cGAS穩(wěn)定表達細胞系的構建及功能鑒定

摘 要： 天然免疫系統(tǒng)會在病毒入侵機體后的第一時間對其進行識別，并合成分泌I型干擾素和炎癥因子等細胞因子參與宿主抗病毒免疫反應。天然免疫應答的啟動主要通過機體自身表達的模式識別受體對病毒來源的病原相關分子模式的識別來實現(xiàn)。cGAS是目前最公認的胞質(zhì)DNA受體，在各種類型的細胞和組織中廣泛表達。豬腎細胞PK-15是豬病毒性疾病研究過程中應用十分廣泛的工具細胞，然而本研究前期的轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)顯示，PK-15細胞中cGAS的轉(zhuǎn)錄水平極低，蛋白水平幾乎檢測不到PK-15細胞系中cGAS的表達，這極大程度的限制了PK-15細胞在豬病毒性疾病感染與免疫機制探究中的應用。本研究旨在構建一株穩(wěn)定表達cGAS的PK-15細胞系。通過慢病毒包裝系統(tǒng)，將cGAS基因整合到靶細胞基因組，經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選，獲得能夠穩(wěn)定表達cGAS的PK-15細胞系，并以豬偽狂病病毒（porcine pseudorabies virus， PRV）和豬細小病毒（porcine parvovirus， PPV）為模式病毒，對cGAS在抗DNA病毒感染過程中的作用進行了驗證。結(jié)果表明，cGAS基因成功整合到宿主細胞PK-15基因組，重組細胞系PK-15-cGAS能夠穩(wěn)定表達cGAS蛋白；PRV和PPV感染PK-15-cGAS細胞能誘導產(chǎn)生更高水平的干擾素相關基因，在PK-15-cGAS細胞中PRV和PPV的復制受到明顯抑制。這些結(jié)果表明，穩(wěn)定表達cGAS的PK-15細胞系構建成功，它可用于豬病毒性疾病感染與免疫機制相關探究，為后續(xù)探究該類病毒免疫逃逸機制提供了良好的試驗材料。

關鍵詞： cGAS；PK-15；穩(wěn)定細胞系；慢病毒包裝系統(tǒng)

中圖分類號： S855.3

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-5317-08

收稿日期：2024-01-03

基金項目：國家重點研發(fā)計劃青年科學家項目（2022YFD1801300）；國家自然科學基金項目（32102655；32272987）

作者簡介：趙呈彥（2001-），男，河南新鄉(xiāng)人，學士，主要從事動物免疫學研究，E-mail： zcy1046483909@163.com

*通信作者：何文瑞，致力于重大動物疫病非洲豬瘟的基礎研究和應用基礎研究工作，主要從事非洲豬瘟病毒的感染、免疫和致病機制研究， E-mail：wrhe0111@163.com

Construction and Functional Identification of Cell Lines Stably Expressing cGAS

ZHAO" Chengyan1， REN" Haojie1， WAN" Bo1，2， WEI" Zhanyong2， HE" Wenrui1，2*

（1.International Joint Research Center of National Animal Immunology， College of

Veterinary Medicine， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046，" China;

