首次從湖南豬源大腸桿菌中檢出mcr-1陽性IncI2(Delta)質(zhì)粒

摘 要： 近年來，由于抗生素耐藥基因的廣泛傳播及多重耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，導(dǎo)致抗生素的使用面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，致使毒性較強(qiáng)的多黏菌素又重新引起業(yè)界的重視，為此對多黏菌素耐藥情況的研究也變得十分重要。為了調(diào)查畜牧場中多黏菌素耐藥基因mcr-1的流行情況，本研究選擇我國湖南省某豬場240份腸肛拭子樣品，培養(yǎng)分離鑒定出含有mcr-1耐藥基因的大腸桿菌菌株，選取多黏菌素等10種抗菌藥物對分離的菌株進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，對所有含mcr-1耐藥基因的大腸桿菌陽性株進(jìn)行全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS），采用多位點(diǎn)序列分型（multi-locus sequence typing，MLST）技術(shù)進(jìn)行大腸桿菌的遺傳多樣性分析。研究結(jié)果表明，在分離出的172株大腸桿菌中，來自不同個(gè)體的9株攜帶mcr-1基因的大腸桿菌均表現(xiàn)出多重耐藥現(xiàn)象；MLST分析共鑒定出ST10、ST196、ST46和ST5229共4種分型和4種血清型（O83：H5， O16：H7， O16：H51， O9：H4）。生物信息學(xué)分析顯示，所有陽性菌株均未發(fā)現(xiàn)與mcr-1基因傳播有關(guān)的典型可移動遺傳元件ISApl1，但均檢出可能會導(dǎo)致mcr-1傳播的IV型分泌系統(tǒng)基因。質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)與單倍型的MLST多態(tài)性結(jié)果表明，mcr-1基因主要以質(zhì)粒介導(dǎo)的水平傳播為主。本研究是國際上首次在豬源細(xì)菌中檢出常見于人醫(yī)臨床細(xì)菌的攜帶有mcr-1抗性基因的IncI2（Delta）質(zhì)粒。

關(guān)鍵詞： 多黏菌素；mcr-1；IncI2（delta）質(zhì)粒；多重耐藥；豬；大腸桿菌

中圖分類號： S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-5278-09

收稿日期：2024-06-25

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳科技項(xiàng)目（22B0189）

作者簡介：黃康溦（2003-），女，江西南昌人，學(xué)士，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)和毒理學(xué)研究，E-mail：kwh0308@163.com

*通信作者：孫志良，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)與獸藥制劑學(xué)研究，E-mail： sunzhiliang1965@aliyun.com

First Report of Colistin-Resistant Escherichia coli Carrying mcr-1 IncI2（Delta）

Plasmids from Pigs in Hunan Province， China

HUANG" Kangwei， ZHOU" Pengcheng， TIAN" Chenyu， LAN" Yi， SUN" Zhiliang*

（College of Veterinary Medicine， Hunan Agricultural University，" Changsha 410125，" Hunan， China）

Abstract：" The rise of antibiotic resistance has brought renewed attention to older drugs like polymyxins， making it important to control the spread of resistance genes. In this study， we focused on colistin-resistant Escherichia coli strains from a pig farm in Hunan， China. Out of 240 samples， 172 E. coli strains were isolated and cultured， PCR was used to identify mcr-1 positive E. coli strains. These strains were tested by ten different antibiotics to check for their drug resistance， and whole-genome sequencing （WGS） was applied to analyze their genetic background. All the nine mcr-1 positive E. coli strains exhibit high levels of multidrug resistance. Four distinct MLST types （ST10， ST196， ST5229， ST46） and 4 serotypes （O83：H5， O16：H7， O16：H51， O9：H4） in the nine strains were identified. Further bioinformatics analyses showed that the ISApl1 element， which is commonly associated with mcr-1 transmission， was not observed in the present study， while the type IV secretion system genes were detected in all the nine mcr-1 positive E. coli strains. Plasmid conjugation experiments and the presence of polymorphic MLST haplotypes indicated a vertical plasmid-mediated mcr-1 transmission possibility. Notably， our study for the first time uncovered a pig origin IncI2（Delta） plasmid carrying mcr-1 gene in E. coli which is normally presented in the human clinical E. coli strains.

