大青葉水提物對牛傳染性鼻氣管炎病毒的體外增殖抑制活性評價

摘 要： 旨在探究大青葉水提物對牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus， IBRV）體外增殖抑制活性，為臨床治療IBRV感染提供新的參考依據(jù)。通過細胞增殖檢測試劑盒（CCK-8）和噻唑藍（MTT）法，結合細胞病變（cytopathic effect， CPE）法確定大青葉水提物對牛腎細胞（Madin-Darby bovine kidney cells， MDBK）的毒性作用，測得藥物對細胞的最大安全濃度；將藥物最大安全濃度以二倍稀釋法稀釋3個梯度，通過MTT法和CCK-8法檢測大青葉水提物在不同給藥方式下對IBRV的抑制活性；計算細胞存活率、藥物有效抑制率、藥物半數(shù)中毒濃度（50%cytotoxic concentration， CC50）和藥物半數(shù)有效濃度（50% effective drug concentration， EC50），并以治療指數(shù)（therapeutic index， TI）作為評價指標；通過病毒滴度、實時熒光定量PCR和免疫熒光染色法進一步確定大青葉水提物對IBRV增殖的抑制作用。結果表明，大青葉水提物對MDBK細胞的最大安全濃度為0.8 μg·μL―1，半數(shù)中毒濃度（CC50）為1.937 μg·μL―1，在最大安全濃度范圍內(nèi)藥物濃度越高抑制效果越好；大青葉水提物在不同給藥方式對IBRV均有抑制作用，

中藥和病毒預先作用、先接種病毒后加中藥及先加中藥后接種病毒三種給藥方式的

EC50分別為0.292 8、0.350 1、0.416 1 μg·μL―1，相應的TI分別為6.615 4、5.532 7、4.655 1；通過病毒滴度、實時熒光定量PCR和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，在中藥和病毒預先混合作用下，病毒感染36 h藥物對病毒抑制作用最顯著。大青葉水提物有較好的抗IBRV活性，研究結果可為大青葉水提物在獸醫(yī)臨床應用和深入開發(fā)提供科學依據(jù)。

關鍵詞： 大青葉水提物；牛傳染性鼻氣管炎病毒；體外抗病毒；實時熒光定量PCR；免疫熒光染色

中圖分類號： S853.74；R978.7

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-5287-12

收稿日期：2024-01-11

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金杰出青年科學基金項目（2024D01E05）

作者簡介：馮 琦（1998-），女，新疆克拉瑪依人，碩士生，主要從事動物保健與畜產(chǎn)品質(zhì)量安全研究，E-mail：fengqi0103@163.com

*通信作者：馬雪連，主要從事動物保健與畜產(chǎn)品質(zhì)量安全研究，E-mail：13699381790@163.com；姚 剛，主要從事動物保健與畜產(chǎn)品質(zhì)量安全研究，E-mail：yg@xjau.edu.cn

Evaluation of the Inhibitory Activity of Folium Isatidis Aqueous Extract on the

in vitro Proliferation of Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus

FENG Qi1，2， LIU Yigang1，2， HE Qin1，2， LI Zelong1，2， MA Yingcai1，2， YI Pengfei1，2， LI Na1，2， SUN Yawei1，2， CHEN" Rulong3， YAO Gang1，2*， MA Xuelian1，2*

（1.College of Veterinary Medicine， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052，" China;

2.Xinjiang Key Laboratory of New Drug Research and Creation for Herbivores， Urumqi 830052，

China;

