鳶尾素對感染大腸埃希菌小鼠組織損傷及細(xì)菌清除的影響

摘 要： 本研究旨在探究鳶尾素（irisin）對大腸埃希菌（Escherichia coli， E. coli）感染小鼠的組織損傷及巨噬細(xì)胞清除細(xì)菌和誘發(fā)炎癥的影響。按半數(shù)致死劑量經(jīng)腹腔感染E. coli建立小鼠模型，通過體溫、臨床評分、生存率、器官組織損傷程度、組織中細(xì)菌載量和炎癥水平對鳶尾素的保護(hù)效果進(jìn)行評估；在體外將不同濃度鳶尾素與E. coli孵育，利用酶標(biāo)儀檢測菌液OD600 nm，評價鳶尾素是否具有抑菌效果；鳶尾素預(yù)處理小鼠單核巨噬細(xì)胞系（RAW264.7）后，使用E. coli感染細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液和mRNA評價巨噬細(xì)胞吞噬和清除細(xì)菌的能力以及M1極化水平。結(jié)果表明，鳶尾素能夠明顯提高細(xì)菌感染小鼠的生存率，降低臨床評分，促進(jìn)體溫恢復(fù)，減輕肝、肺和腎的損傷（Plt;0.000 1），降低心（Plt;0.05）、肝（Plt;0.01）、脾（Plt;0.01）、肺（Plt;0.01）和腎（Pgt;0.05）的細(xì)菌載量，降低肝臟炎癥因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β（Plt;0.000 1）和IL-6（Plt;0.001）mRNA水平及腎臟炎癥因子IL-1β（Plt;0.05）和IL-6（Plt;0.01）mRNA水平；在體外鳶尾素對E. coli不具有抑菌效果，但可以促進(jìn)RAW 264.7吞噬（Plt;0.001）和清除E. coli，還能降低RAW 264.7的炎癥標(biāo)志物 IL-1β（Plt;0.000 1）、IL-6（Plt;0.000 1）和iNOS（Plt;0.001）mRNA水平。鳶尾素能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬和清除細(xì)菌，降低細(xì)菌感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎反應(yīng)，減輕細(xì)菌感染小鼠的組織損傷。

關(guān)鍵詞： 鳶尾素；巨噬細(xì)胞；炎癥；細(xì)菌感染

中圖分類號： S859.797；S855.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-5267-11

收稿日期：2024-01-03

基金項目：國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（2022YFD1800400）

作者簡介：安一娜（1994-），女，山西大同人，博士生，主要從事天然免疫與炎癥疾病研究，E-mail： ann269462@cau.edu.cn

*通信作者：董彥君，主要從事組織發(fā)育、病理生理研究，E-mail： yanjund@cau.edu.cn

Effects of Irisin on Tissue Damage and Bacterial Clearance in Mice Infected with Escherichia

coli

AN" Yina， TAN" Shuyu， FENG" Landi， BAO" Mingyue， LIU" Menghan， YIN" Qinhao， DONG" Yanjun*

（National Key Laboratory of Veterinary Public Health Security， College of Veterinary Medicine，

China Agricultural University， Beijing 100193，" China）

Abstract：" This study was conducted to investigate the effects of irisin on Escherichia coli （E. coli）-induced tissue damage in mice， and bacterial clearance and inflammation induced by macrophages. The mouse model was established by intraperitoneal infection with E. coli at a median lethal dose. The protective effect of irisin was evaluated by body temperature， clinical score， survival rate， degree of organ and tissue damage， bacterial load and inflammation level of tissue. E. coli was incubated with different concentrations of irisin in vitro， and the bacterial solution OD600 nm was detected by microplate reader to evaluate the antibacterial effect of irisin. After pretreatment of mouse mononuclear macrophages cells （RAW264.7） with irisin， macrophages were infected with E. coli， and cell lysates and mRNA were collected to evaluate the ability of macrophages to engulf and clear bacteria and the level of M1 polarization. Results showed that irisin could significantly improve the survival rate of bacterially infected mice， reduce the clinical score， promote body temperature recovery， and reduce the liver， lung and kidney damage （Plt;0.000 1）， decreased the bacterial load of heart （Plt;0.05）， liver （Plt;0.01）， spleen （Plt;0.01）， lung （Plt;0.01）， kidney （Pgt;0.05）， and reduced IL-1β （Plt;0.000 1） and IL-6 （Plt;0.001） mRNA levels in liver and interleukin （IL）-1β （Plt;0.05） and IL-6 （Plt;0.01） mRNA levels in kidney. Irisin did not inhibit the growth of E. coli in vitro， but promoted RAW264.7 phagocytosis （Plt;0.001） and clearance of E. coli， and also reduced the inflammatory marker IL-1β （Plt;0.000 1）， IL-6 （Plt;0.000 1） and iNOS （Plt;0.001） mRNA levels. Irisin can promote the phagocytosis and clearance of bacteria by macrophages， reduce the pro-inflammatory response of macrophages induced by bacterial infection， and alleviate tissue damage in mice.

