柚皮苷可通過多種途徑修復(fù)豬胸膜肺炎放線桿菌誘導(dǎo)的小鼠肺上皮屏障損傷

摘 要： 旨在研究柚皮苷（naringin，NAR）對豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）感染引起小鼠肺上皮屏障損傷的防治效果。將40只6～8周齡的雄性昆明小鼠隨機分為5組，分別為對照組、模型組、NAR低劑量組、NAR中劑量組以及NAR高劑量組。連續(xù)灌胃給藥8 d，空白組和模型組給予生理鹽水。在第7天，小鼠以氣管插管灌注的方式感染APP（1×108 CFU·mL-1，100 μL·只-1），空白組灌注等體積無菌生理鹽水，各組小鼠于造模后48 h處死，采樣并評估NAR的防治作用。通過X射線圖像表明，NAR可降低小鼠肺泡灌洗液中APP載菌量，并且能夠緩解肺部病理損傷；此外，NAR干預(yù)后，可逆轉(zhuǎn)由于APP誘導(dǎo)的小鼠肺組織中ZO-1、Occludin-1和Claudin-1緊密連接蛋白的表達降低，從而促進肺上皮屏障修復(fù)。為進一步探討NAR促進肺上皮屏障修復(fù)的機制，研究發(fā)現(xiàn)NAR不僅減少小鼠肺組織中促炎因子IL-6和TNF-α的分泌，還增加了抑炎因子IL-10表達，同時能夠增加抗氧化酶SOD2和Hmox1表達，表明NAR能夠增強機體抗炎及抗氧化能力；此外，NAR可抑制TGF-β1/Smad2/3通路，減少由APP誘導(dǎo)的肺纖維組織增生；通過分析凋亡相關(guān)關(guān)鍵蛋白和Tunel熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，NAR可呈劑量依賴性的減少細(xì)胞凋亡。綜上所述，NAR可通過抗炎、抗氧化、抗纖維化和抗凋亡等途徑，修復(fù)小鼠肺上皮屏障損傷，從而有效逆轉(zhuǎn)APP誘導(dǎo)的肺部炎癥損傷、發(fā)揮防治APP的功效。

關(guān)鍵詞： 天然藥物；柚皮苷；豬胸膜肺炎放線桿菌；豬；肺上皮屏障損傷

中圖分類號： S853.74

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-5299-11

收稿日期：2023-12-26

基金項目：“十四五”國家重點研發(fā)項目（2022YFD1801103）；國家自然科學(xué)基金（32002328）；甘肅省重點研發(fā)計劃項目（22JR5RA038；21YF5FA166；23YFNA0010；23YFFA0014）；蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（2021-1-159；2022-RC-21）

作者簡介：黃麒霖（1998-），女，重慶涪陵人，碩士生，主要從事中藥天然免疫研究，E-mail：kylin70521834@163.com

*通信作者：辛蕊華，主要從事中藥天然免疫與中獸藥產(chǎn)品研發(fā)，E-mail：xinruihua@caas.cn；仇正英，主要從事獸醫(yī)病理學(xué)研究，E-mail：qiumoying@163.com

Naringin Repairs Actinobacillus pleuropneumoniae-induced Lung Epithelial Barrier

Damage in Mice via Multiple Pathways

HUANG" Qilin1， LIU" Chen1， JING" Xiaohan1， HUANG" Lina2， PAN" Xiangyi1， SHI" Xiongwei1， QIU" Zhengying1*， XIN" Ruihua1*

（1.Key Laboratory of Veterinary Drug Creation， Ministry of Agriculture and

Rural Affairs， and Gansu Engineering and Technology Research Centre of Chinese Veterinary

Drugs， Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Chinese Academy of

Agricultural Sciences，" Lanzhou 730050，" China;

