口蹄疫病毒Asia1型豬源中和抗體的篩選與抗原表位鑒定

摘 要： Asia1型口蹄疫病毒（FMDV）仍然在我國周邊國家存在，對我國畜牧業(yè)造成長期威脅。本研究旨在利用單個B細(xì)胞抗體技術(shù)研制Asia1型FMDV的中和性單克隆抗體，以此為工具，鑒定Asia1型FMDV的保護性抗原位點。以FMDV Asia1/JS/05為誘餌抗原，通過流式細(xì)胞術(shù)分選免疫豬PBMCs中的抗原特異性B細(xì)胞，通過巢式PCR擴增單個B細(xì)胞IgG抗體重鏈與輕鏈可變區(qū)基因序列，分別構(gòu)建IgG抗體重鏈與輕鏈表達(dá)質(zhì)粒，將其共轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞進行抗體表達(dá)；通過間接ELISA、間接免疫熒光試驗（IFA）、病毒中和試驗（VNT）驗證抗體反應(yīng)性和中和活性，利用免疫印跡、中和抗體逃逸突變株篩選鑒定中和抗體所識別的抗原表位類型和抗原表位關(guān)鍵氨基酸。結(jié)果顯示：獲得了5株反應(yīng)性良好的Asia1型FMDV特異性抗體，其中PD3和PD7為中和抗體，兩株中和抗體識別相同表位，關(guān)鍵氨基酸為VP2蛋白72位殘基（D）。本研究首次獲得Asia1型FMDV特異性豬源中和抗體，鑒定VP2 72D是中和表位的關(guān)鍵氨基酸，進一步豐富了Asia1型FMDV抗原位點信息，為FMDV Asia1型分子疫苗和新診斷檢測技術(shù)研究的奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 口蹄疫病毒；Asia1型；豬源單克隆抗體；抗原表位

中圖分類號： S852.659.6

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-5211-11

收稿日期：2024-01-17

基金項目：“十四五”國家重點研發(fā)項目（2021YFD1800300）

作者簡介：董開恒（1998-），男，甘肅武威人，碩士，主要從事動物微生物與免疫及分子生物學(xué)研究，E-mail：1593853715@qq.com

*通信作者：張小麗，主要從事動物微生物與免疫學(xué)方面的研究，E-mail：zhxl228@qq.com；盧曾軍，主要從事動物病毒學(xué)與免疫學(xué)研究，E-mail： luzengjun@caas.cn

Screening and Identification of the Antigenic Epitope of Pig Neutralizing Antibodies

against Foot-and-mouth Disease Virus Serotype Asia 1

DONG" Kaiheng1， HUANG" Shulun2，3， LI" Fengjuan2，3， LI" Kun2，3， LIU" Guo1， ZHANG" Qiang2，3， BAO" Huifang2，3， LI" Hongxuan2，3， LU" Zengjun2，3*， ZHANG" Xiaoli1*

（1.College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，" China;

2.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， National Foot-and-Mouth

Diseases Reference Laboratory， College of Veterinary Medicine， Lanzhou University，

Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730000，" China; 3.Gansu Province Research Center for Basic Disciplines of Pathogen Biology， Lanzhou 730046， China）

Abstract：" Foot-and-mouth disease virus （FMDV） serotype Asia 1 is still circulating in Asia countries around China， which will be a long-term threat to animal husbandry. The aim of this study was to screen porcine monoclonal neutralizing antibodies against Asia1 FMDV using single B-cell antibody technology， and to identify the antigenic sites recognized by neutralizing antibodies. FMDV Asia1/JS/05 inactivated whole virus particles were used as the bait antigen to sort antigen-specific B cells in PBMCs of immunized porcine by flow cytometry. The sequences of variable regions of the heavy and light chain of the IgG were amplified by nested PCR. The expression plasmids of the IgG heavy and light chain were constructed respectively and co-transfected into CHO-S cells to express the whole IgG antibodies. The reactivity and neutralization ability of expressed antibodies were verified by indirect ELISA， indirect immunofluorescent assay （IFA） and viral neutralizing test （VNT）. The epitopes as well as the critical amino acids recognized by the neutralized antibody were identified using Western blot and neutralizing antibody escape mutants screening. Five Asia 1 FMDV-specific antibodies were obtained， of which PD3 and PD7 showed neutralizing ability. These two neutralizing antibodies recognized the same epitope and the key amino acids residue was D 72 of the VP2 protein. In this study， neutralizing antibody against Asia 1 FMDV from pig were obtained for the first time， which provides further information of the protective antigen sites of Asia1 FMDV， and make a basis for the design of molecular vaccine and the development of new tools for diagnosis of FMD Asia 1.