3.Xinjiang Tianlai Breeding Limited Liability Company， Bole 833400，" China）

Abstract：" We aimed to investigate the inhibitory activity of Folium Isatidis aqueous extract on the in vitro proliferation of infectious bovine rhinotracheitis virus （IBRV）， and to provide new reference data for the clinical treatment of IBRV infection. The cytotoxic effects of Folium Isatidis aqueous extract on Madin-Darby bovine kidney （MDBK） cells were assessed using cell counting kit-8 （CCK-8） and MTT assays， alongside the cytopathic effect （CPE） method， to establish the maximum safe concentration （MSC）. The MSC was subsequently diluted in a three-step， two-fold serial dilution to evaluate the extract’s inhibitory action on IBRV through both MTT and CCK-8 assays across various administration modes. Metrics such as cell viability， drug efficacy， 50% cytotoxic concentration （CC50）， and 50% effective concentration （EC50） were calculated， employing the Therapeutic Index （TI） as a principal evaluative criterion. The inhibitory effect of Folium Isatidis aqueous extract on the proliferation of IBRV was further confirmed by viral titration， real-time quantitative PCR， and immunofluorescence assays. The findings indicate that the MSC of Folium Isatidis aqueous extract on MDBK cells is 0.8 μg·μL―1， with a CC50 of 1.937 μg·μL―1. The antiviral efficacy enhances with increasing concentrations within the MSC range. The extract exhibited significant inhibitory effects on IBRV across different administration modes，

pre action of medicine and virus， inoculate virus first and then add medicine， add medicine first and then inoculate virus，

with EC50 values of 0.292 8， 0.350 1， and 0.416 1 μg·μL―1， respectively， and corresponding TIs of 6.615 4， 5.532 7， and 4.655 1. Notably， the maximal viral suppression was observed at 36 hours post-infection when the extract was pre-mixed with the virus， as evidenced by real-time fluorescence quantitative PCR and immunofluorescence staining. The aqueous extract of Folium Isatidis demonstrates potent anti-IBRV activity， providing a scientific foundation for its clinical application and further development in veterinary medicine. This study contributes valuable insights into the antiviral properties of Folium Isatidis， underscoring its potential as a therapeutic agent against IBRV infections.

Key words： Folium Isatidis aqueous extract; infectious bovine rhinotracheitis virus （IBRV）; in vitro antiviral; real-time fluorescent quantitative PCR; immunofluorescence staining

*Corresponding authors：" MA Xuelian， E-mail： 13699381790@163.com; YAO Gang， E-mail： yg@xjau.edu.cn

牛傳染性鼻氣管炎（infectious bovine rhinotracheitis， IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus， IBRV）引起的一種導致多系統(tǒng)感染的接觸性傳染病。IBR的主要傳播源是感染牛和帶毒動物，其臨床上癥狀包括呼吸道感染，結膜炎，流產(chǎn)，外陰陰道炎，龜頭炎［1］。該病毒通過空氣，直接接觸，交配，人工授精等途徑，經(jīng)呼吸道黏膜、生殖道黏膜、眼結膜傳播［2］。感染牛通常呈隱性感染，坐骨神經(jīng)和三叉神經(jīng)是IBRV潛伏的主要部位。牛一旦感染IBRV，可終身攜帶病毒，極易受到繼發(fā)性細菌感染，導致混合感染并加重臨床癥狀。IBRV通過呼吸道分泌物和感染公牛的精液排出，其復制周期短，穩(wěn)定性強，導致感染后牛群長期排毒，進而引發(fā)大規(guī)模感染［3］。IBR最早于1954年在美國科羅拉多州發(fā)現(xiàn)，隨后傳播至整個歐洲。1980年，在我國首次從新西蘭進口牛中分離出IBRV。鑒于其嚴重影響，IBR被世界動物衛(wèi)生組織（World Organization for Animal Health， WOAH）列為需要上報疫病，并在我國進出口檢疫中被強制檢疫［4］。近年來，IBR在國內(nèi)養(yǎng)牛場內(nèi)流行范圍擴大，嚴重影響牛的生產(chǎn)性能，對我國養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展構成長期威脅［5］。