Key words： colistin resistance; mcr-1; plasmid IncI2（delta）；multiple drug resistance; pig; Escherichia coli

*Corresponding author：" SUN Zhiliang，E-mail： sunzhiliang1965@aliyun.com

抗生素在治療臨床細(xì)菌感染方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。但抗生素的廣泛使用，也同時(shí)導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性呈現(xiàn)多重性和復(fù)雜性，抗生素的治療效果也顯著降低，已嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。2023年世界衛(wèi)生組織執(zhí)行委員會第154屆會議總干事報(bào)告指出，2019年全球因感染耐藥菌而直接死亡的人數(shù)達(dá)到127萬，若不采取有效措施，至2050年全球可能會增加至1 000萬［1］。同時(shí)細(xì)菌的耐藥性在農(nóng)業(yè)動物生產(chǎn)中的挑戰(zhàn)也在不斷增加，在過去近二十年間，畜禽源耐藥細(xì)菌的比例迅速增加。因?yàn)樾滦涂咕幬镩_發(fā)進(jìn)展緩慢及超級耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，使得原來一些毒性強(qiáng)而早期并不適于臨床使用的藥物，如多黏菌素，又重新回到科研人員的視野中，成為解決當(dāng)前多重耐藥菌感染的重要焦點(diǎn)之一。

多黏菌素是一種20世紀(jì)50年代投入臨床的多肽類抗生素，因其腎毒性在臨床上逐漸被其他抗生素取代；但進(jìn)入21世紀(jì)，它又被重新啟用，作為抵抗微生物感染的“最后一道防線”［2］。在農(nóng)業(yè)動物生產(chǎn)中，多黏菌素除了用于革蘭陰性菌感染治療外，還廣泛用于畜禽促生長。由于多黏菌素的廣泛使用，細(xì)菌基因組中出現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移多黏菌素耐藥基因（mobilized colistin resistance，mcr），它們可以在細(xì)菌的種內(nèi)或者種間實(shí)現(xiàn)快速的傳播，從而降低多黏菌素的抗菌作用［3］。

mcr基因的起源尚不清楚。2016年，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉健華等首次報(bào)道了在動物和人類中均存在由質(zhì)粒介導(dǎo)的mcr-1基因［4］，表明多黏菌素的耐藥基因在不同來源的細(xì)菌之間存在互相傳播的風(fēng)險(xiǎn)。截至目前，已發(fā)現(xiàn)10個(gè)mcr耐藥基因，這些基因在全球范圍內(nèi)廣泛傳播。其中，mcr-1和mcr-9基因是最常見的多黏菌素耐藥基因，分別在61和40個(gè)國家被檢測到［5］，研究表明攜帶mcr-1基因最常見的細(xì)菌是大腸桿菌、沙門菌和肺炎克雷伯菌［6］。而在質(zhì)粒介導(dǎo)的mcr-1傳播過程中，松弛酶是影響其質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的因素之一，通過影響接合轉(zhuǎn)移通道的形成而影響接合轉(zhuǎn)移的過程［7］。

本研究選取湖南省某豬場，調(diào)查豬群中攜帶mcr-1基因的大腸桿菌（mobile colistin-resistant positive Escherichia coli， MCRPEC）菌株的流行情況，檢測mcr-1陽性菌株的抗菌藥物敏感性，獲得最低抑菌濃度和細(xì)菌耐藥情況等。此外，對9株MCRPEC進(jìn)行全基因組測序，研究其耐藥基因特征及可移動遺傳元件與傳播途徑之間的關(guān)聯(lián)性，為當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場中大腸桿菌性疾病的防控以及公共衛(wèi)生安全提供一定的實(shí)證參考。