Key words： foot-and-mouth disease virus; serotype Asia 1; porcine monoclonal antibody; antigenic epitope

*Corresponding authors：" LU Zengjun， E-mail： luzengjun@caas.cn; ZHANG Xiaoli， E-mail： zhxl228@qq.com

口蹄疫（foot-and-mouth disease， FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus， FMDV）引起的急性、熱性、高度接觸性動物疫病，主要侵害豬、牛、羊等重要家畜和其它偶蹄動物［1］。FMDV為無囊膜單股正鏈RNA病毒，屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，存在A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3共7種血清型［2］。疫苗免疫是防控FMD的主要手段，但FMDV抗原變異性大，不同血清型之間不存在交叉免疫保護；同一血清型內(nèi)不同譜系之間也存在抗原性差異，導(dǎo)致免疫失?。?］。因此，病毒抗原結(jié)構(gòu)解析和保護性抗原位點鑒定一直是FMDV抗原變異研究和疫苗研發(fā)的焦點［4］。

FMDV病毒衣殼由60分子的VP1、VP2、VP3、VP4組成，VP1、VP2和VP3暴露于病毒衣殼表面，VP4襯于衣殼蛋白內(nèi)部。FMDV抗原位點研究多數(shù)集中于O型FMDV，O型FMDV表面已鑒定出5個功能獨立的抗原位點，其次為A型FMDV，而Asia1型FMDV抗原位點信息報道相對"" 較少。已有研究表明，A型SEA97譜系G1和G2分支毒株存在保守抗原位點［5］，O型和A型FMDV間存在跨血清型中和位點［6］。單個B細(xì)胞抗體技術(shù)是近年發(fā)展起來的研制自然宿主源單克隆抗體的新技術(shù)，該技術(shù)主要通過流式細(xì)胞術(shù)分選單個抗原特異性B細(xì)胞，分別擴增其輕/重鏈基因，經(jīng)體外表達(dá)獲得基因工程抗體。該方法具有重、輕鏈基因天然配對、基因多樣性豐富等優(yōu)點，是目前單克隆抗體制備的熱門方法［7］。

本研究以FMDV Asia1/JS/05為誘餌抗原，通過流式分選抗原特異性B細(xì)胞，利用巢氏PCR擴增獲得豬源抗體重、輕鏈基因序列后，在CHO-S細(xì)胞進行了抗體的表達(dá)；通過間接ELISA、間接免疫熒光試驗（IFA）和病毒中和試驗（VNT）驗證表達(dá)抗體的反應(yīng)性和中和活性［8］；通過免疫印跡、中和抗體逃逸突變株序列測定、逃逸株中和試驗，鑒定中和抗體所識別表位及其關(guān)鍵氨基酸，為Asia 1型FMDV抗原結(jié)構(gòu)解析、分子疫苗、血清學(xué)檢測方法的建立提供了有力工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、毒株、質(zhì)粒

乳倉鼠腎細(xì)胞（Baby Hamster Syrian Kidney Cells，BHK21）、中國倉鼠卵巢細(xì)胞系（Chinese Hamster Ovary Cells，GibcoTM CHO-STM Cells）、FMDV毒株Asia1/JS/05均由國家口蹄疫參考實驗室保存；含豬IgG重鏈基因的載體pVH-pcDNA3.4、κ輕鏈基因的載體pVK-pcDNA3.4、λ輕鏈基因的載體pVL-pcDNA3.4，由蘭州獸醫(yī)研究所宿主抗病毒感染與免疫生物學(xué)團隊構(gòu)建并保存。

1.1.2 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基購自上海達(dá)特希爾生物科技有限公司，淋巴細(xì)胞分離液（Histopaque-1077， 1.077 g·mL-1）、FITC標(biāo)記的兔抗豬IgG抗體購自Sigma-Aldrich公司。生物素標(biāo)記試劑盒（EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin）、單細(xì)胞裂解試劑盒（Single Cell Lysis Kit）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（SS VILO MASTERMIX）、ExpiFectamineTM CHO 轉(zhuǎn)染試劑盒購于Invitrogen公司。一步RT-PCR擴增試劑盒（HiScipt II One Step RT-PCR Kit）購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。小鼠抗豬IgG-FITC抗體購于Mybiosource公司。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的小鼠抗豬標(biāo)簽抗體購于南京金斯瑞生物科技公司。無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購于天根生化科技有限公司。MONTANIDE ISA 201油佐劑購自上海SEPPIC特殊化學(xué)品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原生物素化及電鏡觀察