2.Ministry of Education Key Laboratory for Animal Pathogens and

Biosafety， Zhengzhou 450046，" China）

Abstract：" The pathogenic microorganisms can be sensed and recognized by innate immune system once invaded the animals. And the sensing of conserved structural components called pathogen-associated molecular patterns （PAMPs） by pattern recognition receptors （PRRs） of the hosts activates a series of signaling events， leading to induction of downstream antiviral effector proteins including type I interferons （IFNs） and proinflammatory cytokines to clear the invaders. The nucleotidyltransferase GMP-AMP （cGAMP） synthase （cGAS） is ubiquitously expressed in various types of cells and tissues， and is still the most crucial cytosolic DNA sensor till now. However， the transcription and expression of cGAS are almost undetectable in porcine kidney cell lines PK-15， which play central roles in the study of swine viral disease. To construct the PK-15 cell lines stably expressing cGAS， the cGAS gene was inserted into the genome of the target cells using lentivirus packaging system， following by the identification of gene transcription， expression， and distribution. Finally， the DNA viruses pseudorabies virus （PRV） and porcine parvovirus （PPV） were used as model viruses to confirm the role of cGAS in innate antiviral immunity. The results showed that cGAS is successfully integrated into the genome of the PK-15 cells， and can be detected in the recombinant cell lines PK-15-cGAS as early as generation 3. The infection of PRV and PPV induced markedly higher levels of interferon-related genes，and consistently the replication of PRV and PPV was dramatically inhibited in PK-15-cGAS cells. In summary， the PK-15 cell lines stably expressing cGAS were prepared successfully， which will help to explore the mechanisms of viral infection as well as immune evasion.

Key words： cGAS; PK-15; stable cell line; lentivirus packaging system

*Corresponding author：" HE Wenrui， E-mail： wrhe0111@163.com

天然免疫系統(tǒng)是宿主抵御病原微生物入侵的第一道防線，它通過模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）對病原相關分子模式（pattern recognition molecular patterns，PAMPs）的識別而啟動。Ⅰ型干擾素和炎性因子等天然免疫效應基因除能直接參與清除入侵的病原微生物外［12］，還能通過促進樹突狀細胞等抗原提呈細胞的成熟與分化，激活宿主的特異性免疫應答，以實現(xiàn)免疫記憶的建立和對病原體的完全清除。天然免疫應答受到機體的嚴格調(diào)控，過度激活可能會造成嚴重的組織損傷，引起自身免疫疾病等［3］。

PAMPs一般是某類病原微生物的保守成分，例如微生物的特有結(jié)構，他們在病原微生物生命活動過程中不可或缺。病毒是一類嚴格的胞內(nèi)寄生生物，其所有組分均在宿主細胞內(nèi)合成的，因此基因組核酸是病毒最為重要的PAMPs［4-5］。入侵細胞的RNA病毒主要被細胞內(nèi)的RIG-I樣受體（RIG-I like receptors， RLRs）識別，經(jīng)線粒體膜定位的接頭蛋白MAVS招募并激活激酶TBK1和轉(zhuǎn)錄因子IRF3，起始Ⅰ型干擾素及下游效應基因的轉(zhuǎn)錄與表達［6］。據(jù)報道，細胞內(nèi)存在多種DNA識別受體，包括toll樣受體9（Toll-like receptor 9， TLR9）、環(huán)二腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase， cGAS）、RNA聚合酶Ⅲ、DNA依賴的干擾素活化因子DAI、干擾素誘導蛋白IFI16等［7］。其中，cGAS是迄今為止細胞和組織分布最廣泛、認可度最高的胞質(zhì)DNA受體。cGAS是一種環(huán)二腺苷酸合成酶，當DNA病毒入侵細胞后，其基因組能被cGAS所識別，隨后活化的cGAS利用細胞內(nèi)的ATP和GTP合成第二信使環(huán)狀GMP-AMP（cyclic GMP-AMP，cGAMP）［8］。cGAMP與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的關鍵接頭蛋白干擾素刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）結(jié)合，穩(wěn)定并誘導STING發(fā)生二聚化，活化的STING遷移到核外周區(qū)域，并在遷移過程中招募激酶TBK1以及轉(zhuǎn)錄因子IRF3，作為平臺促進TBK1對IRF3的磷酸化。隨后活化的IRF3形成二聚體入核，與NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子一起誘導Ⅰ型干擾素的表達，從而啟動機體的抗病毒天然免疫機制［9-10］。