1 材料與方法

1.1 材料

MHA瓊脂、MHB肉湯、LB肉湯、MH肉湯、麥康凱瓊脂購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；頭孢噻肟、頭孢他啶、萬古霉素、美羅培南等藥品購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；慶大霉素、阿米卡星、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑（復(fù)方新諾明）、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、硫酸黏桿菌素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；瓊脂糖、TAE溶液（50×）購自廣州碩譜生物科技有限公司；DNA marker（2 000 bp）購自上海泰坦科技股份有限公司；含有Taq酶的mixture混合液購自上?；萘枭锛夹g(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離及鑒定

從湖南省某豬場的110頭育肥豬和130頭保育豬中收集240份肛拭子，該豬場約存欄3 600頭母豬，存欄數(shù)約為22 000頭，無急、烈性傳染病，均為健康豬，均未在飼料中添加抗生素促生長。取樣，置于含4 μg·mL-1萬古霉素和2 μg·mL-1硫酸多黏菌素的MH肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h富集。隨后，將分離物接種在含有4 μg·mL-1多黏菌素的麥康凱瓊脂中37 ℃培養(yǎng)16 h。收集單個(gè)粉紅色克隆菌落，并選擇16S rDNA鑒定細(xì)菌的種屬［8］。

1.2.2 mcr-1基因檢測

參照前人的檢測方法，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增mcr-1基因［9］，篩選出對多黏菌素耐藥的大腸桿菌。

1.2.3 藥敏試驗(yàn)

采用倍比稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，檢測硫酸多黏菌素和其他9種抗生素（頭孢噻肟、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、美羅培南、氟苯尼考、四環(huán)素、頭孢他啶和復(fù)方新諾明）對上述分離鑒定的大腸桿菌菌株的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），參照歐洲抗菌藥物敏感性測試委員會（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）（2024.01.01）的折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)，以大腸桿菌ATCC 25922為質(zhì)控菌株。

1.2.4 全基因組測序與基因組分析

參照天根生化科技（北京）有限公司試劑盒說明書，提取9株mcr-1陽性大腸桿菌的細(xì)菌基因組DNA，送至北京安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司進(jìn)行全基因組測序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析

使用Illumina平臺進(jìn)行全基因組測序，組裝成功的細(xì)菌基因組通過SPAdes軟件分析［10］，用PATRIC3.6.9進(jìn)行注釋［11］。根據(jù)16S rDNA序列使用JspeciesWS服務(wù)器鑒定細(xì)菌物種［8］，通過CGE服務(wù)器（基因組流行病學(xué)中心）的ResFinder和VirulenceFinder確定抗生素耐藥基因（antibiotic resistance genes，ARGs）和毒力因子［12-13］。利用Parsnp（Harvest v1.1.2，https：//github.com/marbl/parsnp）生成進(jìn)化樹，并繼續(xù)通過在線工具iTOL（https：//itol.embl.de）調(diào)整和優(yōu)化。最后，使用Easyfig v2.2.3工具［14］和plascad軟件［15］可視化，并由FastANI［16］展示細(xì)菌物種的全基因組相似性。

1.2.6 接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)

將攜帶mcr-1基因的陽性株（供體菌株）及E. coli C600菌株（受體菌株），分別接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)至0.5麥?zhǔn)媳葷岫?，以供體菌株：受體菌株體積比例為1∶3充分混合，均勻涂布于0.45 μm的微孔濾膜，置于LB瓊脂平板中37 ℃過夜培養(yǎng)。收集濾膜表面生長的菌落并接種于含4 μg·mL-1多黏菌素和500 μg·mL-1氯霉素的麥康凱瓊脂平板，繼續(xù)培養(yǎng)20 h，然后從每個(gè)平板選擇10個(gè)均勻光滑、大小均一的粉紅色單克隆菌落，通過PCR技術(shù)確認(rèn)接合轉(zhuǎn)移是否成功。

2 結(jié) 果

2.1 mcr-1基因檢測

本研究在采集的240份肛拭子樣本中，共分離出172株大腸桿菌，逐一對分離出的大腸桿菌菌株進(jìn)行PCR檢測，鑒定到9株攜帶mcr-1基因的大腸桿菌陽性株，其陽性攜帶率為3.75%，其中育肥豬的陽性率為5.45%，保育豬的陽性率為3.75%。