Key words： irisin; macrophage; inflammation; bacterial infection

*Corresponding author：" DONG Yanjun， E-mail： yanjund@cau.edu.cn

細(xì)菌性疾病是制約畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。細(xì)菌性疾病使養(yǎng)殖動物生長受限，養(yǎng)殖周期延長，喪失市場競爭力，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并且嚴(yán)重的細(xì)菌感染還會引起膿毒癥導(dǎo)致動物死亡［1］。針對細(xì)菌性疾病，臨床上多用抗生素作為治療手段［2］。抗生素在有效清除細(xì)菌的同時，會導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)毒素大量釋放，過度激活免疫系統(tǒng)，加重機(jī)體炎癥損傷［3］，另一方面，長期使用抗生素會增加細(xì)菌耐藥的風(fēng)險［2］。近年來，人們一直在尋找“減抗、替抗”的方法，如何在有效治療細(xì)菌性疾病的同時減少抗生素的使用成為熱點(diǎn)科學(xué)問題。

巨噬細(xì)胞是單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中重要的組成部分，受局部微環(huán)境刺激，巨噬細(xì)胞會被誘導(dǎo)極化成為具有不同功能的M1或M2型巨噬細(xì)胞［4］。在機(jī)體清除病原微生物和促炎免疫應(yīng)答中，M1型巨噬細(xì)胞發(fā)揮著重要作用。具體表現(xiàn)為M0型的巨噬細(xì)胞受到細(xì)菌脂多糖、干擾素、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等誘導(dǎo)，極化為M1型巨噬細(xì)胞。M1巨噬細(xì)胞會分泌促炎因子（如IL-1β、IL-6和TNF等），還會產(chǎn)生具有殺傷活性的物質(zhì)（如一氧化氮、活性氧等）［5］；這些分子有助于巨噬細(xì)胞殺傷入侵的細(xì)菌，招募更多的免疫細(xì)胞清除入侵的病原微生物［5］。但是過度的炎癥反應(yīng)會引發(fā)炎癥風(fēng)暴，造成組織損傷［6-7］。因此，探尋能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞自身抗菌活性，同時還能防止過度炎癥的干預(yù)手段，對于有效控制細(xì)菌性疾病及減少抗生素的使用具有重要意義。

鳶尾素（irisin）是骨骼肌在響應(yīng)軀體運(yùn)動時分泌的一種小分子蛋白［8］。2012年，Bostrm等［9］首次發(fā)現(xiàn)鳶尾素，并報道鳶尾素能夠促進(jìn)白色脂肪轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣荆?-10］。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)鳶尾素可以調(diào)控炎癥反應(yīng)。鳶尾素能夠緩解LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷［11］、降低鐵死亡［12］。鳶尾素還參與調(diào)控巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答。鳶尾素通過PPAR-γ啟動巨噬細(xì)胞M2型極化，發(fā)揮抗炎作用［13］；還可以通過下調(diào)核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）抑制巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌［14］。雖然越來越多的研究開始聚焦于鳶尾素對巨噬細(xì)胞免疫功能的影響，但至今未有文獻(xiàn)報道鳶尾素在巨噬細(xì)胞吞噬清除細(xì)菌方面的作用。

因此，本研究著眼于細(xì)菌感染時，小鼠的臨床癥狀以及巨噬細(xì)胞功能的改變，旨在通過體內(nèi)外試驗(yàn)探究鳶尾素對炎癥應(yīng)答和巨噬細(xì)胞吞噬清除細(xì)菌的影響，為鳶尾素作為抗生素的輔助治療手段治療細(xì)菌性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

LB瓊脂、LB液體培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；卡那霉素、慶大霉素購自索萊寶公司；DMEM培養(yǎng)基、HS、FBS購自Gibco公司；蘇木素伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol、UltraSYBR Mixture，購自Thermo Fisher Scientific公司；重組鳶尾素蛋白購自康肽生物科技有限公司。

超低溫冰箱購自海爾股份有限公司；低速離心機(jī)購自中科中佳科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋購自精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；微量移液器、NanoDrop購自Thermo Fisher Scientific公司；Nikon 80i microscope購自Nikon公司。

1.2 試驗(yàn)菌株和細(xì)胞

大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922（用于體內(nèi)試驗(yàn)）及DH5α（用于體外試驗(yàn)）為本實(shí)驗(yàn)室保存；成纖維/脂肪祖細(xì)胞（fibro/adipogenic progenitor，F(xiàn)AP）為本實(shí)驗(yàn)室保存；RAW 264.7購自國家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

6周齡雌性C57BL/6J小鼠，體重16～18 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物平臺。所有動物護(hù)理和試驗(yàn)方案均經(jīng)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利與動物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：AW70702202-2-1）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW 264.7培養(yǎng)于含有10% FBS、1%青鏈霉素和1% L-谷氨酰胺的DMEM中［15］。FAP培養(yǎng)在含有20% FBS、10% HS、1%青鏈霉素、1% L-谷氨酰胺和2.5 ng·mL-1bFGF的DMEM中進(jìn)行增殖；隨后更換含有10% FBS、1%青鏈霉素、1% L-谷氨酰胺、0.25 μmol·L-1地塞米松、0.5 mmol·L-1 IBMX、1 μg·mL-1 insulin和 5 mmol·L-1 troglitazone的DMEM分化為脂肪細(xì)胞［16］。