本研究前期的轉(zhuǎn)錄組學結(jié)果表明，PK-15細胞中cGAS的轉(zhuǎn)錄水平極低（表1），而蛋白水平幾乎檢測不到PK-15細胞系中cGAS的表達，這意味著PK-15細胞cGAS-STING-IFN-I信號軸并不完整，不適合應用于豬病毒性疾病感染與免疫機制的探究過程。慢病毒包裝系統(tǒng)是目前最廣泛應用于構建穩(wěn)定過表達外源蛋白的細胞系的方法，該系統(tǒng)的基本原理是將含有目的基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)，在輔助包裝質(zhì)粒的作用下，在細胞內(nèi)組裝成攜帶目的基因的慢病毒粒子。隨后利用慢病毒的自身特性，將目的基因整合到宿主細胞基因組，從而使靶細胞能夠穩(wěn)定表達目的基因［11-12］。

基于以上理論及試驗探究結(jié)果，本研究利用慢病毒包裝系統(tǒng)，構建并獲得了穩(wěn)定表達cGAS蛋白的PK-15細胞系，并以豬偽狂犬病病毒（pseudorabies virus， PRV）和豬細小病毒（porcine parvovirus， PPV）為模式病毒，在該細胞系驗證了

cGAS在DNA病毒激活宿主IFN-I信號通路及宿主抗DNA病毒過程中的作用。PK-15-cGAS細胞系的成功構建為后續(xù)開展豬源DNA病毒免疫逃逸機制研究奠定了良好的物質(zhì)基礎，有助于推進豬病毒性疾病感染與致病等重要科學問題取得突破性進展。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與細胞

DH5α感受態(tài)細胞、HEK-293T細胞、PK-15細胞、豬偽狂犬病病毒（porcine pseudorabies virus，PRV）、豬細小病毒 （porcine parvovirus，PPV）、慢病毒包裝質(zhì)粒pLOV及輔助質(zhì)粒LH1、LH2均由河南農(nóng)業(yè)大學國家動物免疫學國際聯(lián)合研究中心提供。

1.2 主要試劑

限制性核酸內(nèi)切酶NheⅠ、BamHⅠ和T4 DNA連接酶購于New England Biolabs（NEB）公司，質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司，Opti-MEM、PEI和Polybrene均購于Sigma-Aldrich公司，鼠源Flag標簽抗體、鼠源β-actin抗體和HRP標記親和純化羊抗鼠IgG購于Proteintech公司，F(xiàn)ITC標記親和純化羊抗鼠IgG購于Abbkine公司。

1.3 方法

1.3.1 引物的設計

根據(jù)GenBank中MB21D1的基因序列（GenBank： 100516408），設計正向引物：5′-CGCGGATCCATGGCGGCCCGGC-GGGAAA-3′（包含BamHⅠ酶切位點）和反向引物：5′-CTAGCTAGCCCAAAAAACTGGAAATC-CAT-3′（包含NheⅠ酶切位點），均由生工生物工程上海股份有限公司合成。

1.3.2 pLOV-cGAS重組質(zhì)粒的構建

以本實驗室保存的cGAS真核表達質(zhì)粒為模板，擴增目的基因cGAS，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定并回收目的基因。通過BamHⅠ和NheⅠ處理目的基因，暴露其黏性末端，經(jīng)純化后將其與同樣經(jīng)BamHⅠ和NheⅠ處理的線性化pLOV載體用T4 DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞并涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)皿中。經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，挑取3個單菌落擴大培養(yǎng)，隨后進行質(zhì)粒提取和酶切鑒定，鑒定正確的陽性質(zhì)粒命名為pLOV-cGAS。