2.2 藥敏試驗(yàn)

本研究通過藥敏試驗(yàn)，研究分離出的9株mcr-1基因陽性大腸桿菌的耐藥情況，結(jié)果見表1。根據(jù)EUCAST的標(biāo)準(zhǔn)，9株mcr-1陽性菌株均對頭孢噻肟、頭孢他啶、慶大霉素、環(huán)丙沙星、阿米卡星、多黏菌素、四環(huán)素和替加環(huán)素表現(xiàn)多重藥物耐藥性（multiple drug resistance，MDR），而且耐藥程度非常高。除了23cg189、23cg223和23cg225對氟苯尼考、美羅培南和復(fù)方新諾明較敏感外，幾乎所有的菌株對試驗(yàn)的大部分抗生素都呈現(xiàn)耐藥。

2.3 全基因組測序和生物信息學(xué)分析

2.3.1 MLST分析和血清型分析

菌屬鑒定結(jié)果顯示，9株陽性分離株均為大腸桿菌，根據(jù)全基因組測序結(jié)果，所有陽性菌株都攜帶mcr-1基因。多位點(diǎn)序列分型（multi-locus sequence typing，MLST）比對發(fā)現(xiàn)，9株菌可分為ST5229（n=4）、ST46（n=2）、ST196（n=2）和ST10（n=1）等四種不同的MLST分型。與此同時(shí)，這些菌株存在O83：H5，O16：H7，O16：H15和O9：H4四種不同的血清型組合和質(zhì)粒組合類型，分別與MLST分型分布規(guī)律相似。

同一豬舍的樣本MLST分型規(guī)律往往呈現(xiàn)相同的分型，例如在同一欄舍分離的23cg214和23cg215、23cg225和23cg226同屬ST5229; 23cg223和23cg230同屬ST46；但不同欄的樣本也有呈現(xiàn)相同MLST分型的情況，如23cg189及23cg201分離自不同的欄舍，卻同屬于ST196， 并且它們的基因組相似度高達(dá)99.99%。因此，推測MCRPEC的ST類型與菌株來源地之間沒有直接聯(lián)系，或者不同型耐藥菌株間存在跨欄傳播現(xiàn)象。作者發(fā)現(xiàn)血清型的分布也與MLST分型存在基本對應(yīng)關(guān)系，例如23cg214和23cg215、23cg225和23cg226同屬ST5229，其血清型均為O16：H51；23cg223和23cg230同屬ST46，其血清型均為O16：H7。此外不同血清型之間在抗生素抗性基因（antibiotic resistant genes，ARGs）的類型上有明顯差異，在臨床用藥上或可根據(jù)MLST分型以判斷敏感抗生素的使用。

2.3.2 耐藥基因分析

ARGs的檢測結(jié)果如圖1所示，共檢測到42個(gè)ARGs，所有分離菌株中均發(fā)現(xiàn)mcr-1基因。除mcr-1外，鏈霉素和大觀霉素（aadA1）、氯霉素（cmlA1）、四環(huán)素和替加環(huán)素（tetA）的ARGs也在所有分離株中呈現(xiàn)陽性。此外，其他ARGs包括氨基糖苷類耐藥基因（aadA2）、氯霉素耐藥基因（floR）、磺胺耐藥基因（sul2/sul3）、碳青霉烯類耐藥基因（blaCMY-2）和甲氧芐啶耐藥基因（dfrA12），也存在于上述9個(gè)大腸桿菌陽性株中。