1.4.2 細(xì)菌培養(yǎng)

將細(xì)菌液劃至含有卡那霉素的LB瓊脂板上，置于37℃培養(yǎng)約18 h，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)約14 h，取新鮮的菌液用于后續(xù)試驗(yàn)［15］。

1.4.3 鳶尾素活性檢測

將40 nmol·L-1 鳶尾素與分化后的FAP細(xì)胞共孵育48 h，收集細(xì)胞mRNA，分析鳶尾素對UCP1 mRNA含量的影響［9］。

1.4.4 動物試驗(yàn)設(shè)計

1.4.4.1 小鼠E. coli感染模型構(gòu)建：

18只體重16～18 g的6周齡雌性C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為107 CFU組、108 CFU組和109 CFU組，每組分別以107、108和109 CFU·只-1的劑量腹腔注射E. coli標(biāo)準(zhǔn)菌株。

1.4.4.2 鳶尾素對E. coli感染小鼠的影響：

36只體重16～18 g的6周齡雌性C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為3組，每組12只，分別為Control組（經(jīng)腹腔注射與鳶尾素和E. coli標(biāo)準(zhǔn)菌株等量PBS）、E. coli組（以2×108 CFU·只-1的劑量經(jīng)腹腔注射E. coli標(biāo)準(zhǔn)菌株，并在注射菌液前26和2 h分別經(jīng)腹腔注射與鳶尾素等量PBS）和E. coli+鳶尾素處理組（以2×108 CFU·只-1的劑量經(jīng)腹腔注射E. coli標(biāo)準(zhǔn)菌株，并在注射菌液前26和2 h經(jīng)腹腔注射0.5 μg·g-1鳶尾素）。

1.4.5 臨床癥狀觀察

在第0小時經(jīng)腹腔感染大腸埃希菌，分別在感染第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、36、42、48小時對小鼠的臨床狀態(tài)進(jìn)行評分［15，17］，測量小鼠體溫［15］。小鼠臨床評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.4.6 組織石蠟切片及HE染色

于細(xì)菌感染后48 h，收集小鼠組織，置于4%多聚甲醛進(jìn)行固定、酒精逐級脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片脫蠟至水、進(jìn)行HE染色、脫水、透明、封片。使用尼康Nikon 80i顯微鏡采集圖像［18-19］。根據(jù)肝細(xì)胞壞死、竇狀隙壞死和庫否細(xì)胞增生情況評價肝組織損傷水平；根據(jù)肺氣管和支氣管充血水腫、肺泡壁增厚、肺泡和間質(zhì)炎性滲出情況評價肺損傷水平；根據(jù)腎小球充血腫脹纖維化、腎小管上皮細(xì)胞腫脹壞死蛋白滲出和腎間質(zhì)炎性浸潤情況評價腎損傷水平［20］。

1.4.7 組織中細(xì)菌載量檢測

于細(xì)菌感染后48 h，收集小鼠組織，稱重后置于無菌PBS中進(jìn)行勻漿，梯度稀釋勻漿液，取10 μL稀釋前后各梯度的勻漿液滴加至無抗的LB瓊脂板上，靜置37℃培養(yǎng)18 h，計數(shù)瓊脂板上的菌落數(shù)量，計算每克組織含有的菌落數(shù)，CFU/g=總菌落數(shù)/組織質(zhì)量（g）［15］。

1.4.8 鳶尾素抑菌效果檢測

將濃度為0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg·mL-1的鳶尾素分別與E. coli于37℃孵育6 h，測量各組600 nm時的菌液OD值，檢測鳶尾素是否直接影響E. coli［15］。

1.4.9 鳶尾素對巨噬細(xì)胞吞噬殺菌影響的檢測

將 RAW 264.7接種于24孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)12 h替換為含有2% FBS的培養(yǎng)基，12 h后，用濃度為50 nmol·L-1的鳶尾素預(yù)處理細(xì)胞24 h。計細(xì)胞數(shù)，每孔約為3×106個細(xì)胞，將新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌以MOI=10∶1的比例感染細(xì)胞。37 ℃、5% CO2孵育1 h，移除原培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，加入0.5 mL 0.3% Triton裂解細(xì)胞，收集細(xì)

胞裂解液進(jìn)行梯度稀釋，取10 μL稀釋前后各梯度的懸液滴加至無抗的LB瓊脂板上，靜置37℃培養(yǎng)18 h，計數(shù)瓊脂板上的菌落數(shù)量。其余細(xì)胞加入含200 μg·mL-1慶大霉素的維持培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2孵育3 h，收集細(xì)胞裂解液，計數(shù)菌落數(shù)。剩余細(xì)胞加入含50 μg·mL-1慶大霉素維持培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時間后，收集相應(yīng)的細(xì)胞裂解液，計數(shù)菌落數(shù)。CFU/mL=總菌落數(shù)/0.5 mL［15］。

