非洲豬瘟病毒p30蛋白與CRM197的融合表達(dá)及對(duì)小鼠的免疫原性評(píng)價(jià)

摘 要： 非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、高傳染性和致死性的傳染病，對(duì)豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的影響。安全有效的疫苗和有效治療藥物的缺乏給非洲豬瘟防控帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。作者嘗試設(shè)計(jì)一種融合蛋白以改善非洲豬瘟病毒p30的免疫原性。白喉毒素的無(wú)毒突變體CRM197已被成功地用作多糖-蛋白結(jié)合疫苗的載體蛋白，以增強(qiáng)多糖的免疫原性。本研究構(gòu)建p30與CRM197催化結(jié)構(gòu)域（A片段）的融合表達(dá)質(zhì)粒，純化后的重組蛋白和單獨(dú)p30分別使用小鼠評(píng)價(jià)了其免疫原性。結(jié)果顯示：通過(guò)原核表達(dá)與親和層析純化得到融合蛋白p30-CRM197（A）免疫小鼠后，較單獨(dú)表達(dá)的p30其可以在更短的時(shí)間內(nèi)激發(fā)起高水平針對(duì)p30的特異性IgG，并且在初次免疫后56 d后還能維持較高水平的淋巴細(xì)胞免疫活力。本研究結(jié)果表明，CRM197的A片段作為載體蛋白顯著增強(qiáng)原核表達(dá)p30蛋白的免疫原性，其可作為非洲豬瘟亞單位疫苗的候選分子內(nèi)佐劑。

關(guān)鍵詞： 非洲豬瘟；CRM197；p30；免疫原性

中圖分類號(hào)： S852.659.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）11-5230-08

收稿日期：2024-01-02

基金項(xiàng)目：“十四五”重點(diǎn)研發(fā)子課題（2021YFD1801304）

作者簡(jiǎn)介：張 琦（1999-），女，山東濱州人，碩士生，主要從事動(dòng)物疫病防治研究，E-mail：1658735668@qq.com

*通信作者：孟春春，主要從事動(dòng)物傳染病和預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：mengcc@shvri.ac.cn；蘇 艷，主要從事動(dòng)物傳染病診斷技術(shù)及免疫防控的研究與教學(xué)，E-mail：2006au@163.com

Fusion Expression of African Swine Fever Virus p30 Protein and CRM197 and Evaluation

of Its Immunogenicity in Mice

ZHANG" Qi1，2， DONG" Ningning1， TAN" Xiaomei2， SHI" Zhengwang3， LI" Na2， ZHU" Wenqi1， TANG" Aoxing2， LI" Chuanfeng2， ZHU" Jie2， LIU" Guangqing2， SU" Yan1*， MENG" Chunchun1，2*

（1.Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052，" China;

2.Shanghai Veterinary Research

Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Shanghai 200241，" China;

3.Lanzhou Veterinary Research Institute，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730050，" China）

Abstract：" African swine fever is an acute， highly contagious and deadly infectious disease caused by the African swine fever virus， which has had a huge impact on the pig breeding industry. The lack of vaccines and effective therapeutic drugs has brought great challenges to the prevention and control of African swine fever. We tried to design a fusion protein to improve the immunogenicity of African swine fever virus p30. CRM197， a non-virulent mutant of diphtheria toxin， has been successfully used as a carrier protein in polysaccharide-protein conjugate vaccines to enhance the immunogenicity of polysaccharides. In this study， a fusion expression plasmid of p30 and CRM197 catalytic domain （A fragment） was constructed， and the immunogenicity of the purified recombinant protein and p30 alone were evaluated using mice. After immunizing mice with the fusion protein p30-CRM197（A） purified by prokaryotic expression and affinity chromatography， p30 alone could excite a high level of specific IgG against p30 in a shorter period of time， and maintain a high level of lymphocyte immune activity two months after the initial epidemic. The results of this study showed that the A fragment of CRM197 alone could significantly enhance the immunogenicity of prokaryotic expression p30 protein as a protein carrier， and it could be used as a candidate intramolecular adjuvant for African swine fever subunit vaccine.