2.3.3 質(zhì)粒類型及特征分析

9株陽性菌株中的質(zhì)粒類型包括IncR、IncX1、IncX4、IncQ1、IncFIB（AP001918）、IncFII、IncHI2、IncHI2A、IncI2（Delta）、IncY、IncFII（pHN7A8）、IncI1-I（α）和IncX1。其中，質(zhì)粒IncX4和IncI2（Delta）是攜帶mcr-1的典型質(zhì)粒，本研究中有3株mcr-1基因位于IncX4質(zhì)粒上，6株位于IncI2（Delta）質(zhì)粒上，這兩種質(zhì)粒均具有松弛酶、T4SS和T4CP，為可接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒。不同菌株之間抗生素抗性基因的類別與數(shù)量存在顯著差異，23cg189和23cg201菌株的親緣關(guān)系最近，兩者基因組相似度極高，攜帶的耐藥基因相似度也很高，包括aadA3、aadA22、aadA24、qnrS1、ARR-2、dfrA14、aph（4）-a、aac（3）-IId、ant（3）-Ia、blaOXA-10、blaCTX-M-65、fosA7和lnuA共13個(gè)耐藥基因。相比之下，菌株23cg214攜帶的耐藥基因最少，較23cg189和23cg201少了7個(gè)ARGs（圖1）。

為進(jìn)一步分析松弛酶的種類對mcr-1攜帶質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移影響，本研究中對兩類攜帶mcr-1基因的主要質(zhì)粒進(jìn)行了松弛酶基因種類的分析，發(fā)現(xiàn)攜帶mcr-1的質(zhì)粒松弛酶基因因質(zhì)粒的類型不同而不同，可分為MOBV（mobility V， V型松弛酶基因）和MOBP（mobility P， P型松弛酶基因）兩類，其遺傳背景分析如圖2所示，它們均攜帶Ⅳ型分泌系統(tǒng)（T4SS）和Ⅳ型偶聯(lián)蛋白（T4CP）基因，且type 2質(zhì)粒的長度約為type 1質(zhì)粒的兩倍。

為研究mcr-1基因與質(zhì)粒結(jié)合時(shí)產(chǎn)生偏好的可能原因，本研究以同時(shí)攜帶兩個(gè)mcr-1典型質(zhì)粒（IncI2（Delta）和IncX4）的23cg189菌株為對象，選取了上述兩個(gè)質(zhì)粒的基因片段，進(jìn)行了基因組序列分析并比對其相似性，結(jié)果如圖3所示。另一方面，將23cg223中攜帶mcr-1的質(zhì)粒與未攜帶mcr-1的質(zhì)粒即第50基因片段contig和第52基因片段contig比較相似性，分析mcr-1基因?qū)ΤＲ姅y帶質(zhì)粒選擇的潛在原因，發(fā)現(xiàn)它們的基因序列存在顯著的區(qū)別。排除本身質(zhì)粒復(fù)制系統(tǒng)的差異外，其他基因的差異也值得注意，尤其是這兩段基因片段均攜帶virB4基因，生物信息分析發(fā)現(xiàn)，雖然基因名稱相同，但序列存在顯著差異，兩者相似度僅為43%。

值得注意的是，本研究首次在國際上在豬源大腸桿菌中檢測到主要在人源臨床中出現(xiàn)的IncI2（delta）質(zhì)粒；原先IncI2（Delta）質(zhì)粒常在人類臨床樣本中檢出，而IncI2質(zhì)粒則更多出現(xiàn)在養(yǎng)殖場源樣本中［17］。然而，在本研究的基因組分析中未發(fā)現(xiàn)攜帶mcr-1的IncI2質(zhì)粒；相反，大部分mcr-1攜帶質(zhì)粒都是IncI2（Delta）質(zhì)粒，這是國際上首次從豬源大腸桿菌中檢測出攜帶mcr-1的IncI2（Delta）質(zhì)粒。為確保結(jié)果的可靠性，作者將這6株攜帶mcr-1的豬源IncI2（Delta）質(zhì)粒與常規(guī)豬源IncI2質(zhì)粒、人源與駱駝源的IncI2（Delta）質(zhì)粒進(jìn)行了質(zhì)粒全序列聚類分析，見圖4；序列聚類分析結(jié)果顯示檢出的質(zhì)粒確為IncI2（Delta）質(zhì)粒。

2.4 接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)

本研究成功進(jìn)行了接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)的九株mcr-1陽性大腸桿菌均能在接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)之后的雙抗培養(yǎng)皿上長出粉紅色菌落，攜帶mcr-1的兩種質(zhì)粒在接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)接合率上無區(qū)別；表明含mcr-1基因的質(zhì)?？梢栽诠w菌mcr-1陽性大腸桿菌與受體菌E. coli 600之間發(fā)生接合轉(zhuǎn)移。