2.State Key Laboratory of Applied Organic

Chemistry， College of Pharmacy， Lanzhou University， Lanzhou 730013， "China）

Abstract： The effect of naringin （NAR） on the prevention and treatment of lung epithelial barrier damage induced by Actinobacillus pleuropneumoniae （APP） infection in mice was investigated. Forty male Kunming mice between 6 and 8 weeks of age were randomly divided into five groups， namely， the control group， the model group， the NAR low-dose group， the NAR medium-dose group and the NAR high-dose group. The drug was administered by gavage continuously for 8 d. The blank and model groups were given saline. On d 7， mice were infected with APP （1×108 CFU·mL-1， 100 μL per mouse） by tracheal intubation， and the blank group was infused with an equal volume of sterile saline， and the mice in each group were executed at 48 h after modelling， sampled and evaluated for the preventive effect of NAR. X-ray images showed that NAR reduced the APP load in the alveolar lavage fluid of mice and alleviated the pathological lung injury; moreover， NAR intervention reversed the APP-induced decrease in the expression of ZO-1， Occludin-1， and Claudin-1 tight junction proteins in the lung tissues of mice， thus promoting the repair of the lung epithelial barrier. To further explore the mechanism of NAR promoting lung epithelial barrier repair， it was found that NAR not only reduced the secretion of pro-inflammatory factors IL-6 and TNF-α， but also increased the expression of anti-inflammatory factor IL-10， and increased the expression of antioxidant enzymes SOD2 and Hmox1 in mouse lung tissues， suggesting that NAR enhances the anti-inflammatory and antioxidant capacity of the organism. In addition， NAR can inhibit the TGF-β1/Smad2/3 pathway， reduce APP-induced proliferation of lung fibrotic tissue; analysis of key proteins related to apoptosis and Tunel fluorescent labelling revealed that NAR could reduce apoptosis in a dose-dependent manner. In conclusion， NAR can repair the lung epithelial barrier damage in mice through anti-inflammatory， antioxidant， anti-fibrotic and anti-apoptotic pathways， thus effectively reversing APP-induced inflammatory lung injury and exerting the efficacy of preventing and controlling APP.

Key words： natural medicine; naringin; Actinobacillus pleuropneumoniae; pig; lung epithelial barrier injury

*Corresponding authors：" XIN Ruihua， E-mail： xinruihua@caas.cn; QIU Zhengying， E-mail： qiumoying@163.com

豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是引起豬傳染性胸膜肺炎（porcine pleuropneumonia， PCP）重要的病原體，主要侵襲豬的扁桃體和上呼吸道，并在肺部定植和繁殖［1］。PCP在臨床上急性病例以急性出血性、壞死性肺炎為特征［2］，亞急性病變以纖維組織包圍的多灶性肺壞死為特征，慢性病例以肺組織局部壞死和慢性纖維素性胸膜肺炎為特征［3］。近年來，PCP在我國多地頻發(fā)，且致死率逐年倍增，對養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失［4］。目前，疫苗接種和抗生素治療是該病的主要防治手段，但由于APP血清型較多［5］，疫苗交叉免疫力弱，加劇了養(yǎng)殖業(yè)對抗生素的依賴程度，使得APP對抗生素的耐藥性與日俱增［6-7］，導(dǎo)致對于該病的防治愈發(fā)困難，而且抗生素殘留也增加了食品安全的風(fēng)險。因此，研發(fā)防治APP的藥物，早已迫在眉睫。

中藥具有多靶點、廣效能、綠色環(huán)保和耐藥風(fēng)險低等優(yōu)勢［8］。應(yīng)用中藥化橘紅治療呼吸系統(tǒng)疾病在中國已有數(shù)千年的歷史，根據(jù)清朝《本經(jīng)逢原》和《本草綱目拾遺》中記載，化橘紅具有祛風(fēng)寒、化痰、止咳、潤肺等功效，而NAR是其重要的黃酮類化合物［9］。不僅如此，NAR還廣泛存在于蕓香科水果果皮中［10］，不僅擁有傳統(tǒng)藥學(xué)溯源，且兼顧藥食同源、資源豐富、價格低廉等優(yōu)勢。多項研究表明，NAR對呼吸道疾病具有良好的治療作用，其作用機制包括抗炎［11］、抗氧化［12-13］、抗纖維化［14］和抗凋亡［15-16］等；而NAR對APP誘導(dǎo)的肺損傷的防治效果及作用機制尚不明確。

