擴(kuò)增結(jié)果如圖1A所示，獲得一條1 430 bp大小的條帶，與預(yù)期一致。將marco基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收并與載體質(zhì)粒pLV3-CMV-MCS-Puro進(jìn)行重組，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞。提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒pLV3-CMV-MCS-Puro-marco經(jīng)Xha I、BamH I雙酶切鑒定顯示，可酶切出一條約1 430 bp大小的目的片段和一條約7 354 bp大小的載體片段，如圖1B所示。將構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank報(bào)道的marco序列一致，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功，質(zhì)粒圖譜如圖1C所示。

2.2 嘌呤霉素最適濃度的選擇

通過(guò)MTT和CCK-8試驗(yàn)，選擇HD11細(xì)胞篩選最佳的嘌呤霉素使用濃度。使用含有不同濃度嘌呤霉素（0、0.5、1、2、4、6、8、10 μg·mL-1）的培養(yǎng)基培養(yǎng)HD11細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，對(duì)培養(yǎng)基顏色和細(xì)胞密度進(jìn)行拍照觀察，結(jié)果如圖2A和2B所示，隨著嘌呤霉素濃度的增加，培養(yǎng)基顏色從黃色逐漸變紅，細(xì)胞密度逐漸下降，說(shuō)明細(xì)胞增殖和酸性代謝產(chǎn)物逐漸減少。并通過(guò)MTT和CCK-8試驗(yàn)對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2C和2D所示。通過(guò)MTT和CCK-8試驗(yàn)可以明顯的觀察到隨著嘌呤霉素的濃度增加，細(xì)胞存活率逐漸下降，當(dāng)嘌呤霉素濃度達(dá)到2 μg·mL-1以上時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡。綜上，HD11細(xì)胞嘌呤霉素篩選的最佳濃度是2 μg·mL-1。

2.3 慢病毒包裝與鑒定

將重組慢病毒質(zhì)粒pLV3-CMV-MCS-Puro-marco以及對(duì)照組質(zhì)粒pLV3-EGFP分別與pLP1、pLP2、pMD2.G 三個(gè)輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞。結(jié)果如圖3A所示，pLV3-EGFP質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染48 h后，可以明顯看到對(duì)照組的細(xì)胞狀態(tài)良好且熒光強(qiáng)，說(shuō)明慢病毒載體和輔助質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞中。收集轉(zhuǎn)染72 h后的慢病毒上清液，將收集的慢病毒上清液再次感染293T細(xì)胞，以確定慢病毒包裝是否成功。結(jié)果如圖3B所示，pLV3-EGFP慢病毒感染293T細(xì)胞24 h后，細(xì)胞狀態(tài)良好并且出現(xiàn)了弱熒光，證明慢病毒包裝成功。慢病毒感染48 h后，收集細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)marco的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3C所示，感染marco慢病毒顆粒的293T細(xì)胞中marco基因高表達(dá)，再次證明慢病毒包裝成功。

2.4 轉(zhuǎn)染marco HD11細(xì)胞系的篩選及鑒定

將收集的慢病毒上清液感染HD11細(xì)胞，在48 h后用熒光顯微鏡拍照，結(jié)果如圖4A所示，對(duì)照組出現(xiàn)微弱熒光，證明慢病毒轉(zhuǎn)染成功。通過(guò)“2.2”中的MTT和CCK-8的試驗(yàn)結(jié)果，選擇2 μg·mL-1的嘌呤霉素培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)染72 h后的細(xì)胞進(jìn)行篩選。連續(xù)用嘌呤霉素篩選1周后，結(jié)果如圖4B所示，對(duì)照組出現(xiàn)強(qiáng)烈的熒光現(xiàn)象，說(shuō)明我們成功構(gòu)建了marco穩(wěn)轉(zhuǎn)的HD11細(xì)胞。篩選結(jié)束后，收集穩(wěn)轉(zhuǎn)marco的細(xì)胞進(jìn)行RT-qPCR鑒定，結(jié)果如圖4C所示，與對(duì)照組相比，雞marco基因在慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)的HD11細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著增加。結(jié)果都證明成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)marco的HD11細(xì)胞系。