3 討 論

耐藥細(xì)菌，尤其是多重耐藥菌的增加對人類、動物及環(huán)境的共同健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。本研究選擇大腸桿菌為研究對象，調(diào)查其多黏菌素耐藥基因mcr-1陽性菌株的流行情況和基因組特征。隨著多黏菌素在臨床的應(yīng)用增加，人們開始關(guān)注并且預(yù)防各種病原體中多黏菌素耐藥基因的傳播，尤其是在分布廣泛的大腸桿菌中。根據(jù)本次調(diào)查結(jié)果，從保育仔豬和育肥豬中共檢測到9株MCRPEC，mcr-1陽性率為3.75％，較2018年在湖南省檢測到的8%的流行率有明顯的下降［18］，并且肥育豬的陽性率比保育豬的陽性率更高，說明豬場的飼養(yǎng)過程會增加mcr-1陽性E. coli的感染風(fēng)險(xiǎn)，并且不同欄舍之間mcr-1大腸桿菌陽性率沒有顯著差異，表明其存在跨欄舍傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

多黏菌素屬于人畜共用的抗生素，可促進(jìn)動物生長故此前常用作畜牧養(yǎng)殖的飼料添加劑。為避免其耐藥性傳播，自2017年起，我國嚴(yán)禁將多黏菌素作為飼料添加劑使用［19］，本研究的小規(guī)模調(diào)查發(fā)現(xiàn)這使得mcr-1陽性攜帶率出現(xiàn)了下降趨勢［18］。但是，mcr-1的總體流行率呈現(xiàn)下降并不意味由mcr-1的傳播和流行引發(fā)的威脅可被消除。通過接合轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的水平傳播；多黏菌素耐藥基因可繼續(xù)在動物、環(huán)境和人類之間發(fā)生垂直和水平傳播；IncI2質(zhì)粒是mcr-1基因主要攜帶質(zhì)粒之一，并且亞致死濃度的抗生素可以促進(jìn)mcr-1基因和其他質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因水平傳播［20］。因此，應(yīng)當(dāng)面向公眾積極推廣科學(xué)合理使用抗生素的知識，尤其是農(nóng)場主、獸醫(yī)和醫(yī)護(hù)人員及相關(guān)的一線工作人員。

本研究選擇的大腸桿菌是人體和動物微生物中最常見的細(xì)菌之一，也是mcr-1耐藥基因陽性率最高的菌種。盡管一些攜帶mcr-1的大腸桿菌致病并不強(qiáng)，但仍是人類和動物發(fā)生感染的主要原因之一［21］。本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，9株mcr-1陽性菌株的耐藥水平在保育仔豬和育肥豬之間沒有顯著差異，并且對多數(shù)常見抗生素都呈現(xiàn)耐藥。值得注意的是，盡管23cg189和23cg201的宿主作為保育豬僅接觸有限的抗生素，它們攜帶的耐藥基因比其他菌株都多，覆蓋范圍也相對廣。在這兩株菌株中，還鑒定到一種與攜帶mcr-1的質(zhì)粒類型不同的攜帶blaCMY-2基因的可接合質(zhì)粒；突尼斯家禽中一項(xiàng)流行病學(xué)研究報(bào)道了同時(shí)攜帶blaCMY-2基因質(zhì)粒和mcr-1基因質(zhì)粒的現(xiàn)象［22］，但在豬源細(xì)菌中并未有過相關(guān)報(bào)道和研究。生信研究分析未發(fā)現(xiàn)blaCMY-2和mcr-1基因相關(guān)的典型MGEs，如IS26或ISEcp1［23-24］。鑒于23cg189和23cg201這兩個(gè)菌株全基因組序列相似率達(dá)到了99.99％，存在極為密切的遺傳關(guān)系，垂直傳播可能是其主要的傳播方式。然而，它們菌株的宿主不同，宿主之間也沒有直接的接觸，表明這些高度耐藥的菌株在該養(yǎng)殖場內(nèi)存在廣泛傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