肺上皮屏障作為肺組織的第一道防線，在呼吸系統(tǒng)的防御中發(fā)揮重要作用，其主要由微血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和細(xì)胞間連接蛋白組成［17］；其中緊密連接蛋白是維持正常上皮屏障功能的重要結(jié)構(gòu)蛋白，以ZO-1、Occludin-1和Claudin-1為主導(dǎo)［18］。這些緊密連接蛋白使相鄰細(xì)胞膜緊靠在一起，形成環(huán)繞細(xì)胞的物理屏障結(jié)構(gòu)，保護機體免受病原微生物的侵害［19］。當(dāng)APP入侵機體時，會誘發(fā)過度的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)［20］，通過損傷上皮細(xì)胞及緊密連接蛋白，削弱氣道上皮屏障完整性，引起肺部功能受損［21］；其次，受損的肺上皮屏障易為體外的病原微生物提供可乘之機，進一步加劇了炎癥和氧化損傷，這種持續(xù)損傷可誘發(fā)肺組織纖維化［22］；此外，當(dāng)肺組織中細(xì)胞受到強烈損傷會破壞細(xì)胞核中DNA，此時受損的細(xì)胞會激活凋亡程序以維持組織的正常功能，但過度的細(xì)胞凋亡也會加重組織損傷，使機體穩(wěn)態(tài)失衡［23］。綜上所述，肺上皮屏障受損可能會提高機體對APP的易感性，進而引發(fā)更進一步的損傷。因此，在本研究中，通過構(gòu)建小鼠APP肺損傷模型，探究NAR通過抗炎、抗氧化、抗纖維化和抗凋亡等多重機制發(fā)揮修復(fù)肺上皮屏障損傷的功效，為NAR防治APP提供試驗依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

NAR購自上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；Bax、Bcl-2、Caspase 3、Cleaved-Caspase 3、ZO-1、Occludin-1、Claudin-1、TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3抗體購自Affinity 公司；GAPDH購自Cell Signaling Technology公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；變性蛋白預(yù)制膠（濃度4%～15%）、Tris-glycine-SDS電泳緩沖液（10×）、Tris-glycine-SDS轉(zhuǎn)膜緩沖液（10×）、TBS-T漂洗緩沖液（10×）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、脫脂奶粉、Prestained Protein Marker（11～190 ku）購自上海雅酶生物科技有限公司；NC膜購自武漢博士德生物工程有限公司；Trizol購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；IL-6、TNF-α和IL-10 ELISA試劑盒、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、無菌PBS溶液購自北京索萊寶科技有限公司。TUNEL試劑盒（11684817910），瑞士羅氏公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)菌、試驗動物和處理方法

本實驗室保藏的APP分離自豬場，已經(jīng)測序Blast比對鑒定。40只SPF級昆明雄性小鼠，體重18～20 g購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所（許可證號：SCXK甘肅2023-016）。動物福利聲明遵守機構(gòu)倫理和動物護理指南，所有程序均根據(jù)中國實驗動物護理和使用指南（方案編號：IACUC-157031）進行。將小鼠隨機分為5組，分別為對照組（Control）、模型組（Model）、NAR低劑量組（NARL，20 mg·kg-1）、NAR中劑量組（NARM，40 mg·kg-1）以及NAR高劑量組（NARH，80 mg·kg-1）。連續(xù)灌胃給藥8 d，空白組和模型組給予生理鹽水。在第7 天，小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg·kg-1）麻醉，用氣管插管術(shù)感染APP（每只灌注100 μL，菌液濃度為1×108 CFU·mL-1），空白組灌注等體積無菌生理鹽水，各組小鼠于造模成功48 h后麻醉，X射線檢查（DRGEM X射線成像系統(tǒng)）后，處死，取不同樣本用于后續(xù)試驗。