Key words： African swine fever; CRM197; p30; immunogenicity

*Corresponding authors：" MENG Chunchun， E-mail： mengcc@shvri.ac.cn; SU Yan， E-mail：2006au@163.com

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種高度傳染性的出血性疾病，被國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）列為法定報(bào)告疫病，也是我國(guó)重點(diǎn)防范的一類動(dòng)物疫病。2018年8月，我國(guó)在遼寧省沈陽(yáng)市發(fā)現(xiàn)首例非洲豬瘟病例，并迅速蔓延到全國(guó)多地［1］。截至目前，非洲豬瘟已在我國(guó)暴發(fā)過(guò)多起，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是危害養(yǎng)豬業(yè)的“頭號(hào)殺手”。

迄今為止，還沒(méi)有安全有效的疫苗預(yù)防和控制非洲豬瘟［2］，針對(duì)ASF疫苗的研究始于20世紀(jì)60年代，由于其擁有龐大的基因組結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的免疫逃逸機(jī)制，為疫苗研發(fā)工作帶來(lái)諸多困難［3］。目前正在研究的ASF疫苗包括滅活疫苗、減毒活疫苗和基因工程疫苗。滅活疫苗不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，所以基本上是不可行的一種策略［4］。非洲豬瘟減毒疫苗雖然有一定效果，但是其安全性仍然具有極大不確定性［5-6］。目前最安全有效的策略是開(kāi)發(fā)亞單位疫苗，以特異性抗原為核心的ASFV亞單位疫苗受到了廣泛關(guān)注，如p54、p30、p72、CD2v這些參與了病毒附著和內(nèi)化多個(gè)步驟的病毒蛋白［7］。已初步證實(shí)，使用桿狀病毒表達(dá)的重組p54和p30蛋白免疫后可對(duì)強(qiáng)毒攻擊提供不同程度的保護(hù)水平，從延遲疾病發(fā)作到完全保護(hù)［8］。在同一系統(tǒng)中表達(dá)的嵌合p54/p30也取得了一些成功，免疫豬產(chǎn)生了中和抗體，并在野毒攻擊后存活［9］。

白喉毒素（diphtheria toxin，DT）及其交叉反應(yīng)物質(zhì)197（cross-reacting material 197，CRM197）得到了很好的研究［10］。DT由兩個(gè)片段組成：A片段（aa 1-190），包含催化C結(jié)構(gòu)域，B片段包含跨膜（T）和受體結(jié)合（R）結(jié)構(gòu)域。CRM197在A片段的第52位氨基酸由甘氨酸變?yōu)楣劝彼?，從而消除了其?xì)胞毒性［11］。然而其仍然保留了很強(qiáng)的免疫原性，并與DT特異性受體結(jié)合，因此已成功地應(yīng)用于多糖-蛋白結(jié)合疫苗。CRM197已被用作幾種獲得許可的多糖-蛋白結(jié)合疫苗的載體蛋白，包括PREVNAR7、PREVNAR13和hibitter［12］。例如，用于預(yù)防肺炎的Prevnar 13是一種結(jié)合疫苗，由13種血清型的肺炎球菌多糖與CRM197共價(jià)結(jié)合而成［13］。與CRM197偶聯(lián)［14］有助于分泌Th1和Th2的T細(xì)胞迅速增加，并隨后產(chǎn)生細(xì)胞因子，進(jìn)而誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖和抗原特異性抗體分泌，從而增強(qiáng)其偶聯(lián)的多糖的免疫原性。CRM197作為分子內(nèi)佐劑的益處已與其他蛋白質(zhì)一起得到證實(shí)：Tobias等［15］最近發(fā)現(xiàn)，位于人表皮生長(zhǎng)因子受體2上的雜交肽移植到CRM197上后，可誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答和抗腫瘤活性。由于CRM197具有較強(qiáng)的免疫原性，無(wú)毒性，可作為載體蛋白使用。作者嘗試使用CRM197的A片段作為載體蛋白與ASFV的p30蛋白進(jìn)行融合表達(dá)并進(jìn)行小鼠免疫評(píng)價(jià)，來(lái)評(píng)估CRM197的A片段是否可以有效地增強(qiáng)p30蛋白的免疫原性，為非洲豬瘟亞單位疫苗的研發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