1.3.3 過表達cGAS的PK-15細胞系的構建

將質(zhì)粒LH1（12 μg）、LH2（10 μg）、pLOV-cGAS/pLOV（20 μg）質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK-293T細胞中，6～8 h后將培養(yǎng)基更換為37 ℃預熱的無雙抗完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36～48 h，期間觀察細胞形態(tài)變化。當HEK-293T細胞形態(tài)變圓呈葡萄串狀聚集時，收取細胞培養(yǎng)上清。經(jīng)4 000 r·min-1，4℃離心10 min，除去培養(yǎng)上清中的雜質(zhì)和細胞碎片等（沉淀）。隨后將含有病毒的培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)導PK-15細胞，同時加入終濃度為8 μg·mL-1的促融劑Polybrene，以提高轉(zhuǎn)導效率。待PK-15細胞感染病毒12 h后，更換含4 μg·mL-1L嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進行細胞系的加壓篩選和傳代培養(yǎng)，第三代（傳代5～8 d）即可開始檢測目的基因cGAS的表達。

1.3.4 CCK-8細胞活性檢測

在96孔板中接種PK-15-EV及PK-15-cGAS細胞，分別于培養(yǎng)0、12、24、36 h向每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3 h。當出現(xiàn)肉眼可見的顯色反應后，使用酶標儀測定OD450 nm處的吸光度。

1.3.5 蛋白免疫印跡試驗驗證重組PK-15細胞中cGAS的表達

將對照細胞PK-15-EV和重組細胞系PK-15-cGAS接種至12孔板，待其單層鋪滿培養(yǎng)孔底部后，棄掉培養(yǎng)上清。隨后向孔內(nèi)加入2*SDS Loading Buffer 100 μL，室溫裂解細胞5 min后收集至1.5 mL離心管，置于95 ℃干浴鍋變性20 min。通過SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶室溫封閉30 min。封閉結(jié)束后用鼠源Flag標簽抗體或鼠源β-actin抗體37℃孵育1 h，TBST清洗4次后，再用HRP標記親和純化羊抗鼠IgG 37 ℃孵育1 h，TBST清洗4次后用ECL全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)檢測cGAS的表達。

1.3.6 間接免疫熒光觀察PK-15細胞中cGAS的表達

將PK-15-EV和PK-15-cGAS細胞系接種至12孔板，待其單層鋪滿培養(yǎng)孔底部后，棄掉培養(yǎng)上清，并向每孔加入4%多聚甲醛500 μL，室溫固定20 min。隨后棄固定液，并用PBS洗滌，再向每孔加入500 μL的0.1% Triton X-100溶液，室溫透膜處理15 min。用PBS清洗細胞，加入500 μL的5% BSA室溫靜置封閉1 h。封閉結(jié)束后加入鼠源Flag標簽抗體37℃孵育1 h，PBST清洗4次后，加入FITC標記親和純化羊抗鼠IgG，室溫靜置孵育1 h，PBST清洗4次后滴加4′， 6-二脒基-2-苯基吲哚（4′， 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）室溫靜置8 min進行細胞核染色。DAPI染色結(jié)束后，用PBS洗滌3次，立即滴加封片劑，使用熒光倒置顯微鏡觀察細胞并拍照。

1.3.7 IFN-I信號通路激活檢測

以豬源DNA病毒PRV和PPV為模式病毒，按MOI=1感染PK-15-EV及PK-15-cGAS的細胞系，檢測下游抗病毒基因的轉(zhuǎn)錄水平，以評價重組細胞系在DNA病毒激活宿主天然免疫應答研究中應用的可能性。在PRV或PPV感染細胞0、4、8、12 h后收集細胞樣品，經(jīng)TRIzol法提取細胞總RNA、反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR（qPCR），檢測干擾素相關基因MX1、IFIT1、RSAD2的轉(zhuǎn)錄水平（具體引物序列見表2）。

1.3.8 病毒復制水平檢測

以豬源DNA病毒PRV和PPV為模式病毒，分別按MOI=1感染PK-15-EV及PK-15-cGAS的細胞系不同時間點后收集細胞；經(jīng)DNA提取和qPCR試驗基因組水平檢測病毒復制（具體引物序列見表2），通過SDS-PAGE和蛋白免疫印跡試驗，蛋白水平檢測病毒復制。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究使用GraphPad Prism軟件和SPSS Statistics進行統(tǒng)計分析。柱狀圖中的定量數(shù)據(jù)為“x±s”。使用單因素方差分析（Tukey檢驗）和獨立樣本T檢驗對相應數(shù)據(jù)進行分析。統(tǒng)計學顯著性設定為*.Plt;0.05；**.Plt;0.01；***.Plt;0.001；ns. P ＞0.05。