大青葉（Folium Isatidis），作為我國傳統(tǒng)中藥的重要組成部分，來源于十字花科植物菘藍（Isatis tinctoria L）的干燥葉片，其性寒味苦，歸心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、涼血利咽的功效，主治溫病發(fā)熱，頭痛，發(fā)斑疹，咽喉腫痛等癥狀［6］。在抗菌方面，研究顯示大青葉中的天然化合物，由于其長支鏈和平面結構的特點，易于與細菌結合，發(fā)揮抑菌的作用［7］。在抗病毒方面，臨床研究表明大青葉在治療流行性感冒、急性傳染性肝炎、流行性腮腺炎、流行性乙型腦炎及單純皰疹病毒性角膜炎等病毒性疾病中顯示出顯著效果［8］。對流行性感冒病毒的預防、直接抑制和治療作用的有效抑制率分別為40%、87%和87%，這一結果證實了大青葉具有顯著的抗流行性感冒病毒活性［9］。此外，研究還表明大青葉的活性成分能抑制Hep-2細胞中呼吸道合胞病毒的生物合成，安全有效地抑制其在Hep-2細胞中的增殖［10］。大青葉還可與其他中草藥協(xié)同作用，如中成藥板藍大青片，通過清熱解毒、涼血消腫等作用，用于治療病毒性疾病和肺胃熱所致的咽喉腫痛、口咽干燥、面頰浮腫等癥狀［11］。因其廣泛的應用，大青葉具有極高的研究價值。

在抗IBRV研究領域，先前的研究成果顯著，通過系統(tǒng)性篩選眾多中草藥，發(fā)現(xiàn)包括大青葉在內(nèi)的5種中草藥對IBRV顯示出了顯著的抗病毒活性［12］。這一發(fā)現(xiàn)不僅展示了大青葉在對抗病毒感染方面的潛在價值，而且特別在預防和治療IBR方面，揭示了其重要的應用潛力。鑒于此，本研究旨在深入探究大青葉水提物對IBRV的體外抗病毒效果，為評估其在實際臨床應用和進一步的藥物開發(fā)中的可行性和有效性提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物來源

大青葉水提物（Folium Isatidis aqueous extract）來自安徽黃山，由扶風斯諾特生物科技有限公司鑒定、提供（表1）。

1.1.2 主要試劑及儀器

MDBK細胞購自中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心細胞庫，IBRV病毒株（AV21）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司，DMEM高糖培養(yǎng)基和青/鏈霉素雙抗購自Biological Industries公司，IBRV病牛陽性血清為實驗室制備和保存，兔抗牛IgG抗體（rabbit anti-bovine IgG Hamp;L/FITC）購自北京博奧森生物技術有限公司，CCK-8試劑盒購自Proteintech公司，MTT試劑盒購自Solarbio公司。細胞培養(yǎng)箱（Galaxy 170 R）、高速離心機和移液器均購自Eppen-dorf公司，醫(yī)用凈化工作臺（YJ-875）購自蘇州凈化設備公司，酶聯(lián)免疫檢測儀（INFINITE 200 PRO）購自TECAN公司，普通光學顯微鏡（AE31E）和共聚焦顯微鏡（AXR）購自Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物最大安全濃度及半數(shù)中毒濃度（50% cytotoxic concentration， CC50）確定

在96孔板上培養(yǎng)MDBK細胞，每孔加入含有10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基100 μL，細胞在37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，分別加入經(jīng)2倍稀釋法制備的大青葉水提物，形成6個不同的濃度梯度：6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 μg·μL-1，每個濃度設置6個重復，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察細胞病變（cytopathic effect， CPE）情況，待CPE不再變化時，棄原液后用PBS洗滌兩遍。利用CCK-8法和MTT法，分別在450和490 nm波長下，通過酶聯(lián)免疫吸附測定儀測定各孔的吸光度（optical density， OD），基于此數(shù)據(jù)計算細胞的存活率。最大安全濃度選定為細胞存活率與對照組相比無顯著下降的最高藥物濃度，可排除藥物本身的毒性作用對細胞的損傷。CC50為致50%細胞發(fā)生病變的藥物濃度，通過GraphPad PrismTM軟件計算大青葉水提物對MDBK細胞的CC50。

細胞存活率（%）=試驗加藥組OD值-空白對照組OD值細胞對照組OD值-空白對照組OD值×100。

1.2.2 IBRV的半數(shù)細胞培養(yǎng)感染劑量（50% tissue culture infective dose， TCID50）測定

將MDBK細胞消化并稀釋成1×105·mL―1細胞密度，接種于96孔板中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞的密度為70%～80%時棄原培養(yǎng)液，加入用培養(yǎng)液按10倍梯度稀釋IBRV病毒液，每孔100 μL，同時設細胞對照組，37 ℃，5%CO2孵育2 h，棄病毒液，加入2%FBS的細胞培養(yǎng)液，每孔100 μL，每日觀察并記錄出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，采用Reed-Muench法計算病毒的TCID50。