盡管mcr-1的起源仍然未知，但攜帶mcr-1的質(zhì)粒通常有可移動元件ISApl1、mcr-1基因和編碼類似PAP2超家族蛋白的開放閱讀區(qū)域構(gòu)成［25］；mcr-1以質(zhì)粒介導(dǎo)和移動基因元件介導(dǎo)等多種形式傳播。質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移使mcr-1基因通過水平傳播擴(kuò)散，而可移動遺傳元件ISApl1的存在也可能導(dǎo)致mcr-1基因片段的轉(zhuǎn)移。本研究的基因組分析顯示這9株菌株中并未檢測到ISApl1序列，因此質(zhì)粒介導(dǎo)的水平傳播可能是該養(yǎng)殖場mcr-1基因主要的傳播方式。

為進(jìn)一步探究9株陽性菌株中mcr-1基因的分布和傳播規(guī)律，本研究對其全基因組序列進(jìn)行了注釋。根據(jù)影響質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移關(guān)鍵分子松弛酶和質(zhì)粒的組成，質(zhì)粒被分為可移動質(zhì)粒和可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒兩種類型?？赊D(zhuǎn)移質(zhì)粒編碼與膜相關(guān)的配對通道形成（MPF）復(fù)合物，由Ⅳ型分泌系統(tǒng)參與，進(jìn)而在細(xì)胞和細(xì)胞之間形成通道，促進(jìn)質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移；而可移動質(zhì)粒則需源自細(xì)胞中其他遺傳片段編碼的MPF復(fù)合物。MPF基因可以在轉(zhuǎn)移起始點(diǎn)被切割，并啟動質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移過程，在細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移期間傳播［26］。本研究的這些質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)了Ⅳ型耦合蛋白（T4CP）和Ⅳ型分泌系統(tǒng)（T4SS）基因，上述基因能導(dǎo)致各種病原菌之間耐藥基因的傳播［27］。而且，本研究中的mcr-1質(zhì)粒經(jīng)證實(shí)均能夠自我復(fù)制和接合轉(zhuǎn)移，比對后鑒定到兩種質(zhì)粒松弛酶MOBP和MOBV，進(jìn)一步分析松弛酶切割區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)這些序列更多與細(xì)菌之間親緣關(guān)系有關(guān)；菌株關(guān)系越密切，其松弛酶切割區(qū)序列的相似性越大，并且本研究在兩組松弛酶中發(fā)現(xiàn)多種不同的切割區(qū)序列，表明即使是相同的松弛酶也可以切割不同的基因序列，并啟動質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移的過程。

為進(jìn)一步探究攜帶有mcr-1基因的IncX4和IncI2（Delta）質(zhì)粒的適應(yīng)性優(yōu)勢，作者對IncX4和IncI2（Delta）質(zhì)粒及其他不含mcr-1基因的質(zhì)粒進(jìn)行了基因遺傳背景分析，以探究影響這兩種攜帶mcr-1基因的質(zhì)粒適應(yīng)性優(yōu)勢的因素。圖3顯示，盡管選取的兩個(gè)質(zhì)粒都是可接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒，但攜帶mcr-1的質(zhì)粒與其他質(zhì)粒存在顯著差異。其中，相似區(qū)域主要為常見的蛋白質(zhì)編碼基因，例如編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶的topB基因和可招募分子伴侶并影響蛋白質(zhì)形成的DnaJ基因［28］。通過比對23cg223內(nèi)兩個(gè)質(zhì)粒的差異，確認(rèn)它們的virB基因的相似性相對較低。因此，除質(zhì)粒復(fù)制系統(tǒng)的不兼容性造成質(zhì)粒之間的差異外，T4SS基因的差異也可能是影響mcr-1攜帶質(zhì)粒的適應(yīng)性優(yōu)勢的另一個(gè)因素。我們本研究中檢出的可接合質(zhì)粒類型包括IncI2、IncHI2、IncX4和IncF等，前人研究表明它們均可促進(jìn)mcr-1基因的傳播［29-31］。但是本研究中攜帶mcr-1基因的質(zhì)粒僅有IncX4和IncI2（Delta）質(zhì)粒，并且我們在部分分離出的大腸桿菌菌株中可以觀察到這兩種質(zhì)粒IncI2（Delta）和IncX4同時(shí)存在，它們是否會協(xié)同促進(jìn)mcr-1的豬場內(nèi)水平傳播值得深入研究。先前研究指出，攜帶mcr-1基因的IncI2和IncX4質(zhì)粒具有適應(yīng)性優(yōu)勢，是mcr-1基因的主要攜帶質(zhì)粒，而本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有IncX4和IncI2（Delta）質(zhì)粒也進(jìn)一步支持了這一現(xiàn)象［32］。