1.3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）的制備和分析

處死小鼠后，每組隨機取3只小鼠打開胸腔進行氣管插管，用4℃預(yù)冷的PBS進行支氣管肺泡灌洗3次，每次0.5 mL，收集共約1.2 mL灌洗液（回收率80%）。然后，通過平板劃線將BALF接種在含5%胎牛血清和1%NAD的TSB固體培養(yǎng)基中，并放置于37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。計算BALF中的菌落數(shù)，并分離單個菌株用于測序驗證。

1.4 實時熒光定量PCR分析

使用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞或肺組織總RNA，根據(jù)PrimeScript RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR預(yù)混Ex Taq II試劑及應(yīng)用生物系統(tǒng)實時熒光定量PCR系統(tǒng)，利用2-ΔΔCt方法參考β-actin內(nèi)參基因，對靶基因mRNA轉(zhuǎn)錄進行定量分析，靶基因引物序列見表1。

1.5 蛋白質(zhì)印跡分析

用PMSF裂解液處理肺組織或細(xì)胞，4℃離心收集上清液作為蛋白質(zhì)提取物并根據(jù)二喹啉甲酸測定法（BCA）測量蛋白質(zhì)樣品的濃度。將等量的蛋白質(zhì)樣本用8%～12% SDS-PAGE分離，然后電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore，MA，USA）中。將膜用5%脫脂牛奶室溫密封1.5 h，并分別用Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Caspase 3（1∶1 000）、Cleaved-Caspase 3（1∶1 000）、ZO-1（1∶1 000）、Occludin-1（1∶1 000）、Claudin-1（1∶1 000）、TGF-β1（1∶1 000）、Smad2（1∶1 000）、Smad3（1∶1 000）、p-Smad2（1∶1 000）、p-Smad3（1∶1 000）抗體孵育，加入HRP偶聯(lián)的山羊抗鼠IgG二抗（1∶5 000）或HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）后，通過

化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒對膜進行可視化，使用Biosciences Imager進行檢測，GAPDH作為參考蛋白質(zhì)進行比較。此外，將磷酸化蛋白質(zhì)針對它們各自的總蛋白質(zhì)進行對比。條帶的灰度值由Image J軟件分析計算。

1.6 ELISA

收集小鼠肺組織，在預(yù)冷PBS中清洗去除血液，將清洗好的組織放入含有1 mL PBS的離心管中并在組織研磨機上研磨15 s，最后以3 500 g離心15 min，取上清備用。之后，用IL-6、TNF-α和IL-10 ELISA試劑盒檢測炎癥反應(yīng)水平。所有程序均按照試劑盒的說明進行。

1.7 組織病理學(xué)檢查

收集小鼠的肺組織，在4%中性甲醛中固定24 h，包埋在石蠟中，然后切成5 μm厚。切片用Masson染色與組織免疫熒光。將切片置于顯微鏡（DM 4000B，德國徠卡）下觀察小鼠肺組織。

1.8 組織免疫熒光染色

切片脫蠟至水后浸入EDTA緩沖液進行抗原修復(fù)，之后用3%BSA室溫封閉30 min后，4℃一抗孵育過夜。玻片PBS洗滌后，滴加二抗避光室溫孵育50 min。接著避光DAPI復(fù)染細(xì)胞核，將玻片清洗甩干后，滴加抗熒光淬滅劑封片。使用IF激光掃描共聚焦顯微鏡（NIKON ECLIPSE C1，日本尼康），觀察488 nm（綠色）和405 nm（藍色）的激發(fā)波長下的熒光圖像。