1.2.3 藥物抗病毒活性測定

在96孔板中培養(yǎng)MDBK細胞，待細胞長成單層時，按試驗分組：中藥和病毒預先作用、先攻毒后加中藥和先加中藥再攻毒，通過CCK-8法和MTT法檢測細胞活力，利用分析軟件計算藥物半數(shù)有效濃度（50% effective drug concentration， EC50），以治療指數(shù)（therapeutic index， TI）作為主要評價指標，對TI指數(shù)最高的給藥方式，通過病毒滴度、實時熒光定量PCR和免疫熒光染色試驗進一步確定大青葉水提物對IBRV增殖的抑制作用。

TI=CC50EC50

1.2.3.1 中藥和病毒預先作用：

將藥物以最大安全濃度采用二倍稀釋法稀釋成4個濃度，用100 TCID50病毒液與等量藥物稀釋液混合，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，取100 μL加入預先制備好的細胞96孔板作為試驗加藥組，細胞對照組加入等量DMEM無血清培養(yǎng)基，病毒感染組僅加入100 TCID50病毒液，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)2 h，棄上清液，PBS洗滌2遍，加入2%FBS的細胞培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每12 h觀察并記錄CPE。孵育48 h后，用PBS洗滌96孔板，方法同“1.2.1”測定每孔細胞OD值，利用分析軟件計算藥物半數(shù)有效濃度（EC50）。

1.2.3.2 先接種病毒后加中藥：

將藥物以最大安全濃度采用二倍稀釋法稀釋成4個濃度，將100 TCID50的病毒液分別加入試驗加藥組及病毒感染組細胞的96孔板內(nèi)，每孔100 μL，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培育2 h后，棄病毒液，PBS洗滌2遍，每孔加100 μL藥物稀釋液，培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，每隔12 h觀察并記錄CPE，細胞對照組加入2%FBS的細胞培養(yǎng)液。孵育48 h后，用PBS洗滌96孔板，方法同“1.2.1”測定每孔細胞OD值，利用分析軟件計算藥物半數(shù)有效濃度（EC50）。

1.2.3.3 先加中藥后接種病毒：

將藥物以最大安全濃度采用二倍稀釋法稀釋成4個濃度，試驗加藥組細胞接種不同稀釋度的藥物，細胞對照組及病毒感染組加入等量DMEM無血清培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，后棄上清液，PBS洗滌2遍，試驗加藥組及病毒感染組均加入100 TCID50病毒液，每孔100 μL，細胞對照組加入等量DMEM無血清培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，棄去病毒液，PBS洗滌2遍，加入2%FBS的細胞培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每12 h觀察并記錄CPE情況，孵育48 h后，用PBS洗滌96孔板，方法同“1.2.1”測定每孔細胞OD值，利用分析軟件計算藥物半數(shù)有效濃度（EC50）。

1.2.3.4 3種不同給藥方式下IBRV病毒滴度的測定：

將藥物以最大安全濃度采用二倍稀釋法稀釋成4個濃度，按照3種不同給藥方式分別與IBRV作用48 h后，吸取上清病毒液，分別將IBRV病毒液連續(xù)10倍稀釋，并將各稀釋度的病毒液接種于長滿單層細胞的96孔板中，設正常細胞對照組和病毒對照組。逐日觀察細胞病變，記錄病變孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法，計算病毒的TCID50。