在國家口蹄疫參考實驗生物安全三級實驗室進行病毒的增殖培養(yǎng)。利用BHK21細(xì)胞進行FMDV/Asia1/JS/05病毒的傳代，收集病毒液后滅活處理，經(jīng)毒力安全檢查確認(rèn)無安全風(fēng)險后，采用蔗糖密度梯度離心法純化病毒抗原。參照試劑盒說明書進行Asia1/JS/05滅活146S抗原的生物素化標(biāo)記，標(biāo)記抗原記為Asia1-FMDV-Biotin。分別取Asia1/JS/05抗原和Asia1-FMDV-Biotin進行磷鎢酸染色，通過透射電鏡觀察驗證生物素標(biāo)記前后FMDV病毒粒子的完整性；取Asia1/JS/05和Asia1-FMDV-Biotin抗原進行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上與HRP標(biāo)記的鏈霉親和素抗體作用后檢驗生物素化的有效性。

1.2.2 動物免疫

將純化的Asia1/JS/05 146S抗原加入ISA 201油佐劑中進行乳化制備滅活疫苗用于免疫動物。選取2頭口蹄疫抗體陰性的健康豬（3月齡），采用頸部肌肉注射方法免疫Asia1/JS/05滅活疫苗，劑量為20 μg·頭份-1，首次免疫與二次免疫間隔28 d。首次免疫后0、7、14、28、35 d采集動物前腔靜脈血并分離血清，凍存于-70 ℃。

1.2.3 抗原特異性單個B細(xì)胞的分選

加強免疫后7 d采集動物抗凝血參照淋巴細(xì)胞分離液使用說明書分離外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）。將PBMCs稀釋為1.0×107個·mL-1，取500 μL細(xì)胞懸液于流式管中，加入1 μg Asia1-FMDV-Biotin，同時設(shè)立未加標(biāo)記抗原的FMO對照，冰上避光孵育20 min；加入1640培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次，4℃ 400×g離心10 min。將細(xì)胞重懸后，加入鼠抗豬IgG-FITC和Anti-Biotin-APC抗體各2 μL，冰浴20 min后清洗細(xì)胞；將細(xì)胞重懸于1640培養(yǎng)基。

使用BD FACSAriaⅡ流式分選儀分選特異性結(jié)合Asia1-FMDV-Biotin的單個B細(xì)胞。流式門控如下：根據(jù)FSC-A與SSC-A圈出淋巴細(xì)胞（P1門）；利用FSC-A和FSC-H排除粘連細(xì)胞，圈出單個細(xì)胞（P2門）；在P2門內(nèi)根據(jù)FITC-A圈出IgG+B細(xì)胞（P3門）；在P3門內(nèi)依據(jù)APC-A圈出Asia1-FMDV-Biotin+細(xì)胞，P4門內(nèi)即為對應(yīng)的抗原特異性單個B細(xì)胞。

1.2.4 抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的PCR擴增

將單個B細(xì)胞分選于已加入10 μL預(yù)混液（1 μL Single Cell DNase I +9 μL Single Cell Lysis Solution）的96孔板，室溫孵育5 min；隨即加入1 μL Single Cell Stop Solution，室溫孵育2 min終止反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取2 μL cDNA進行二輪巢氏PCR分別擴增抗體重鏈V區(qū)（VH）、lambda鏈V區(qū)（VL）和kappa鏈V區(qū)（VK）基因，擴增引物及反應(yīng)條件參照文獻［9］；取第2輪PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，將PCR產(chǎn)物條帶符合預(yù)期大小的樣品送生物公司測序。