2 結(jié) 果

2.1 cGAS目的基因的擴增及pLOV-cGAS重組質(zhì)粒的構建

cGAS蛋白由MB21D1基因編碼，全長1 487 bp。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴增產(chǎn)物大小為1 000～2 000 bp，與預期相符（圖1A）。隨后經(jīng)片段黏性末端暴露、連接、轉(zhuǎn)化、單克隆挑取和酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)挑取的3個單克隆經(jīng)NheⅠ和BamHⅠ處理均出現(xiàn)大小約1 500 bp的條帶（圖1B）。這些結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pLOV-cGAS構建成功。

2.2 穩(wěn)定表達cGAS的PK-15細胞系構建

供體質(zhì)粒pLOV-cGAS和輔助質(zhì)粒LH1、LH2共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞36 h左右，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞明顯變圓，呈葡萄串狀聚集（圖2A），這表明假病毒已大量產(chǎn)生。隨后收取細胞上清，離心去除細胞碎片和雜質(zhì)后轉(zhuǎn)導至提前準備好的PK-15細胞，12 h后，用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)和加壓篩選。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)假病毒感染并未明顯影響PK-15細胞的形態(tài)（圖2B）。

2.3 重組細胞系PK-15-cGAS細胞活性檢測

通過CCK-8試劑盒檢測嘌呤霉素加壓篩選第5代的PK-15-EV及PK-15-cGAS細胞傳代不同時間點的細胞活性，結(jié)果表明穩(wěn)定表達cGAS并不影響PK-15細胞的活性和生長（圖3）。

2.4 重組細胞PK-15-cGAS中cGAS蛋白的表達鑒定

通過qPCR、蛋白免疫印跡以及免疫熒光試驗，對不同代次重組細胞PK-15-cGAS中cGAS的核酸轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平進行檢測。試驗結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)錄組學結(jié)果一致，PK-15-EV細胞中cGAS的mRNA含量極低，重組細胞系PK-15-cGAS細胞中cGAS的mRNA含量顯著提高（圖4A）。蛋白水平檢測結(jié)果顯示，PK-15-EV細胞中幾乎未檢測到cGAS的表達，而PK-15-cGAS細胞cGAS蛋白水平明顯提高（圖4B）。

間接免疫熒光試驗結(jié)果同樣證明，PK-15-EV細胞中未檢測到cGAS的表達，而PK-15-cGAS細胞cGAS蛋白含量顯著提高（圖4C）。這些結(jié)果共同表明，重組細胞PK-15-cGAS構建成功，cGAS在該細胞系中能夠穩(wěn)定表達。

2.5 重組細胞系PK-15-cGAS功能驗證

以PRV和PPV為模式病毒，對重組細胞系PK-15-cGAS進行功能驗證。qPCR試驗結(jié)果顯示，PRV和PPV感染PK-15-EV細胞僅能誘導較低水平干擾素相關基因的產(chǎn)生。在PK-15-cGAS細胞中，PRV和PPV感染明顯能夠誘導更高水平IFIT1、MX1、RSAD2等的產(chǎn)生（圖5A）；相比于PK-15-EV細胞，PRV和PPV在PK-15-cGAS細胞中的復制受到明顯抑制，同等感染劑量相同時間點其基因組水平和蛋白水平均顯著降低（圖5B、C）。這些結(jié)果表明重組細胞系PK-15-cGAS能夠應用于豬源DNA病毒調(diào)控宿主天然免疫應答相關研究。