3 討 論

慢病毒包裝是目前應(yīng)用最廣泛的構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白細(xì)胞系的方法，該病毒包裝系統(tǒng)的基本原理是將攜帶目的基因的慢病毒載體整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，以實(shí)現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)久表達(dá)。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，同時(shí)也屬于復(fù)制缺陷型病毒，具有穩(wěn)定、高效等特點(diǎn)，是細(xì)胞分子生物學(xué)上用于篩選穩(wěn)定細(xì)胞系的理想工具［18-20］。近年來(lái)，隨著技術(shù)的進(jìn)步，慢病毒系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和應(yīng)用不斷優(yōu)化，特別是在提高基因傳遞效率和表達(dá)水平方面［21］。例如，改進(jìn)的第三代慢病毒包裝系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于基因治療和細(xì)胞治療研究中，其在基因傳遞效率和安全性方面表現(xiàn)優(yōu)越。這種系統(tǒng)通過(guò)改良的包裝質(zhì)粒和增強(qiáng)型的啟動(dòng)子，顯著提高了目的基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，為研究和臨床應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的工具［22-23］。

巨噬細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，其受體在免疫反應(yīng)、病原體識(shí)別和免疫調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，對(duì)巨噬細(xì)胞受體的研究揭示了其復(fù)雜的生物學(xué)功能和潛在的治療應(yīng)用。特別是marco作為清道夫受體的一種，其在免疫調(diào)節(jié)和疾病中的重要作用越來(lái)越受到關(guān)注。最新研究發(fā)現(xiàn)，marco在病原體識(shí)別中的功能超出了傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)。marco受體不僅在清除細(xì)菌和病毒中發(fā)揮作用，還涉及到調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。例如，marco能夠識(shí)別和結(jié)合多種病原體，包括細(xì)菌的細(xì)胞壁成分和某些病毒的外膜蛋白。這一功能對(duì)于免疫系統(tǒng)的初步反應(yīng)至關(guān)重要，尤其是在快速清除侵入病原體的過(guò)程中［24］。近年來(lái)的研究進(jìn)一步揭示了marco在慢性炎癥性疾病中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，marco在動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病等慢性炎癥疾病中表現(xiàn)出異常高的表達(dá)水平。這可能是因?yàn)閙arco在清除細(xì)菌或其他病原體時(shí)導(dǎo)致了過(guò)度的炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)了疾病的發(fā)生和進(jìn)展。例如，在動(dòng)脈粥樣硬化中，marco的過(guò)表達(dá)可能促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的激活和炎癥因子的釋放，進(jìn)一步加劇了血管內(nèi)的炎癥［25-26］。此外，marco在腫瘤微環(huán)境中的作用也引起了廣泛關(guān)注。研究表明，marco的表達(dá)水平與腫瘤的進(jìn)展和免疫逃逸機(jī)制密切相關(guān)。特別是在某些類型的腫瘤中，marco的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸能力增強(qiáng)相關(guān)，可能通過(guò)抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)來(lái)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。針對(duì)marco的免疫治療研究正在逐步展開(kāi)，以期通過(guò)靶向marco來(lái)恢復(fù)或增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)［27-28］。

本研究通過(guò)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)marco的HD11細(xì)胞系，并驗(yàn)證了該細(xì)胞系中marco在mRNA水平上的表達(dá)情況。穩(wěn)定表達(dá)marco的HD11細(xì)胞系的構(gòu)建對(duì)于深入了解marco在免疫反應(yīng)、病原體感染和免疫調(diào)控中的作用機(jī)制具有重要的意義。

4 結(jié) 論

本研究利用慢病毒包裝技術(shù)構(gòu)建了雞巨噬細(xì)胞marco基因過(guò)表達(dá)方法，篩選獲得了marco基因過(guò)表達(dá)的雞巨噬細(xì)胞細(xì)胞株，為marco基因功能的研究提供了細(xì)胞模型。

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（編輯 郭云雁）