1.2.5 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及抗體的表達(dá)、純化

將擴增出的VH、VL、VK基因序列參照CHO-S細(xì)胞進行密碼子優(yōu)化后分別插入pVH-pcDNA3.4、pVL-pcDNA3.4和pVK-pcDNA3.4載體中，序列合成及載體構(gòu)建均由蘇州金唯智生物技術(shù)公司完成。重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞擴增質(zhì)粒，使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。將重鏈/輕鏈質(zhì)粒按2∶3質(zhì)量比，參照ExpiFectamineTM CHO轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染至CHO-S細(xì)胞中；培養(yǎng)8～9 d后，收取細(xì)胞上清，使用AKTA蛋白純化儀進行親和層析純化，通過SDS-PAGE驗證抗體的表達(dá)效果。

1.2.6 間接免疫熒光（IFA）檢測抗體的反應(yīng)性

將Asia1/JS/05病毒液按MOI=1劑量接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的BHK21細(xì)胞，并設(shè)立空白對照。37 ℃孵育3～4 h后，加入預(yù)冷固定液（甲醇∶丙酮=1∶1）置于-20 ℃固定30 min，即可按常規(guī)方法進行間接免疫熒光檢測。一抗為各表達(dá)抗體（5 μg·mL-1），二抗為FITC標(biāo)記的兔抗豬IgG。

1.2.7 間接ELISA檢測抗體的反應(yīng)性

將Asia1/JS/05抗原以100 ng·孔-1劑量，4 ℃過夜包被于酶標(biāo)板；待檢抗體稀釋為20 μg·mL-1，并以2倍比稀釋8個梯度加入酶標(biāo)板，選擇本實驗室保存的一株豬流行性腹瀉病毒（PEDV）特異性抗體作為陰性對照，37 ℃孵育1 h。每孔加入100 μL兔抗豬IgG-HRP抗體（1∶5 000倍稀釋），37 ℃作用30 min。加入TMB底物37 ℃顯色10 min，終止反應(yīng)后，酶標(biāo)儀檢測OD450 nm 波長的吸光度?？贵w濃度稀釋至5 μg·mL-1時，P/N≥2.1判定為陽性（P為待檢抗體每個稀釋度下2個重復(fù)孔對應(yīng)OD450nm值的平均值，N為陰性對照組所有孔OD450nm值的平均值）。

1.2.8 病毒中和試驗（VNT）檢測抗體中和活性

待測血清或抗體（初始濃度為200 μg·mL-1）在96孔板中作二倍比梯度稀釋8孔；加入50 μL病毒稀釋液（滴度為 200 TCID50·0.1 mL-1），同時設(shè)置細(xì)胞對照和病毒回歸對照。37 ℃孵育1 h后，每孔加入100 μL BHK21細(xì)胞懸液（密度為1×106 ·mL-1）。培養(yǎng)48～72 h后觀察CPE，按Reed-Muench法計算血清或抗體的中和滴度，并計算抗體的中和效力（IC50 =抗體濃度/中和滴度的倒數(shù)）。IC50≤50 μg·mL-1即可判定為中和抗體，當(dāng)抗體無中和滴度時則記為IC50＞50 μg·mL-1。

1.2.9 蛋白免疫印跡（Western blot）初步分析抗體識別的抗原表位

取純化的Asia1/JS/05 146S抗原與GST-融合表達(dá)的VP1、VP2、VP3結(jié)構(gòu)蛋白進行SDS-PAGE，隨后將其轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用含有 5％脫脂奶粉的 TBST 緩沖液室溫封閉2 h。封閉結(jié)束后，TBST 緩沖液洗膜3次。室溫2 h孵育一抗，即表達(dá)的豬源單克隆抗體（工作濃度2 μg·mL-1）；TBST 緩沖液洗膜后，室溫1 h孵育二抗，即Anti-pig-IgG-HRP（1∶5 000）抗體，TBST 緩沖液洗膜后使用化學(xué)發(fā)光儀進行曝光記錄。

1.2.10 FMDV中和抗體逃逸株的篩選及序列鑒定

將Asia1/JS/05作10倍梯度稀釋至10-6，取各個稀釋度病毒50 μL于96孔板，加入等體積濃度為50 μg·mL-1的中和抗體，并設(shè)立無抗體的病毒對照孔；每孔加入100 μL濃度為105個·mL-1的BHK21細(xì)胞，混勻靜置于37℃培養(yǎng)2～3 d。取8孔的最大稀釋度病毒，在24孔板中成倍加大抗體濃度進行連續(xù)傳代。收獲第3代各孔逃逸株提取病毒RNA，擴增FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因并將PCR產(chǎn)物送往公司測序，比對逃逸株與親本病毒間結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸差異。