1.2.3.5 實時熒光定量PCR檢測中藥與病毒預先作用對病毒活性影響的時間依賴性：

在本研究的前期試驗中，通過3種不同的給藥方式（大青葉水提物與病毒預先混合、先接種病毒后加入中藥、先加入中藥后接種病毒）評估了大青葉水提物對IBRV的抑制效果。結果顯示，大青葉水提物的最大安全濃度（0.8 μg·μL-1）與病毒預先混合的處理方式展示出最佳的療效（TI指數(shù)最高）?；谶@一發(fā)現(xiàn)，本研究進一步采用實時熒光定量PCR方法，以更精確地評估大青葉水提物在與IBRV預先混合后對病毒活性影響的時間依賴性。用100 TCID50病毒液與0.8 μg·μL-1藥物稀釋液混合，37 ℃，5%CO2作用4 h后加入單層細胞的細胞培養(yǎng)皿中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)2 h，棄上清液，PBS洗滌2遍，加入2%FBS的細胞培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，收集混合液作用后6、12、24、36、48 h的細胞樣本，利用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒，按照說明書提取細胞DNA，使用實時熒光定量PCR方法檢測IBRV的DNA拷貝數(shù)。試驗中使用的PCR引物序列：F：5′-CTCTACCGCACGGGCACCT-3′，R：5′-GCGGCTCTCGTCTCGCA-3′，引物由有康生物公司合成。

1.2.3.6 免疫熒光染色法評估中藥與IBRV預先作用對病毒增殖抑制的效果：

將細胞爬片鋪至35 mm細胞培養(yǎng)皿，接種MDBK細胞，置于37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，待細胞密度達到60%，加入預先孵育好的100 TCID50病毒液與0.8 μg·μL-1藥物稀釋液的混合液，2 h后棄去含有混合液的培養(yǎng)液，用PBS洗滌3遍，加入2%FBS的細胞培養(yǎng)液；待處理36 h后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌3遍，3 min·次-1；加入4%多聚甲醛室溫固定15 min，吸棄固定液，PBS洗滌3次，5 min·次-1；加入0.5%TritionX-100（PBS配制）室溫通透20 min，PBS洗滌3次，5 min·次-1；加入2%BSA室溫封閉1 h，PBS洗滌3次，5 min·次-1；加入陽性血清，用PBS按1∶200稀釋，4 ℃避光過夜，PBS洗滌3次，5 min·次-1；加二抗Rabbit Anti-Bovine IgG Hamp;L/FITC，用PBS按1∶500稀釋，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗滌3次，5 min·次-1；加入DAPI細胞核染液，避光孵育5 min；使用抗熒光衰減封片劑封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察結果。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用GraphPad PrismTM軟件對試驗所得數(shù)據(jù)進行分析并作圖，采用one-way ANOVA法進行多組間差異分析，兩組間比較用Dunnett法。圖中*表示差異顯著（P＜0.05）；**表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結 果

2.1 正常MDBK細胞和IBRV誘導MDBK細胞病變

在培養(yǎng)24 h后，正常MDBK細胞保持了清晰的輪廓和貼壁生長特性。而接種IBRV的MDBK細胞在同一時間段內(nèi)表現(xiàn)出明顯的形態(tài)學改變，具體表現(xiàn)為細胞間的“拉網(wǎng)”現(xiàn)象和葡萄串樣的形態(tài)改變，這是IBRV感染的典型CPE情況。

2.2 大青葉水提物在MDBK細胞上的最大安全濃度

根據(jù)CCK-8法和MTT法分別計算出細胞存活率，來確定藥物的最大安全濃度，并經(jīng)過GraphPad PrismTM軟件計算藥物的半數(shù)中毒濃度。由CCK-8法和MTT法可知，大青葉水提物對MDBK細胞的最大安全濃度為0.8 μg·μL-1，其對應的半數(shù)中毒濃度是1.937 μg·μL-1。

2.3 病毒的TCID50測定

根據(jù)Reed-Muench法計算得到IBRV對MDBK的TCID50為10-6.33·0.1 mL-1，表示將原IBRV病毒液稀釋106.33倍后接種100 μL于MDBK細胞可使50%的細胞發(fā)生明顯的細胞病變。

2.4 大青葉水提物不同給藥方式抗病毒試驗

2.4.1 中藥和病毒預先作用

CPE觀察法的結果顯示（圖1A、1B），與病毒感染組相比，試驗加藥組的細胞空泡化、拉網(wǎng)、變圓等病理現(xiàn)象有所減輕。CCK-8和MTT檢測法的結果表明（圖1C、1D），當大青葉水提物濃度為0.1～0.8 μg·μL-1時，與病毒感染組相比細胞存活率顯著提高（P＜0.05），表明在這一濃度范圍內(nèi)大青葉水提物表現(xiàn)出明顯的抗病毒活性。通過分析軟件計算得出，在藥物濃度為0.8 μg·μL-1時，半數(shù)有效濃度（EC50）為0.292 8 μg·μL-1，治療指數(shù)（TI）為6.615 4。