1.4.10 RNA的提取及qRT-PCR分析

收集組織或細(xì)胞，加入Trizol、氯仿充分震蕩混勻，室溫靜置10 min，12 000 r·min-1、4 ℃離心15 min；吸取上清加入等體積的異丙醇充分混勻，室溫靜置10 min，12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min；倒掉上清，加500 μL預(yù)冷的75%乙醇，充分重懸，12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，重復(fù)一次；棄去液體，充分干燥，加50 μL無酶水重懸，得到的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增（引物序列見表2）。擴(kuò)增程序：95℃ 10 s；60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束，以GAPDH為內(nèi)參，按2（sample Ct -GAPDH Ct） 計算各基因相對表達(dá)量［21-22］。

1.4.11 統(tǒng)計分析

結(jié)果以“x±s”表示。采用GraphPad Prism 8.4.3軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用t test法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 重組鳶尾素的活性鑒定

利用Western blot分析0.1、0.2 μg重組鳶尾素的分子量；結(jié)果顯示，重組鳶尾素條帶位置與理論值12.5 ku一致（圖1 A）。已有大量文獻(xiàn)報道［9-10，16］，鳶尾素能夠促進(jìn)白色脂肪棕色化，表現(xiàn)為棕色脂肪標(biāo)志物UCP1表達(dá)上調(diào)。因此，本研究使用由FAP分化的脂肪細(xì)胞與0.5 μg·mL-1 鳶尾素共孵育48 h。收集細(xì)胞mRNA，經(jīng)qRT-PCR分析鳶尾素的生物學(xué)活性。結(jié)果如圖1 B所示，與對照組（未用鳶尾素處理的FAP）相比，鳶尾素處理后的脂肪細(xì)胞中UCP1 mRNA水平顯著升高（Plt;0.05），上調(diào)約1.52倍。以上結(jié)果表明，重組鳶尾素具有生物學(xué)活性，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 鳶尾素對E. coli感染小鼠體溫、臨床評分及生存率的影響

有文獻(xiàn)報道，鳶尾素能夠降低LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，調(diào)控免疫細(xì)胞功能［11］。根據(jù)文獻(xiàn)可以推測，鳶尾素可能在細(xì)菌感染過程中也存在類似作用。因此，本研究使用E. coli經(jīng)腹腔感染小鼠構(gòu)建了細(xì)菌感染模型，以探究在細(xì)菌感染過程中鳶尾素對小鼠清除細(xì)菌和組織炎癥水平的影響。首先，為確定細(xì)菌感染小鼠的半數(shù)致死量，使用E. coli以107、108和109 CFU的劑量經(jīng)腹腔感染小鼠，連續(xù)觀察，記錄小鼠的死亡情況，直到生存率不再發(fā)生變化［23-24］；為了方便展示，生存曲線圖中的橫坐標(biāo)每格代表4 h。各組小鼠生存曲線如圖2A所示，按照改良寇氏法公式計算出E. coli感染小鼠的半數(shù)致死量約為2×108 CFU。經(jīng)腹腔注射鳶尾素（0.5 μg·g-1），并使用2×108 CFU的劑量感染小鼠，通過比較小鼠體溫、臨床評分和生存率，評價鳶尾素對細(xì)菌感染小鼠的影響。結(jié)果如圖2 B所示，在細(xì)菌感染后期，相比于細(xì)菌感染小鼠（E. coli組），鳶尾素處理組（E. coli+鳶尾素組）小鼠的體溫明顯回升；感染全過程E. coli+鳶尾素組小鼠的臨床評分均低于E. coli組小鼠（圖2 C）。生存曲線結(jié)果顯示，鳶尾素能夠明顯上調(diào)細(xì)菌感染小鼠的生存率；E. coli組的生存率僅為25%，而E. coli+鳶尾素組小鼠的生存率可達(dá)100%（圖2 D）。結(jié)果表明，鳶尾素能夠明顯升高細(xì)菌感染小鼠的生存率，緩解感染小鼠的臨床癥狀。

2.3 鳶尾素對E. coli感染小鼠的器官組織損傷及組織中細(xì)菌載量的影響

嚴(yán)重的細(xì)菌感染會引起膿毒癥，產(chǎn)生全身性的炎癥風(fēng)暴及器官損傷［1］。小鼠各器官的大體觀察顯示，與Control組小鼠相比，E. coli組小鼠肺肉眼可見呈粉紅色、充血腫脹，肝局部出現(xiàn)淤血、散在明顯的壞死灶，腸管出現(xiàn)明顯腫脹、部分腸管呈現(xiàn)透明狀；E. coli+鳶尾素組小鼠肺無明顯肉眼可見的病變，肝未出現(xiàn)明顯淤血但仍存在壞死灶，腸管輕微腫脹（圖3 A）。結(jié)果表明，鳶尾素能夠明顯降低細(xì)菌感染小鼠的器官病變；為了確認(rèn)這一結(jié)果，對小鼠肺、肝和腎組織進(jìn)行HE染色，進(jìn)一步分析鳶尾素對細(xì)菌感染小鼠組織的影響。結(jié)果如圖3B所示，E. coli組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死，存在細(xì)菌菌團(tuán)（如框內(nèi)所示），炎癥細(xì)胞浸潤明顯，竇狀隙增寬；肺可見大量的炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增厚；腎小球腫脹，基底膜增厚，