1.2.11 逃逸株病毒中和試驗（VNT）驗證氨基酸位點

取中和抗體PD3和PD7在96孔板中作二倍比梯度稀釋，分別與Asia1/JS/05毒株和逃逸突變株Asia1/JS/05△VP2D72G進行病毒中和試驗。培養(yǎng)48～72 h后計算抗體與不同毒株的中和效力，以驗證中和抗體識別病毒抗原表位的關(guān)鍵氨基酸。

1.2.12 抗體序列特征分析

將Asia1型特異性抗體重鏈和輕鏈核苷酸序列分別上傳至抗體基因數(shù)據(jù)庫（IMGT）使用IMGT/V-QUEST工具分析抗體使用的V基因種類及互補決定區(qū)序列（complementarity determining region， CDR）。設(shè)置Species為Sus scrofa （pig），重鏈基因設(shè)置Receptor type or locus為IGH，Lambda鏈基因設(shè)置Receptor type or locus為IGL，Kappa鏈基因設(shè)置Receptor type or locus為IGK。

2 結(jié) 果

2.1 Asia1型FMDV抗原的制備與標(biāo)記

透射電鏡觀察顯示，Asia1/JS/05（圖1A）和Asia1-FMDV-Biotin抗原（圖1B）均為直徑25～30 nm的圓形顆粒，表明生物素標(biāo)記未對病毒146S粒子的完整性造成影響；蛋白免疫印跡結(jié)果表明經(jīng)生物素標(biāo)記的抗原相比未標(biāo)記抗原對照，在25～35 ku處多出兩條帶，分別代表VP1、VP2（或VP3），該結(jié)果說明生物素標(biāo)記Asia1-FMDV 146S抗原成功（圖1C）。

2.2 血清中和抗體滴度的檢測與抗原特異性B細(xì)胞的分選

血清中和試驗結(jié)果表明，免疫Asia1/JS/05抗原可誘導(dǎo)豬體內(nèi)產(chǎn)生高水平的中和抗體（圖2A）。在加強免疫7 d后，采集動物抗凝血分離PBMCs進行染色及流式分選。

P1門表示淋巴細(xì)胞（圖2B），P2門表示單個淋巴細(xì)胞（圖2C），P3門表示單個淋巴細(xì)胞中IgG+B細(xì)胞（圖2D），P4門表示IgG+ Asia1-FMDV-Biotin+雙陽性細(xì)胞（圖2F），即為Asia1型FMDV抗原特異性B細(xì)胞，結(jié)果顯示，抗原特異性B細(xì)胞約占PBMCs總數(shù)的2.2/10 000。流式細(xì)胞術(shù)分選P4門內(nèi)單個抗原特異性B細(xì)胞至已加裂解液的96孔板中進行抗體基因擴增。

2.3 單個B細(xì)胞抗體基因的擴增與抗體的表達(dá)

通過巢式PCR擴增，成功擴增出10個VH基因、5個VL基因、7個VK基因（圖3）；獲得VH基因和VL/VK基因配對的克隆8個，分別命名為PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8。將8個克隆重、輕鏈質(zhì)粒經(jīng)CHO-S細(xì)胞表達(dá)、親和層析純化，利用SDS-PAGE驗證所表達(dá)抗體。結(jié)果顯示，成功表達(dá)8個豬源IgG分子，重鏈分子量約為50 ku，輕鏈分子量在25 ku左右（圖4）。

2.4 抗體反應(yīng)性的驗證

間接ELISA結(jié)果顯示，PD1、PD2、PD3、PD5、PD7均可與Asia1/JS/05抗原反應(yīng)，Cut Off 值即C.O（陽性判定值），C.O=2.1×N（N 為陰性對照OD450nm值）；相同濃度條件下，PD3、PD5和PD7與抗原反應(yīng)性較強，而PD1和PD2反應(yīng)性較弱（圖5）。IFA檢測結(jié)果顯示，PD1、PD2、PD3、PD5、PD7均可與感染Asia1/JS/05病毒的BHK細(xì)胞結(jié)合，出現(xiàn)特異性熒光；PD4、PD6和PD8與空白對照孔均未見綠色熒光（圖6）。兩者結(jié)果表明，PD1、PD2、PD3、PD5、PD7可特異性識別Asia1/JS/05，為Asia1型FMDV特異性抗體。