2.4.2 先接種病毒后加中藥

CPE觀察法的結果表明（圖2A、2B），相比于病毒感染組，試驗加藥組細胞的病變程度呈現(xiàn)出一定的變化。CCK-8和MTT檢測結果顯示（圖2C、2D），在0.1～0.8 μg·μL-1的大青葉水提物濃度范圍內(nèi)，試驗加藥組的細胞存活率顯著高于病毒感染組（P＜0.05），表明在這一濃度范圍內(nèi)大青葉水提物表現(xiàn)出明顯的抗病毒活性。通過分析軟件得出，在藥物濃度為0.8 μg·μL-1時半數(shù)有效濃度（EC50）為0.350 1 μg·μL-1，治療指數(shù)（TI）為5.532 7。

2.4.3 先加中藥后接種病毒

CPE觀察法的結果顯示（圖3A、3B），在試驗加藥組中，相比于病毒感染組，細胞病變的程度出現(xiàn)了明顯的變化。CCK-8和MTT試驗結果顯示（圖3C、3D），加藥組在大青葉水提物濃度為0.1～0.8 μg·μL-1時與病毒對照組相比差異顯著（P＜0.05），表明在這一濃度范圍內(nèi)大青葉水提物表現(xiàn)出明顯的抗病毒活性。通過分析軟件得出，在藥物濃度為0.8 μg·μL-1時半數(shù)有效濃度（EC50）為0.416 1 μg·μL-1，治療指數(shù)（TI）為4.655 1。

2.4.4 3種給藥方式對IBRV病毒滴度的影響

大青葉水提物在3種不同給藥方式下，計算大青葉水提物在0.1、0.2、0.4、0.8 μg·μL-1濃度時的病毒滴度，如表2所示，3種給藥方式下病毒滴度TCID50與病毒對照組相比均出現(xiàn)一定的下降，其中大青葉水提物和病毒預先作用的方式下的病毒滴度最小。

2.4.5 中藥與病毒預先作用的方式下對不同時間段的病毒含量的影響

在不同時間段（6、12、24、36、48 h）大青葉水提物與IBRV預先作用的試驗中，與單純IBRV病毒感染組相比，發(fā)現(xiàn)在36 h后，試驗加藥組中CPE表現(xiàn)有所減少（圖4A）。這一發(fā)現(xiàn)得到了實時熒光定量PCR檢測結果的支持（圖4B），結果顯示，在藥物與病毒預先作用后的36 h，試驗加藥組的病毒含量顯著低于病毒感染組（P＜0.05）。

2.4.6 免疫熒光染色檢測中藥與病毒預先作用對IBRV增殖的抑制作用

為更直觀的觀察IBRV在MDBK細胞中的增殖情況，采用免疫熒光法進一步探究中藥與病毒預先混合的方式下對IBRV的抑制活性。如圖5所示，IBRV呈現(xiàn)綠色特異性熒光，在藥物作用后的36 h，綠色熒光明顯減少，表明該給藥方式能夠有效抑制IBRV毒株的增殖。

3 討 論

IBR是由IBRV引起的急性熱性接觸性傳染?。?3-14］。IBRV是水痘病毒屬的成員，屬于皰疹病毒科阿爾法皰疹病毒亞科。其基因組由雙鏈DNA組成，編碼約70種蛋白質(zhì)，包括33種已知的結構蛋白和15種非結構蛋白，IBRV的糖蛋白在其病毒顆粒表面的包膜中，扮演著發(fā)病機制和免疫反應中的關鍵角色［2］。IBRV可分為多個亞型［2］，與3種主要臨床癥狀相關：IBR、傳染性膿皰性外陰陰道炎（infectious pustular vulvovaginitis， IPV）和傳染性膿皰性龜頭包皮炎（infectious pustular balanoposthitis， IPB）。IBR表現(xiàn)為亞臨床、輕度或重度疾病，發(fā)病率接近100%，主要感染途徑是鼻腔，通過吸入含有病毒的氣溶膠引發(fā)呼吸道感染，其臨床表現(xiàn)根據(jù)宿主和病毒株而異，輕度病例表現(xiàn)為鼻腔和眼部出現(xiàn)漿液性分泌物、發(fā)熱、食欲不振、呼吸頻率增加；而重度病例中，可出現(xiàn)呼吸困難、持續(xù)劇烈咳嗽、腹瀉和流產(chǎn)等癥狀［15］。目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的針對性治療藥物，臨床上常采用抗生素聯(lián)合治療，但這種治療方式容易導致耐藥性，并可能引起抗生素殘留。在當前減抗的大背景下，尋找新的治療方式尤為重要。