小管腫脹嚴(yán)重。相比于E. coli組，E. coli+鳶尾素組小鼠肝細(xì)胞變性壞死區(qū)域較小，肝細(xì)胞損傷較輕，未見明顯菌團(tuán)，竇狀隙增寬程度較輕；肺炎性細(xì)胞浸潤較少，肺泡壁增厚較輕；小管未見明顯腫脹。綜上，鳶尾素能夠明顯減輕E.coli感染引起的肺、肝及腎組織損傷，同時組織病理學(xué)評分也顯示相同的結(jié)果（圖3 C）。

隨后，收集小鼠的心、肝、脾、肺和腎，稱重，在無菌PBS中進(jìn)行勻漿，取勻漿液稀釋后滴板計數(shù)，檢測兩組小鼠各組織的細(xì)菌載量。結(jié)果如圖3 D所示，鳶尾素能夠明顯降低細(xì)菌感染小鼠心（Plt;0.05）、肝（Plt;0.01）、脾（Plt;0.01）、肺（Plt;0.01）和腎（Pgt;0.05）的細(xì)菌載量。

以上結(jié)果表明，細(xì)菌感染會損傷小鼠的各器官，并使組織中蓄積大量細(xì)菌；鳶尾素處理后的小鼠，組織損傷明顯較輕，各組織中的細(xì)菌載量明顯下降。因此，鳶尾素能夠協(xié)助機(jī)體清除入侵的細(xì)菌，減輕小鼠的組織損傷。

2.4 鳶尾素對E. coli感染小鼠炎癥應(yīng)答的影響

過強(qiáng)的炎癥風(fēng)暴是細(xì)菌感染導(dǎo)致組織損傷的重要原因之一［1，4］。為了探究鳶尾素減輕細(xì)菌感染小鼠組織損傷的原因，本研究分析了小鼠的肝和腎中炎癥因子水平。結(jié)果如圖4所示，相比于E. coli組，E. coli+鳶尾素組小鼠肝炎癥因子IL-1β（Plt;0.000 1）及IL-6（Plt;0.001）mRNA水平極顯著下調(diào)。與肝趨勢一致，E. coli+鳶尾素組腎中炎癥因子IL-1β（Plt;0.05）及IL-6（Plt;0.01）mRNA水平同樣顯著下調(diào)。以上結(jié)果表明，鳶尾素能夠降低細(xì)菌感染小鼠的炎癥水平，同時減輕組織損傷。

2.5 鳶尾素抑菌效果評價

前期的試驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)表明，鳶尾素能夠協(xié)助機(jī)體清除細(xì)菌，降低炎癥反應(yīng)，減輕細(xì)菌感染小鼠的組織損傷；接下來，將進(jìn)一步探究鳶尾素影響細(xì)菌清除和炎癥應(yīng)答的機(jī)制。首先，使用鳶尾素與細(xì)菌共孵育，檢測鳶尾素對E. coli的影響。使用濃度為0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000、32.000 μg·mL-1的鳶尾素分別與E. coli孵育6 h，隨后通過酶標(biāo)儀分析菌液在600nm處的吸光值。結(jié)果如表3所示，與未添加鳶尾素（0 μg·mL-1）相比，不同濃度鳶尾素處理的菌液吸光值沒有明顯差異；表明鳶尾素對E. coli沒有直接的抑菌效果。

2.6 鳶尾素對巨噬細(xì)胞吞噬和清除E. coli的影響

巨噬細(xì)胞作為重要的免疫細(xì)胞，在吞噬清除入侵的病原微生物中發(fā)揮重要作用［1］。改變巨噬細(xì)胞的吞噬和極化狀態(tài)，能夠影響機(jī)體清除細(xì)菌［25-26］。因此，本研究使用細(xì)菌感染的小鼠單核細(xì)胞系

RAW 264.7細(xì)胞作為體外模型，探究鳶尾素對巨噬細(xì)胞吞噬清除細(xì)菌的影響。鳶尾素與RAW 264.7細(xì)胞預(yù)孵育24 h，使用E. coli感染巨噬細(xì)胞1 h，然后使用慶大霉素處理細(xì)胞3 h（記為0 h），隨后在不同時間收集細(xì)胞并裂解，使用裂解液滴板計數(shù)計算細(xì)菌量。結(jié)果顯示，E. coli+鳶尾素組巨噬細(xì)胞吞噬的E.coli數(shù)量極顯著高于未添加鳶尾素組（E. coli組）（Plt;0.001）（圖5 A）。隨著培養(yǎng)時間的延長，E. coli+鳶尾素組細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)雖一直多于E.coli組；但E. coli+鳶尾素組的細(xì)菌清除速率明顯快于E. coli組（圖5 B）。以上結(jié)果表明，鳶尾素能夠極顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌，即使在細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)多的情況下，依然能夠快速清除胞內(nèi)的細(xì)菌。以上結(jié)果表明，鳶尾素在能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬和清除E. coli。