切片脫蠟至水后浸入EDTA緩沖液進行微波抗原修復(fù)，待自然冷卻，用3% BSA室溫封閉30 min；使用TUNEL試劑盒（11684817910，瑞士羅氏），制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用50 μL TdT+450 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻；而陰性對照組僅加50 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液，陽性對照組先加入100 μL DNase 1，后面步驟同處理組。玻片干后，加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液（陰性對照組僅加50 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液）于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中37℃反應(yīng)1 h。玻片PBS洗滌后，可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡細(xì)胞（激發(fā)光波長為450～500 nm，檢測波長為515～565 nm）；DAPI復(fù)染核，PBS漂洗3次，每次8 min；抗熒光淬滅劑封片。使用IF激光掃描共聚焦顯微鏡（NIKON ECLIPSE C1，日本尼康），觀察488 nm（綠色）和405 nm（藍色）的激發(fā)波長下的熒光圖像。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Image J對 Western blot圖片進行處理。各數(shù)據(jù)均以“x±s”表示，數(shù)據(jù)先行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布且方差齊選用 One-Way ANOVA法進行各組間比較，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。SPSS 27用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，GraphPad Prism 9用于作圖。

2 結(jié) 果

2.1 NAR對APP誘導(dǎo)小鼠肺組織損傷具有緩解作用

利用X射線檢查、肺泡灌洗液病原菌分析NAR對APP肺炎的預(yù)防干預(yù)效果。由于肺部病原菌載菌量與肺炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，因此檢測小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中APP菌落的數(shù)量，結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織中載菌量較高，NAR干預(yù)后，BALF中APP細(xì)菌含量顯著降低（Plt;0.05）（圖1C）。細(xì)菌稀釋涂布平板法的結(jié)果表明，模型組小鼠BALF中的APP菌落數(shù)最多（3.13×108 CFU·mL-1），而低劑量組、中劑量組和高劑量組在NAR作用下的APP菌落數(shù)分別為1.74×108、0.85×108和0.36×108 CFU·mL-1（圖1B），表明NAR可減少肺中APP載菌量，且呈劑量依賴性。X射線檢查結(jié)果顯示，空白組小鼠雙肺紋理清晰，未見明顯實質(zhì)性浸潤，兩側(cè)肋膈角銳利明晰，未見明顯異常，APP感染組小鼠肺部實變密度增高，雙肺紋理增粗紊亂，邊緣模糊，兩側(cè)肋膈角模糊，而NAR干預(yù)后各劑量組癥狀均有所緩解（圖1D）。

2.2 NAR可修復(fù)由APP誘導(dǎo)的小鼠肺上皮屏障損傷

緊密連接蛋白在肺上皮屏障功能中發(fā)揮重要的防御作用。為了探索APP對小鼠肺上皮屏障功能的影響，通過對肺組織中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin-1和Claudin-1的表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)APP感染后，小鼠肺組織中這些蛋白相較于空白組表達量顯著降低（Plt;0.05），APP感染后會破壞肺上皮屏障功能。NAR干擾后，能夠顯著抑制肺組織中由于APP誘導(dǎo)的緊密連接蛋白表達量下降（圖2 A、B）；同時，基因檢測分析也證實NAR可劑量依賴性地促進小鼠肺組織中這些緊密連接蛋白的基因表達水平（圖2C）。因此，NAR可通過修復(fù)肺上皮屏障功能，從而緩解由APP引起的肺上皮屏障損傷。

2.3 NAR對APP引起的肺部損傷具有抗炎和抗氧化作用

過度的炎癥反應(yīng)和氧化損傷是造成肺上皮屏障損傷的重要誘因。通過檢測促炎因子TNF-α和IL-6及抑炎因子IL-10的表達水平，發(fā)現(xiàn)與空白組相比，APP感染促進小鼠肺組織中促炎因子IL-6、TNF-α的表達，降低抑炎因子IL-10的表達（Plt;0.05），然而NAR干預(yù)后可降低APP誘導(dǎo)的小鼠肺組織中TNF-α和IL-6的過度表達，并且提高了肺組織中IL-10的表達水平，緩解APP引起的小鼠肺組織中炎癥因子分泌失衡（圖3A）；進一步對抗氧

化酶SOD2和Hmox1進行檢測，發(fā)現(xiàn)模型組肺組織中SOD2和Hmox1的表達顯著下降，而NAR給藥后均顯著增加（Plt;0.05）（圖3B）。結(jié)果提示，NAR可通過抗炎和抗氧化作用，調(diào)控炎癥因子平衡，緩解氧化應(yīng)激，降低APP引起的肺部損傷。