2.5 抗體中和效力的測定

通過多血清型病毒中和試驗測定8株抗體的中和效力，結(jié)果顯示PD3和PD5可中和Asia1/JS/05毒株，8株抗體均未能中和A/WH09和O/Tibet99

毒株（表1）。結(jié)果顯示，PD3和PD7針對Asia1/JS05毒株的中和效力分別為5.82和4.50。該結(jié)果說明PD3和PD7為Asia1型FMDV特異性中和抗體，且具有良好的中和效力。

2.6 中和抗體識別表位的初步鑒定

使用Asia1/JS/05滅活抗原進行Western blot試驗鑒定2株中和抗體識別的表位類型。結(jié)果顯示，PD3和PD7可特異性結(jié)合變性的Asia1型FMDV抗原（圖7），說明兩者均識別線性表位。利用Asia1/JS/05的GST融合結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3進一步鑒定2株抗體所結(jié)合的結(jié)構(gòu)蛋白。免疫印跡結(jié)果顯示，PD3和PD7均結(jié)合Asia1/JS/05的結(jié)構(gòu)蛋白VP2（圖7）。

2.7 中和抗體識別關(guān)鍵抗原位點的鑒定

通過篩選和比對中和抗體逃逸突變株與親本病毒間結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸差異，發(fā)現(xiàn)PD3和PD7的抗體逃逸突變株均在VP2 72位殘基發(fā)生氨基酸突變（表2）；2株中和抗體針對Asia1/JS/05和逃逸突變株Asia1/JS/05△VP2D72G的VNT結(jié)果顯示（表3）：VP2 72位氨基酸突變后，PD3和PD7的IC50均＞50 μg·mL-1，對突變株Asia1/JS/05△VP2D72G無中和活性。兩者結(jié)果表明，PD3和PD7識別的關(guān)鍵氨基酸均為VP2 72位殘基（D）。

2.8 抗體序列特征分析

將抗體重鏈和輕鏈基因分別上傳IMGT進行特征分析，V基因和CDR區(qū)序列如表4所示。本研究中豬源中和抗體重鏈偏好使用IGHV1-10*01基因和IGHD2*01基因，所有抗體重鏈均使用IGHJ5*01基因；中和抗體和非中和抗體輕鏈V基因使用無明顯偏好性，PD3和PD7均使用IGKJ1*01。中和抗體PD3和PD7的LCDR1序列一致，且HCDR3和LCDR3的序列高度相似，克隆型（HCDR3_LCDR3）均為ATXYRGGWGAXDL_LQRXXXPWT。

3 討 論

由于RNA依賴的RNA聚合酶缺乏校對功能，F(xiàn)MDV表現(xiàn)出RNA病毒的準(zhǔn)種特性［10］。FMDV變異產(chǎn)生抗原結(jié)構(gòu)的多樣性［11］，造就了不同血清型病毒獨特的抗原結(jié)構(gòu)特征［12］，解析病毒抗原結(jié)構(gòu)對篩選高效疫苗毒或設(shè)計廣譜疫苗抗原結(jié)構(gòu)具有重要的意義［13］。目前對FMDV抗原位點研究多數(shù)集中于O型和A型，關(guān)于Asia1型FMDV的相關(guān)研究報道較少。Asia1型FMDV主要流行于亞洲地區(qū)［14］，依據(jù)VP1蛋白核苷酸序列可劃分為9個進化分支（GⅠ～G Ⅸ）［15］。2005年，Asia1型FMDV在我國多地引發(fā)嚴(yán)重疫情，代表毒株為Asia1/JS/05（屬G-Ⅴ群）［16］，該毒株于20世紀(jì)80年代初流行于印度［17］。自2009年后，我國再未見Asia1型FMD臨床病例，并于2018年退出免疫［18］。然而，Asia1/Sindh-08毒株（G-Ⅶ群）、Asia1型G-Ⅷ病毒群和新流行毒株Asia1/BD-18（G-Ⅸ），常年流行于我國周邊國家或地區(qū)，流行形勢復(fù)雜且毒株多變，存在傳入我國境內(nèi)的風(fēng)險，對我國畜牧業(yè)構(gòu)成長期威脅［19］。因此，加強對Asia1型FMDV的抗原結(jié)構(gòu)解析和抗原位點鑒定的研究具有重大意義。