本研究中檢出攜帶有mcr-1基因的IncI2（Delta）質(zhì)粒，這是國際上首次在豬源大腸桿菌中檢出攜帶有常見于人類臨床中傳播的mcr-1基因的IncI2（Delta）質(zhì)粒。2024年2月的最新相關(guān)研究表明，在阿拉伯地區(qū)駱駝種群中也檢測到駱駝源細(xì)菌中的IncI2（Delta）質(zhì)粒［33］，這些研究結(jié)果表明mcr-1的主要攜帶質(zhì)粒已有很大可能在動物源和人源細(xì)菌之間發(fā)生跨物種的傳播，若不加以控制，養(yǎng)殖量巨大且范圍廣泛的養(yǎng)殖生豬將有可能將這種原先多在人源細(xì)菌攜帶的mcr-1攜帶質(zhì)粒IncI2（Delta）通過多種途徑傳播給大量健康人群，給公共衛(wèi)生安全尤其是人類臨床治療帶來潛在的巨大威脅。

本研究也存在一些局限性，如調(diào)查的范圍和采集的樣本量相對較小，研究的菌種也局限在大腸桿菌。在未來的研究中，應(yīng)在更大規(guī)模、更廣泛地區(qū)展開調(diào)查監(jiān)測；同時(shí)也需要擴(kuò)大菌種覆蓋范圍，深入調(diào)查耐藥基因在不同細(xì)菌物種間的傳播動態(tài)，以更系統(tǒng)全面的開展ARGs傳播監(jiān)測及有效防控。

4 結(jié) 論

本研究檢測出的9株mcr-1陽性大腸桿菌菌株中耐藥基因的分布存在多種差異。所有分離樣本中都含有多重耐藥的細(xì)菌，而細(xì)菌中耐藥基因種類的相似性和菌株之間的親緣關(guān)系密切，親緣關(guān)系越近，它們攜帶的耐藥基因種類的相似性越大。參考多重位點(diǎn)序列分型（MLST）分型和質(zhì)粒比對結(jié)果，發(fā)現(xiàn)mcr-1基因陽性細(xì)菌的質(zhì)粒和ST分型都比較多樣，而且MLST分型與菌株來源的欄舍沒有直接的關(guān)聯(lián)，表明不同型的耐藥菌株間可能存在跨欄傳播現(xiàn)象。同時(shí)，本研究在國際上首次在豬源細(xì)菌中鑒定到在人類臨床中常見的攜帶mcr-1耐藥基因的lncI2（Delta）質(zhì)粒，提示mcr-1的主要攜帶質(zhì)粒已有很大可能在動物源和人源細(xì)菌之間發(fā)生跨物種的傳播，需要對我國養(yǎng)殖量巨大且范圍廣泛的生豬產(chǎn)業(yè)的mcr-1陽性lncI2（Delta）質(zhì)粒給予高度關(guān)注。

致謝：感謝湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院孫志良教授和李基云教授提供的支持和建議。

數(shù)據(jù)獲?。核蠨NA測序數(shù)據(jù)已存儲在美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI， https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），項(xiàng)目編號為PRJNA1098979。圖表代碼可在以下地址獲?。篽ttps：//github.com/kwh0308/kwh0308/tree/main

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（編輯 孟 培）