2.4 NAR可抑制TGF-β1/Smad2/3信號通路緩解肺纖維化

通過Masson染色法觀察各組小鼠肺組織纖維化程度及病理損傷（圖4A）。結(jié)果顯示，空白組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)內(nèi)無明顯膠原纖維沉積。模型組小鼠的黏膜上皮出現(xiàn)損傷，肺泡結(jié)構(gòu)被明顯破壞，肺泡腔內(nèi)出血，肺泡間隔增厚并充實肺小葉，肺泡隔膜出現(xiàn)膠原纖維沉積，血管及支氣管周圍組織出現(xiàn)疏松、水腫及纖維化形成等病理現(xiàn)象。NAR干預(yù)后，各劑量組與模型組相比肺組織損傷存在不同程度的降低，尤其在高劑量組中，氣管結(jié)構(gòu)較完整，氣管黏膜上皮細(xì)胞排列較整齊，肺泡壁結(jié)構(gòu)恢復(fù)，纖維化程度減輕，僅有少量膠原纖維沉積。為探究NAR抑制肺纖維化的潛在機制，進一步檢測小鼠肺組織中TGF-β1/Smad2/3通路中蛋白表達水平。結(jié)果表明，相較于空白組，模型組肺組織中TGF-β1和p-Smad2/3的表達量升高，NAR處理后有所下調(diào)（圖4B）。通過Image J對 Western blot圖片進行灰度值計算，結(jié)果同樣表明NAR可通過抑制TGF-β1/Smad2/3信號通路的活化從而發(fā)揮抗纖維化的作用（圖4C）。

2.5 NAR可抑制細(xì)胞凋亡緩解肺損傷

當(dāng)細(xì)胞受到強烈的損傷時，受損的細(xì)胞會進行程序性死亡（凋亡），以維持組織正常功能，但過度凋亡也會加重組織損傷。在細(xì)胞凋亡信號通路中，活化的Caspase-3和Bax是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)，而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白。通過Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，APP感染會顯著增加小鼠肺組織中裂解的Caspase-3和Bax蛋白水平，降低肺組織中Bcl-2蛋白的表達。NAR干預(yù)后，可顯著減弱肺組織中Caspase-3和Bax蛋白的裂解、增加Bcl-2蛋白表達（圖5A、B）。通過熒光Tunel標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，與空白組相比模型組小鼠肺組織中凋亡的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，而NAR干預(yù)后各組肺組織中細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著降低，并呈劑量依賴性（圖5C）。結(jié)果表明，NAR能夠通過抑制肺組織中Caspase-3和Bax活化、降低Bcl-2蛋白表達，從而抑制因APP感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

3 討 論

NAR具有豐富的藥理活性，如抗炎［24］、抗氧化［25］、抗凋亡［26］和抗纖維化［27］等藥理活性，對呼吸系統(tǒng)疾病具有良好的治療效果［28］。本試驗探究了NAR對APP誘導(dǎo)的小鼠肺炎的防治作用。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，小鼠感染 APP后48 h時小鼠出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，因此在后期試驗選擇APP感染后48 h進行相關(guān)指標(biāo)評價。通過X射線檢測發(fā)現(xiàn)，APP感染后小鼠肺組織出現(xiàn)雙肺紋理增粗紊亂，肺部實變密度增高，邊緣模糊等癥狀，這與Brauer等［29］的發(fā)現(xiàn)一致，而NAR給藥后，其癥狀明顯減輕。APP入侵后在體內(nèi)大量增殖［30］，模型組小鼠肺組織載菌量顯著高于空白組，而NAR給藥后肺組織中APP載菌量顯著降低，且呈劑量依賴性。結(jié)果表明，NAR可通過抑制APP增殖，進而緩解肺組織損傷。