BALB/c小鼠購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司?？焖貲NA連接酶、DNA膠回收試劑盒和高保真DNA聚合酶購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；BeyoGoldTM His-tag Purification Resin （耐還原型）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；美國(guó)通用Rehydragel@LV鋁佐劑購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 重組質(zhì)粒pET-32a-p30-CRM197（A）的構(gòu)建

原核表達(dá)質(zhì)粒 pCold Ⅰ-p30質(zhì)粒由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所魏建超研究員提供。CRM197基因序列由NCBI下載（GenBank登錄號(hào)： KU521393.1）由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成。將p30與CRM197的A片段使用柔性Linker（GGGGSGGGGS）串聯(lián)表達(dá)，由SnapGene設(shè)計(jì)兩對(duì)擴(kuò)增引物，如表1所示，由上海生工生物工程股份有限公司合成。按照諾唯贊公司多片段同源重組試劑盒（貨號(hào)：c113）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，次日將陽(yáng)性的單克隆菌落送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，將比對(duì)正確的單克隆菌落進(jìn)行質(zhì)粒的提取，獲得構(gòu)建成功的重組pET-32a-p30-CRM197（A）質(zhì)粒。

1.3 p30蛋白和融合蛋白p30-CRM197的原核表達(dá)及純化

將pCold Ⅰ-p30和重組的pET-32a-p30-CRM197（A）質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）后，將陽(yáng)性菌落進(jìn)行少量誘導(dǎo)，pColdⅠ-p30質(zhì)粒陽(yáng)性的菌液在37℃搖床培養(yǎng)至OD600 nm為0.8時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG（1 mmol·L-1），轉(zhuǎn)至16 ℃搖床培養(yǎng)20 h；pET-32a-p30-CRM197（A）質(zhì)粒陽(yáng)性菌液的OD600 nm至0.4時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG（1 mmol·L-1），繼續(xù)在37 ℃搖床培養(yǎng)8 h。將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液在離心收集菌體，后用PBS將菌體重懸進(jìn)行超聲破碎，將超聲破碎徹底后的菌液進(jìn)行離心，收集上清和沉淀。將蛋白樣品分別進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

根據(jù)12% SDS-PAGE的結(jié)果分析，確定p30蛋白和p30-CRM197（A）融合蛋白均是在包涵體表達(dá)。將包涵體用8 mol·L-1尿素重懸，室溫過(guò)夜溶解，離心收集上清，在透析袋中透析復(fù)性，將成功復(fù)性后蛋白溶液使用碧云天生產(chǎn)的His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化。

1.4 小鼠免疫及免疫原性評(píng)價(jià)

1.4.1 小鼠免疫程序制定

在上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)買24只4周齡BALB/c雌鼠，將小鼠分為4組，分別為PBS組、p30組、p30+AL佐劑組和p30-CRM197（A）+AL佐劑組，每組6只小鼠。PBS組每只小鼠免疫PBS 200 μL，p30組每只小鼠免疫p30蛋白50 μg，p30+AL佐劑組每只小鼠免疫p30蛋白50 μg與AL佐劑（體積1∶1），p30-CRM197（A）+AL佐劑組每只小鼠免疫p30-CRM197（A）蛋白50 μg和AL佐劑（體積1∶1），共免疫3次，每次免疫間隔14 d。

1.4.2 小鼠血清中特異性抗體IgG的測(cè)定

用碳酸鹽緩沖液（0.05 mol·L-1， pH9.6）將純化的p30蛋白稀釋至1 μg·mL-1，加入96孔酶標(biāo)板，4 ℃包被過(guò)夜。洗滌，使用5%的脫脂牛奶進(jìn)行封閉，4 ℃封閉10 h。洗滌，用PBS稀釋小鼠血清，加入酶標(biāo)板，37℃孵育30min。洗滌，每孔加入用抗體稀釋液1∶15 000稀釋的山羊抗鼠IgG-HRP（Abcam公司， ab6915），37 ℃孵育30 min。洗滌，每孔加入50 μL TMB，37℃避光條件下顯色12 min，每孔加入50 μL終止液，用酶標(biāo)儀讀取OD450 nm值。