以中和抗體為工具結(jié)合逃逸突變株篩選的方法為抗原位點的鑒定提供了強有力手段［20］。由于不同物種免疫應(yīng)答和抗體胚系基因種類等差異，機體產(chǎn)生的抗體多樣性與免疫優(yōu)勢性抗原位點可能存在差異，因此利用自然宿主源抗體來鑒定病毒抗原位點，更有利于發(fā)現(xiàn)隱蔽表位和稀有表位，能夠更加系統(tǒng)、真實地解析病毒抗原結(jié)構(gòu)及其構(gòu)效關(guān)系。目前，研究人員利用鼠源單克隆抗體發(fā)現(xiàn)Asia1型FMDV抗原結(jié)構(gòu)可分為4個功能獨立的抗原位點?？乖稽c1位于VP1 G-H環(huán)，關(guān)鍵氨基酸為140～142位；位點2位于VP2蛋白B-C環(huán)，關(guān)鍵氨基酸區(qū)段為67～79位；位點3位于VP3蛋白B-B結(jié)節(jié)，關(guān)鍵氨基酸殘基為58位和59位；位點4位于VP3蛋白C末端，關(guān)鍵氨基酸殘基為218位［21］。且該殘基在Asia1型分離株上易于變異，是Asia1型毒株特異型抗原位點［22］。位于VP1 G-H的抗原位點1

已被證實為免疫優(yōu)勢位點，但可能存在其它優(yōu)勢位點。研究者發(fā)現(xiàn)動物多次免疫FMDV抗原后，能產(chǎn)生高水平針對位點1和位點2的抗體［23］；國內(nèi)學(xué)者證實Asia1/JS/05毒株VP2 D72N的替換影響了病毒的復(fù)制能力、毒力和抗原性，提示Asia1型FMDV抗原位點2可能是一個潛在的免疫優(yōu)勢位點［24］。本研究中2株豬源Asia1型FMDV特異性中和抗體識別抗原位點2，關(guān)鍵位點均為VP2蛋白B-C環(huán)的72位殘基（D）。而且PD3和PD5使用V（D）J胚系基因和CDR氨基酸組成高度相似，其克隆型（HCDR3_LCDR3）均為ATXYRGGWGAXDL_LQRXXXPWT，說明兩者可能來自同一類B細(xì)胞前體，因此具有相似的抗原受體并且識別相同的抗原表位。另一方面，基于流式細(xì)胞術(shù)的單個B細(xì)胞分選具有隨機性，本研究中2株中和抗體所識別抗原表位的優(yōu)勢性還需進一步驗證。

基于FACS法的單個B細(xì)胞抗體技術(shù)平臺已被證明是獲取天然抗體庫的重要技術(shù)，其最大優(yōu)點是獲得抗體多樣性豐富。首先，它保持了天然VH和VL的配對［25］；第二是該技術(shù)與FACS組合使用時任何抗原分子都可以被用作誘餌抗原，極大地豐富了可篩選的mAb種類；第三，具有高分選速度和高細(xì)胞數(shù)量，可提供特異性、陽性和陰性選擇；此外，利用哺乳動物細(xì)胞所表達(dá)的抗體，其活性非?？煽?。誠然該技術(shù)也有一些缺點：其對抗原的制備要求較高，成本過高；通電磁場對細(xì)胞活性有一定影響等［26］。

本研究基于單個B細(xì)胞抗體技術(shù)平臺，以Asia1/JS/05 146S抗原為誘餌抗原，成功獲得5株反應(yīng)性良好的Asia1型特異性單克隆抗體，首次獲得自然宿主源Asia1型FMDV特異性中和抗體，發(fā)現(xiàn)2株中和抗體識別的關(guān)鍵抗原決定簇為VP2蛋白B-C環(huán)72位殘基。該研究為Asia1型FMDV抗原結(jié)構(gòu)解析和血清學(xué)檢測方法建立提供了有力工具，也為FMD的疫苗分子設(shè)計和我國邊境地區(qū)FMD防控提供了戰(zhàn)略儲備技術(shù)支撐。

4 結(jié) 論

本研究中首次獲得Asia1型FMDV特異性自然豬源中和抗體，鑒定出VP2 D72是中和表位的關(guān)鍵氨基酸，進一步豐富了Asia1型FMDV抗原位點信息，為FMD的分子疫苗設(shè)計和新型診斷檢測技術(shù)的研究奠定了基礎(chǔ)。

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（編輯 白永平）