近年來，隨著非典、新冠病毒、甲型流感等一系列疫情的暴發(fā)，清熱解毒中藥一度成為關注的熱點，而大青葉是十字花科植物菘藍的干燥葉﹐具有清熱、解毒、涼血、止血的功效，自古以來一直被視為清熱解毒的重要草藥。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，大青葉具有抗病原微生物、抗內(nèi)毒素、抗炎、調(diào)節(jié)免疫細胞分泌IL-2、TNF-α及提高細胞免疫功能等作用［9］。在抗病毒方面，大青葉主要用于防治流行性感冒、流行性乙型腦炎，同時對小鼠病毒性心肌炎病毒、腮腺炎病毒、皰疹病毒也具有抑制作用［16］。研究發(fā)現(xiàn)，大青葉中分離出的四個成分（I～IV）在體外對多種RNA和DNA病毒具有抗病毒活性，即甲型流感病毒（influenza A virus， IAV）、柯薩奇病毒B3（coxsackievirus group B type 3， CVB3）、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus， RSV）和7型腺病毒（adenovirus-7， ADV-7）；通過小鼠模型驗證，口服高劑量200 mg·（kg·d）-1的大青葉乙酸乙酯提取物能顯著降低病毒感染導致的發(fā)病率和死亡率［11］。徐濤［17］研究發(fā)現(xiàn)，大青葉的單體成分具有明顯的阻斷IAV吸附的作用，并在72 h內(nèi)可以抑制其增殖。

本研究中采用實時熒光定量PCR檢測IBRV在細胞內(nèi)的增殖情況，結果表明，經(jīng)大青葉水提物處理的細胞在24 h后顯示出病毒拷貝數(shù)的顯著降低，特別是36 h時用藥組的病毒拷貝數(shù)顯著低于病毒對照組，對病毒的抑制作用明顯，然而，隨著時間的延長至48 h，這種抑制效果呈現(xiàn)出逐漸減弱的趨勢。這一結果與徐濤的研究發(fā)現(xiàn)存在一定差異，這種差異可能源于使用的藥物和病毒種類的不同。

在進行藥物體外試驗時，確定最大安全濃度是一個關鍵步驟，它確保了試驗在不對細胞造成毒性影響的條件下進行，這一指標對于評估藥物的安全性和有效性至關重要［18］。此前已有IBRV誘導MDBK細胞線粒體損傷模型的研究［19］。在本研究中，評估了大青葉水提物對MDBK細胞的影響，以確定其最大安全濃度。在這一過程中，細胞吸光度值（optical density， OD）作為重要的評價指標，提供了反映活細胞數(shù)的關鍵信息［20］。OD值與細胞生長密切相關，較高的OD值指示細胞的活性增強，此指標對于理解藥物對細胞影響的程度至關重要。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)在0.8 μg·μL-1濃度下處理的MDBK細胞展現(xiàn)出較高的OD值，同時在該濃度下的OD值與細胞對照組相比無顯著差異，這說明在此濃度下，大青葉水提物對細胞沒有明顯的毒性作用，因此可以確定該濃度為MDBK細胞的最大安全濃度；然而，當大青葉水提物的濃度超過0.8 μg·μL-1時，MDBK細胞的OD值下降，這表明細胞生長受到抑制。這一結果表明，超過此濃度的大青葉水提物可能對宿主細胞產(chǎn)生不良影響，強調(diào)在藥物開發(fā)和臨床應用中精準確定最大安全濃度的重要性。通過在此濃度范圍內(nèi)進行體外試驗，可以最大限度地減少對細胞的毒性風險，同時評估藥物的潛在療效。