APP入侵機體后，破壞宿主上皮屏障的完整性，引起血漿滲透到肺泡間隙，阻礙正常的氣體交換，從而加劇靶器官或組織缺氧的癥狀［31］。緊密連接蛋白在維持上皮屏障完整性方面發(fā)揮重要作用，主要包括ZO-1、Occludin-1和Claudin-1在內(nèi)的緊密連接蛋白［32］。在本研究中，分別從蛋白和基因水平對小鼠肺組織中ZO-1、Occludin-1和Claudin-1的表達量進行檢測。結(jié)果表明，NAR能夠緩解APP誘導(dǎo)產(chǎn)生的緊密連接蛋白表達降低，從而恢復(fù)肺上皮屏障功能。肺上皮屏障破損后所導(dǎo)致的炎癥與氧化損傷加劇，被認(rèn)為是APP感染誘導(dǎo)肺損傷的另一個重要因素，可導(dǎo)致肺功能繼續(xù)惡化。APP感染機體后，所攜帶的多種毒力因子觸發(fā)一系列炎癥級聯(lián)反應(yīng)，激活促炎因子的釋放，如TNF-α、IL-6等，持續(xù)的炎癥損傷會進一步激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，并誘導(dǎo)上皮細(xì)胞增生和凋亡［33-35］。本研究發(fā)現(xiàn)，NAR不僅能夠降低小鼠肺組織中促炎因子IL-6、TNF-α的表達，并提高抑炎因子IL-10表達，而且還促進肺組織中抗氧化酶SOD2、Hmox1的表達，表明NAR通過抗炎和抗氧化作用緩解APP感染所導(dǎo)致的肺損傷。

前期研究發(fā)現(xiàn)，NAR具有緩解肺纖維化的藥理作用［36］，本研究通過Masson染色發(fā)現(xiàn)，APP感染后小鼠肺組織出現(xiàn)明顯病變，如肺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡腔內(nèi)出血，肺泡間隔增厚，肺泡隔膜膠原纖維沉積，血管及支氣管周圍疏松結(jié)締組織出現(xiàn)水腫和纖維化形成，且部分病變出現(xiàn)纖維組織包圍的多灶性肺壞死；而NAR干預(yù)后，小鼠肺組織纖維化病變程度呈劑量依賴性減輕，表明NAR可一定程度逆轉(zhuǎn)由APP誘導(dǎo)的纖維化水平。由于TGF-β1/Smad2/3信號通路失調(diào)是組織纖維化的重要致病機制［37］，主要包括TGF-β1刺激肺上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），并通過Smad2/3通路促進肺纖維化［38］。本研究發(fā)現(xiàn)，NAR可抑制TGF-β1/Smad2/3信號通路活化，從而減弱APP引起的肺纖維化。此外，本研究發(fā)現(xiàn)APP感染后會引起細(xì)胞過度凋亡［39］，而NAR各劑量組均降低了小鼠肺組織中凋亡蛋白Bax和Caspase-3的活化程度，并增加肺組織中Bcl-2的表達水平?！癟UNEL”是末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端標(biāo)記的縮寫，可通過用修飾的核苷酸對 3′-OH 末端進行酶促標(biāo)記來檢測細(xì)胞凋亡早期 DNA 鏈斷裂的形成，這種方法被廣泛用于檢測細(xì)胞凋亡［40］。本試驗通過熒光TUNEL標(biāo)記試驗，發(fā)現(xiàn)與空白組相比，APP感染后小鼠肺組織中細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加，而NAR干預(yù)后細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著減少。結(jié)果表明NAR可通過減少細(xì)胞凋亡，從而緩解由APP引起的肺部損傷。

4 結(jié) 論

本研究表明，NAR能夠通過促進修復(fù)肺上皮屏障、恢復(fù)肺上皮屏障功能達到防治APP的目的。其作用機制主要通過減輕肺組織炎癥和氧化應(yīng)激損傷、抑制TGF-β1/Smad2/3信號通路減緩肺纖維化以及逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的損傷，從而發(fā)揮抗APP感染的功效。本研究結(jié)果闡述了NAR治療APP的作用機制，為其作為防治APP的新型天然藥物提供理論依據(jù)。

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（編輯 白永平）