3 討 論

病原微生物無處不在，時刻威脅著人類和畜禽的健康；然而伴隨著生物進化，機體也演變形成了完備的免疫系統(tǒng)，以抵御病原微生物的入侵。機體的免疫系統(tǒng)主要包括天然免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)兩部分。天然免疫應答發(fā)生于感染早期，是機體抵抗病原微生物入侵的第一道防線；適應性免疫應答起始于病原微生物感染的相對晚期，負責清除入侵的病原體和免疫記憶形成［13-14］。作為分布最為廣泛的胞質(zhì)DNA受體，cGAS不僅能夠識別來源于DNA病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒和細菌等的DNA［15］，還能識別在特定情況下釋放到細胞質(zhì)的基因組DNA或線粒體DNA（mtDNA），引起無菌性炎癥反應［16-17］。因此，cGAS在天然免疫應答中起著至關重要的作用。豬腎細胞PK-15是豬病毒性疾病研究過程中一種應用十分廣泛的工具細胞，然而該細胞cGAS的轉(zhuǎn)錄和表達水平極低。受限于PK-15細胞中cGAS的表達水平，DNA病毒感染該細胞后并不能有效激活宿主細胞的天然免疫應答。這極大的限制了PK-15細胞在豬源DNA病毒感染和免疫逃逸研究中的應用。

當前，借助慢病毒包裝系統(tǒng)構建穩(wěn)定表達目的基因的細胞系技術已被廣泛應用生命科學研究領域。慢病毒載體具有能實現(xiàn)可容納較大外源基因片段、外源基因持續(xù)穩(wěn)定表達、重組病毒滴度高等優(yōu)點［18］。因此，本研究利用慢病毒系統(tǒng)成功構建了能夠穩(wěn)定表達cGAS的PK-15細胞系，然而在PK-15-cGAS細胞系構建過程中發(fā)現(xiàn)，假病毒感染量需嚴格控制。病毒感染量過高，目的基因表達過多，會引起待感染靶細胞凋亡或死亡。以cGAS為例，它的過量表達會引起細胞超高水平的免疫應答，使細胞處于應激狀態(tài)，進而發(fā)生凋亡［19］。本研究中構建的PK-15-cGAS細胞系，形態(tài)、細胞活性和生長速度等均與對照細胞無明顯差異，可作為工具細胞用于豬病毒性疾病的相關研究。

針對構建成功的PK-15-cGAS細胞系，本研究借助qPCR，從干擾素相關基因的轉(zhuǎn)錄水平對其功能進行了檢測。研究結(jié)果顯示，相比于對照細胞，PRV和PPV感染PK-15-cGAS細胞能誘導更高水平的抗病毒基因轉(zhuǎn)錄。這一結(jié)果不僅有效驗證了cGAS在抗DNA病毒感染過程中的重要作用，也證明PK-15-cGAS細胞可用于豬源DNA病毒調(diào)控宿主天然免疫應答的相關研究。值得關注的是，近期的研究結(jié)果表明cGAS也是RNA病毒激活宿主天然免疫應答所必需的［20］，因此PK-15-cGAS細胞系亦可用抗RNA病毒感染和cGAS之間相互關系的研究。綜上可知，本研究構建的PK-15-cGAS細胞系可用于豬病毒性疾病感染與免疫機制相關探究，為后續(xù)探究該類病毒免疫逃逸機制提供了良好的試驗材料，有助于豬病毒性疾病感染與致病等重要科學問題取得突破性進展。

4 結(jié) 論

本研究通過慢病毒包裝系統(tǒng)，成功構建了穩(wěn)定表達cGAS蛋白的PK-15細胞系，并以豬源DNA病毒PRV和PPV為模式病毒對重組細胞系PK-15-cGAS在DNA病毒激活宿主天然免疫應答研究中應用的可能性進行評價。數(shù)據(jù)顯示，PK-15-cGAS細胞系具有良好的傳代穩(wěn)定性，能作為工具細胞，方便后續(xù)豬病毒性疾病感染與免疫機制相關探究。

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（編輯 白永平）