2.7 鳶尾素對巨噬細(xì)胞M1極化的影響

前期結(jié)果已經(jīng)表明，鳶尾素能夠降低細(xì)菌感染小鼠的炎癥應(yīng)答，減輕小鼠組織損傷。在細(xì)菌感染過程中，M1巨噬細(xì)胞會分泌大量的促炎因子，增強(qiáng)機(jī)體炎癥反應(yīng)，進(jìn)而造成機(jī)體損傷［1，6］。抑制巨噬細(xì)胞M1極化能夠顯著降低機(jī)體的炎癥應(yīng)答，降低炎癥損傷［27］。為了探究鳶尾素降低小鼠炎癥應(yīng)答的機(jī)制，本研究在體外分析了鳶尾素對巨噬細(xì)胞M1極化的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鳶尾素能夠極顯著降低巨噬細(xì)胞M1型標(biāo)志物IL-1β（Plt;0.000 1）、IL-6（Plt;0.000 1）和iNOS（Plt;0.001）mRNA水平（圖6）。以上結(jié)果表明，鳶尾素能夠降低巨噬細(xì)胞M1極化，防止過度的炎性反應(yīng)，避免過度的炎癥損傷。

3 討 論

1928年，首次發(fā)現(xiàn)青霉素，在此后的近百年間，抗生素被廣泛使用；同時，抗生素濫用和細(xì)菌耐藥性的問題隨之出現(xiàn)［2］。2022年的文獻(xiàn)報道，僅2019年，495萬人的死亡與細(xì)菌耐藥性有關(guān)；其中，127萬人直接死于細(xì)菌的抗生素耐藥［28］。即使臨床上合規(guī)使用抗生素，也會引起過敏、毒性、特異質(zhì)和二重感染等不良反應(yīng)［2］?？股刂委熯€可能會導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)毒素的大量釋放，

進(jìn)一步加重組織損傷［2］。為了避免過度依賴抗生素，解決細(xì)菌抗藥性增強(qiáng)的問題，非抗生素治療相關(guān)的研究受到了越來越多的關(guān)注；其中，免疫治療作為一種基于機(jī)體自身免疫系統(tǒng)的治療手段，可以避免治療效果不穩(wěn)定和過敏等問題［29］。

在利用免疫療法治療細(xì)菌感染的過程中，巨噬細(xì)胞發(fā)揮著重要作用［29］。作為機(jī)體防御病原微生物入侵的第一道防線，巨噬細(xì)胞可識別細(xì)菌，將其吞噬、消化，并產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞因子，形成炎癥微環(huán)境［30］。正常情況下，炎癥反應(yīng)在清除病原體后會迅速消退；但當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)不足以清除病原菌或因病理原因炎癥無法及時消退時，就可能產(chǎn)生過度的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而造成嚴(yán)重的組織損傷［31-32］。近些年，鳶尾素被發(fā)現(xiàn)具有抗炎作用。鳶尾素能夠拮抗NF-κB活化，抑制IL-6、TNF-α等炎癥因子的升高，減少肺泡巨噬細(xì)胞Ml型極化［33］。此外，還發(fā)現(xiàn)鳶尾素能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2極化［34］。但目前鳶尾素對巨噬細(xì)胞吞噬清除細(xì)菌的影響未見報道。本研究旨在揭示鳶尾素對巨噬細(xì)胞吞噬和清除細(xì)菌及相關(guān)炎癥應(yīng)答的影響，為鳶尾素的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

本研究使用的重組鳶尾素能夠顯著上調(diào)棕色脂肪標(biāo)志物UCP1 mRNA水平，表明重組鳶尾素具有生物學(xué)活性，可以用于探究鳶尾素對巨噬細(xì)胞吞噬清除細(xì)菌及炎癥反應(yīng)的影響。本研究使用E. coli構(gòu)建細(xì)菌感染小鼠模型，在體內(nèi)探究鳶尾素對細(xì)菌感染小鼠的影響。體內(nèi)的結(jié)果顯示，與單獨(dú)的細(xì)菌感染小鼠相比，經(jīng)腹腔注射給予鳶尾素的小鼠感染細(xì)菌后生存率明顯上升，鳶尾素處理的小鼠48 h存活率為100%，而單獨(dú)細(xì)菌感染的小鼠48 h生存率僅為25%；同時鳶尾素能夠降低細(xì)菌感染小鼠的臨床狀態(tài)評分、促進(jìn)體溫恢復(fù)、減輕組織損傷、降低組織中的細(xì)菌載量和炎癥反應(yīng)。雖然我們沒有監(jiān)測E. coli+鳶尾素組小鼠是否在48 h后出現(xiàn)死亡，但本研究結(jié)果顯示在細(xì)菌感染48 h時，E. coli+鳶尾素組的體溫基本回升到正常水平。且與E. coli組相比，E. coli+鳶尾素組小鼠表現(xiàn)出更低水平的組織損傷和促炎反應(yīng)，這些結(jié)果能夠說明鳶尾素確實(shí)能夠降低感染大腸埃希菌小鼠的組織損傷。值得注意的是，鳶尾素不能完全清除小鼠體內(nèi)的細(xì)菌，僅起到增強(qiáng)清除和降低炎癥的作用，完全清除細(xì)菌還需使用抗生素。因此，鳶尾素可以作為抗生素的輔助治療手段，降低抗生素的用量，增強(qiáng)清除細(xì)菌，防止過度炎癥。