此外，中草藥在抗病毒方面的作用可分為直接和間接兩種機制。直接抗病毒作用通過阻斷或干擾病毒復制周期中的關鍵環(huán)節(jié)以抑制病毒的增殖；而間接抗病毒作用則通過免疫調(diào)節(jié)或干擾細胞凋亡等方式來發(fā)揮作用。在本研究中，選擇的中草藥為菘藍，其干燥根部即為板藍根，干燥葉片則為大青葉［21］，這兩者均以清熱解毒、涼血消斑和利咽止痛等功效著稱［22］。在直接抗病毒方面，有研究發(fā)現(xiàn)從板藍根中提取的單體成分可以通過直接滅活病毒從而在體外顯示出強大的直接抗病毒作用來抑制偽狂犬病病毒和SARS冠狀病毒感染［23］。而板藍根多糖則通過調(diào)節(jié)TLR-3信號傳導和IL-2和IFN-γ等免疫因子來實現(xiàn)間接抗病毒作用［24］。在本研究中，測試了大青葉水提物在最大安全濃度范圍內(nèi)的4個不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.8 μg·μL-1），探究其對IBRV的抑制作用，試驗采用3種不同的給藥方式：1）大青葉水提物和病毒同時作用細胞后移除；2）先接種病毒后再加大青葉水提物；3）先于大青葉水提物處理細胞，隨后接種病毒。試驗結果表明，大青葉水提物在3種給藥方式下均展現(xiàn)出一定的抗病毒活性，其半數(shù)有效濃度（EC50）分別為0.292 8、0.350 1、0.416 1 μg·μL-1，治療指數(shù)（TI）分別為6.615 4、5.532 7、4.655 1。治療指數(shù)反應了藥物抗病毒的潛力［25］，這表明大青葉水提物在體外具有良好的抗病毒活性。這一結論得到了病毒滴度結果的證實，尤其在中藥與病毒預先作用的給藥方式下效果最為顯著。免疫熒光的結果進一步表明，感染IBRV的大青葉水提物處理后的MDBK細胞中病毒復制明顯減少，證實該給藥方式下大青葉水提物在體外能有效抑制IBRV復制。而皰疹病毒在內(nèi)的幾乎所有病毒的增殖過程都包括吸附、穿入、復制、釋放，所以抑制增殖過程中的任何一個階段都可能抑制病毒的感染。在體外抗皰疹病毒的研究中，楊梅素在體外抑制偽狂犬病毒（pseudo rabies virus， PRV）的直接殺傷作用效果最顯著［26］。張淼丹等［27］的研究也發(fā)現(xiàn)，綠原酸具有直接殺滅豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的效果，有效抑制該病毒復制的結果。這與本試驗結果一致，這些發(fā)現(xiàn)提示大青葉可能對IBRV的某些特定結構或生命周期階段特別敏感，能夠快速滅活病毒。這需要進一步研究大青葉抗IBRV的具體活性成分。

IBRV的感染主要通過其關鍵糖蛋白gB、gC、gD和gE來實現(xiàn)對宿主細胞的吸附和侵入。已有研究指出，中草藥的加入可以干擾病毒蛋白質(zhì)的合成過程，從而抑制病毒的感染和復制［28］。因此大青葉水提物可能通過影響跨膜和細胞內(nèi)的信號傳導過程，調(diào)節(jié)病毒表達。在本研究中，大青葉水提物在不同的給藥方式下表現(xiàn)出不同的效果，這提示其作用機制的多樣性和復雜性，所以大青葉水提物的具體抗病毒機制仍需要深入研究。

4 結 論

本試驗通過3種不同的給藥方式：大青葉水提物與病毒預先作用，先接種病毒后加入中藥，以及先加入中藥后接種病毒，全面評估大青葉水提物的體外抗IBRV效果。試驗結果表明，大青葉水提物能夠有效抑制IBRV體外復制，為臨床防治IBRV提供新的理論依據(jù)。然而，關于大青葉水提物中的有效抗病毒成分及其具體作用機制，目前尚不完全明確，仍需深入研究。

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（編輯 白永平）