1.4.3 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平測(cè)定

初次免疫后56 d，每組取3只小鼠，眼眶取血，并處死取脾，使用小鼠脾淋巴細(xì)胞分離試劑盒（索萊寶生物有限公司）分離淋巴細(xì)胞，將免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞（2×106個(gè)細(xì)胞）接種于96孔板，用p30蛋白（20 μg·mL-1），在37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中刺激72h；無(wú)抗原刺激的做空白對(duì)照。采用CCK-8方法檢測(cè)增殖水平。

1.4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群

初次免疫后56 d，每組取3只小鼠，眼眶取血，并處死取脾，使用小鼠脾淋巴細(xì)胞分離試劑盒（索萊寶生物有限公司）分離淋巴細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。設(shè)置不染色對(duì)照組，單染管及樣品管。不染色對(duì)照組直接取淋巴細(xì)胞懸液即可；單染管分別使用PE anti-mouse CD3，F(xiàn)ITC anti-mouse CD4和APC anti-mouse CD8a（Biolegend）與淋巴細(xì)胞懸液冰上避光孵育30 min；樣品管即同時(shí)加入上述3種抗體淋巴細(xì)胞懸液冰上避光孵育30 min。單染管和樣品管與熒光抗體結(jié)束后，加入Cell Staining Buffer洗兩次（350 ×g離心5 min），上流式細(xì)胞儀分析。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

分別擴(kuò)增p30和CRM197（A）如圖1A和1B所示，陽(yáng)性條帶膠回收后用于同源重組。挑取重組后的菌落對(duì)目的基因p30-CRM197（A）進(jìn)行菌液PCR鑒定如圖1C所示。隨后將陽(yáng)性菌送上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pET32a-p30-CRM197（A）構(gòu)建成功。

2.2 p30蛋白和融合蛋白p30-CRM197（A）的原核表達(dá)及純化

分別將誘導(dǎo)結(jié)束后的菌體，進(jìn)行超聲破碎，收集全菌、上清及沉淀樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE，結(jié)果顯示，p30蛋白和p30-CRM197（A）均主要存在包涵體中（圖2A、B）。收集p30蛋白和融合蛋白p30-CRM197（A）洗脫液樣品，分別進(jìn)行12% SDS-PAGE鑒定（圖2C、D）。

2.3 ELISA測(cè)定特異性抗體IgG效價(jià)

通過(guò)ELISA方法檢測(cè)免疫后小鼠血清中p30的特異性抗體IgG的水平，結(jié)果（圖3）顯示，在一免之后，p30+AL組和p30-CRM197（A）+AL組均顯著提高了IgG的水平，尤其是p30-CRM197（A）+AL組可以在短時(shí)間內(nèi)激起高水平的IgG。

2.4 脾淋巴細(xì)胞增殖

初次免疫后56 d，采集脾，分離脾淋巴細(xì)胞，測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖情況，CCK-8結(jié)果如圖4所示，p30-CRM197（A）+AL組脾淋巴細(xì)胞比較其他組有顯著的特異性增殖，相對(duì)于沒(méi)有接受抗原刺激的空白對(duì)照組比較增殖倍數(shù)為4左右。

2.5 T細(xì)胞亞群分型

初次免疫后56 d，分別取各組小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5A所示，p30-CRM197（A）+AL組的CD4+T淋巴細(xì)胞比例最高，達(dá)78.41%，而PBS組CD8+T淋巴細(xì)胞比例最高為26.44%。作者還分析了CD4+/CD8+不同組別與PBS組之間的差異性，由圖5B結(jié)果所示，p30-CRM197（A）+AL組與PBS組的差異性最為顯著，有顯著的增強(qiáng)。