由于巨噬細(xì)胞是清除病原菌和誘發(fā)促炎反應(yīng)的關(guān)鍵因素［30］。因此，本研究使用小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7進(jìn)一步探究鳶尾素對巨噬細(xì)胞清除細(xì)菌和炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，鳶尾素能夠明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬和清除E. coli，并且鳶尾素不會直接抑制E. coli增殖。這一結(jié)果表明，鳶尾素通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的功能促進(jìn)細(xì)菌清除。巨噬細(xì)胞另一個重要功能是分泌炎癥因子［30］，根據(jù)前期結(jié)果可以猜測鳶尾素能夠通過降低巨噬細(xì)胞的M1極化水平，降低炎癥應(yīng)答。為了驗(yàn)證這一猜想，本研究分析了鳶尾素處理后，巨噬細(xì)胞的極化情況，發(fā)現(xiàn)鳶尾素確實(shí)能夠降低巨噬細(xì)胞M1標(biāo)志物的表達(dá)。表明鳶尾素能夠通過降低巨噬細(xì)胞M1極化水平，降低細(xì)菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減輕組織損傷。M1巨噬細(xì)胞的主要特征是分泌促炎的細(xì)胞因子和吞噬清除入侵的病原微生物（例如細(xì)菌、病毒等）［30］。通常認(rèn)為，巨噬細(xì)胞接觸細(xì)菌會同時增強(qiáng)釋放促炎因子和吞噬異物的能力。但根據(jù)本研究的結(jié)果可知，炎癥因子的釋放和吞噬殺菌是兩個獨(dú)立的調(diào)控機(jī)制，在促進(jìn)巨噬細(xì)胞清除細(xì)菌的同時也可以降低促炎反應(yīng)、減輕組織損傷，這為抗細(xì)菌藥物的開發(fā)提供新思路。

4 結(jié) 論

在體內(nèi)，鳶尾素能夠改善細(xì)菌感染小鼠的臨床癥狀，增強(qiáng)細(xì)菌清除，降低炎癥損傷；在體外，鳶尾素能促進(jìn)巨噬細(xì)胞清除細(xì)菌，降低細(xì)菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。因此，鳶尾素可以作為一種潛在的抗菌增強(qiáng)劑輔助抗生素，通過調(diào)控巨噬細(xì)胞功能，治療細(xì)菌感染相關(guān)炎癥疾病。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ GALLI G， SALEH M. Immunometabolism of macrophages in bacterial infections［J］. Front Cell Infect Microbiol， 2021， 10：607650.

［2］ BARAN A， KWIATKOWSKA A， POTOCKI L. Antibiotics and bacterial resistance-a short story of an endless arms race［J］. Int J Mol Sci， 2023， 24（6）：5777.

［3］ KUANG Z S， LENG Y X， YANG N， et al. Inhibition of visfatin alleviates sepsis-induced intestinal damage by inhibiting Hippo signaling pathway［J］. Inflammat Res， 2022， 71（7-8）：911-922.

［4］ PARK M D， SILVIN A， GINHOUX F， et al. Macrophages in health and disease［J］. Cell， 2022， 185（23）：4259-4279.

［5］ SHAPOURI-MOGHADDAM A， MOHAMMADIAN S， VAZINI H， et al. Macrophage plasticity， polarization， and function in health and disease［J］. J Cell Physiol， 2018， 233（9）：6425-6440.

［6］ JAIN N， MOELLER J， VOGEL V. Mechanobiology of macrophages：how physical factors coregulate macrophage plasticity and phagocytosis［J］. Ann Rev Biomed Eng， 2019， 21（1）：267-297.

［7］ LONG A， KLEINER A， LOONEY R J. Immune dysregulation［J］. J Allergy Clin Immunol， 2023， 151（1）：70-80.

［8］ ELIZONDO-MONTEMAYOR L， MENDOZA-LARA G， GUTIERREZ-DELBOSQUE G， et al. Relationship of circulating irisin with body composition， physical activity， and cardiovascular and metabolic disorders in the pediatric population［J］. Int J Mol Sci， 2018， 19（12）：3727.

［9］ BOSTRM P， WU J， JEDRYCHOWSKI M P， et al. A PGC1-α-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis［J］. Nature， 2012， 481（7382）：463-468.

［10］ LUO X M， LI J W， ZHANG H L， et al. Irisin promotes the browning of white adipocytes tissue by AMPKα1 signaling pathway［J］. Res Vet Sci， 2022， 152：270-276.

［11］ LI Q， TAN Y， CHEN S N， et al. Irisin alleviates LPS-induced liver injury and inflammation through inhibition of NLRP3 inflammasome and NF-κB signaling［J］. J Recept Signal Transduct Res， 2021， 41（3）：294-303.

［12］ QIONGYUE Z， XIN Y， MENG P， et al. Post-treatment with irisin attenuates acute kidney injury in sepsis mice through anti-ferroptosis via the SIRT1/Nrf2 pathway［J］. Front Pharmacol， 2022， 13：857067.

［13］ MA Y， DU Y， YANG J， et al. Anti-inflammatory effect of Irisin on LPS-stimulated macrophages through inhibition of MAPK pathway［J］. Physiol Res， 2023， 72（2）：235-249.

［14］ MAHGOUB M O， D’SOUZA C， AL DARMAKI R S M H， et al. An update on the role of irisin in the regulation of endocrine and metabolic functions［J］. Peptides， 2018， 104：15-23.

［15］ YIN W J， LING Z R， DONG Y J， et al. Mobile colistin resistance enzyme MCR-3 facilitates bacterial evasion of host phagocytosis［J］. Adv Sci（Weinh）， 2021， 8（18）：2101336.

［16］ YANG J J， WANG K Z， AN Y N， et al. Mst1/2 is necessary for satellite cell differentiation to promote muscle regeneration［J］. Stem Cells， 2022， 40（1）：74-87.

［17］ WEBER G F， CHOUSTERMAN B G， HE S， et al. Interleukin-3 amplifies acute inflammation and is a potential therapeutic target in sepsis［J］. Science， 2015， 347（6227）：1260-1265.

［18］ PENG X G， XIAO Z C， ZHANG J， et al. IL-17A produced by both γδ T and Th17 cells promotes renal fibrosis via RANTES-mediated leukocyte infiltration after renal obstruction［J］. J Pathol， 2014， 235（1）：79-89.

［19］ WANG H D， GAO M， LI J B， et al. MMP-9-positive neutrophils are essential for establishing profibrotic microenvironment in the obstructed kidney of UUO mice［J］. Acta Physiol， 2019， 227（2）：e13317.

［20］ HOU L C， QIN M Z， ZHENG L N， et al. Severity of sepsis is correlated with the elevation of serum high-mobility group box 1 in rats［J］. Chin Med J （Engl）， 2009， 122（4）：449-454.

［21］ AN Y N， REN Y Q， WANG J， et al. MST1/2 in PDGFRα+ cells negatively regulates TGF-β-induced myofibroblast accumulation in renal fibrosis［J］. Am J Physiol Renal Physiol， 2022， 322（5）：F512-F526.

［22］ WANG J， TIAN J J， SUN J， et al. Two identified subsets of CD8 T cells in obstructed kidneys play different roles in inflammation and fibrosis［J］. Aging （Albany NY）， 2020， 12（17）：17528-17540.

［23］ ZHOU H X， XIE P F， QIU M S， et al. Arbidol increases the survival rate by mitigating inflammation in suckling mice infected with human coronavirus OC43 virus［J］. J Med Virol， 2023， 95（9）：e29052.

［24］ 顏嘉怡， 張 靜， 王 彬， 等. 血必凈注射液靜脈和口服給藥防治膿毒癥藥效特點(diǎn)研究［J］. 藥物評價研究， 2023， 46（11）：2360-2365.

YAN J Y， ZHANG J， WANG B， et al. Study on pharmacodynamic characteristics of Xuebijing Injection for prevention and treatment of sepsis by intravenous and oral administration［J］. Drug Evaluation Research， 2023， 46（11）：2360-2365. （in Chinese）

［25］ GENG J， SHI Y R， ZHANG J J， et al. TLR4 signalling via Piezo1 engages and enhances the macrophage mediated host response during bacterial infection［J］. Nat Commun， 2021， 12（1）：3519.

［26］ GENG J， SUN X F， WANG P， et al. Kinases Mst1 and Mst2 positively regulate phagocytic induction of reactive oxygen species and bactericidal activity［J］. Nat Immunol， 2015， 16（11）：1142-1152.

［27］ ZHOU X， LI W Y， WANG S， et al. YAP aggravates inflammatory bowel disease by regulating M1/M2 macrophage polarization and gut microbial homeostasis［J］. Cell Rep， 2019， 27（4）：1176-89. e5.

［28］ Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019：a systematic analysis［J］. Lancet， 2022， 399（10325）：629-655.

［29］ WALLIS R S， O’GARRA A， SHER A， et al. Host-directed immunotherapy of viral and bacterial infections：past， present and future［J］. Nat Rev Immunol， 2023， 23（2）：121-133.

［30］ IWASAKI A， MEDZHITOV R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system［J］. Science， 2010， 327（5963）：291-295.

［31］ YOSHIMURA A， ITO M， CHIKUMA S， et al. Negative regulation of cytokine signaling in immunity［J］. Cold Spring Harb Perspect Biol， 2018， 10（7）：a028571.

［32］ MA A， MALYNN B A. A20：linking a complex regulator of ubiquitylation to immunity and human disease［J］. Nat Rev Immunol， 2012， 12（11）：774-785.

［33］ HAN Z X， MA J， HAN Y， et al. Irisin attenuates acute lung injury by suppressing the pyroptosis of alveolar macrophages［J］. Int J Mol Med， 2023， 51（4）：32.

［34］ TU Y M， LIU J Z， KONG D Q， et al. Irisin drives macrophage anti-inflammatory differentiation via JAK2-STAT6-dependent activation of PPARγ and Nrf2 signaling［J］. Free Radic Biol Med， 2023， 201：98-110.

（編輯 白永平）