3 討 論

先前的研究表明，CRM197是一種具有輔助性T細(xì)胞表位的載體蛋白，可以激活輔助性T細(xì)胞獲取抗原［16］。因此，當(dāng)CRM197載體蛋白與莢膜多糖結(jié)合時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)更強(qiáng)的抗體反應(yīng)和免疫記憶［17］。然而，通過(guò)基因融合將CRM197或其功能域與另一種蛋白質(zhì)共融合表達(dá)的方式來(lái)提高免疫原性尚未得到完全評(píng)估［18］。A片段作為CRM197的催化結(jié)構(gòu)域，盡管52位的氨基酸突變使其酶活性降低，但仍然保留了與DT特異性受體結(jié)合并刺激人體體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力［19］。Wang等［18］設(shè)計(jì)了E2與CRM197催化結(jié)構(gòu)域（A片段）的融合蛋白，并在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中評(píng)價(jià)了其抗原性、免疫原性和疾病預(yù)防效果，試驗(yàn)結(jié)果證明CRM197的結(jié)構(gòu)域（A片段）可以單獨(dú)作為分子內(nèi)佐劑。因此，作者評(píng)估了CRM197的功能域（即A片段）作為分子內(nèi)佐劑的潛力。

ASFV的基因組極其復(fù)雜，編碼多種與免疫逃逸相關(guān)的蛋白質(zhì)。因此，開(kāi)發(fā)安全有效的非洲豬瘟疫苗仍然是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)［20-21］。目前，亞單位疫苗具有較高的安全性，但其保護(hù)效果不是很理想。因此，有必要開(kāi)發(fā)更多的免疫保護(hù)性抗原或組合，或加速抗原的識(shí)別和呈遞，迅速產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，以產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫保護(hù)作用［7］。ASFV的p30蛋白可以作為參與病毒內(nèi)化的必需蛋白，有研究結(jié)果顯示，用抗p30抗體預(yù)處理可以抑制豬巨噬細(xì)胞和Vero細(xì)胞95%以上的病毒內(nèi)化。然而，p30誘導(dǎo)的中和抗體不足以提供有效的免疫保護(hù)［22］。

在本研究中，p30-CRM197（A）蛋白在小鼠免疫試驗(yàn)中相較于單獨(dú)的p30蛋白具有更好的免疫原性。ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明，p30-CRM197（A）融合蛋白在更短的時(shí)間內(nèi)激起小鼠較高水平的體液免疫反應(yīng)。評(píng)價(jià)脾淋巴細(xì)胞的增殖能力，能夠有效地評(píng)估疫苗的免疫效果［16］，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，p30-CRM197（A）組與空白對(duì)照組有顯著差異性（Plt;0.01），這表明CRM197的A片段作為載體蛋白可以增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫水平。

T細(xì)胞是一個(gè)不均一的細(xì)胞群體，分類方法有多種，按細(xì)胞表面分化抗原（cluster of differentiation，CD）的不同，可分為CD4+和CD8+兩大亞群。CD4+T細(xì)胞識(shí)別MHC Ⅱ類分子所提呈的外源性抗原肽，活化后主要分化為輔助性T淋巴細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞識(shí)別MHC Ⅰ類分子所提呈的內(nèi)源性抗原肽，活化后主要分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，兩者的比值常用于評(píng)價(jià)機(jī)體免疫系統(tǒng)的狀態(tài)［23］。在初次免疫后56 d，作者對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行流式鑒定，發(fā)現(xiàn)p30-CRM197（A）組的 CD4 + /CD8 +比值與對(duì)照組有顯著的增強(qiáng)?？梢?jiàn)CRM197（A）不論是從體液免疫還是細(xì)胞免疫水平，均增強(qiáng)了p30的免疫原性，證明CRM197的A片段載體蛋白可以增強(qiáng)亞單位疫苗的免疫效果。

4 結(jié) 論

CRM197（A）作為載體蛋白，不論是從體液免疫還是細(xì)胞免疫水平，均增強(qiáng)了p30的免疫原性，也進(jìn)一步證明了CRM197的A片段載體蛋白可以增強(qiáng)亞單位疫苗的免疫效果。然而，需要進(jìn)一步的研究來(lái)評(píng)估其在豬上的免疫效力和攻毒保護(hù)，還需要篩選更多的ASFV免疫原性蛋白和CRM197的A片段組合，并優(yōu)化免疫方案。本研究為ASFV亞單位疫苗的佐劑選擇提供了新的參考方向。

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（編輯 白永平）