羊口瘡病毒ORF112基因缺失毒株的構(gòu)建及增殖能力分析

摘 要： 利用同源重組技術(shù)構(gòu)建羊口瘡病毒（orf virus， ORFV）ORF112基因缺失毒株，為后續(xù)研制出高效、安全的ORFV基因工程疫苗提供候選毒株。以O(shè)RF112基因?yàn)榘谢?，通過重疊PCR的方法將左、右同源臂及綠色熒光蛋白（EGFP）基因表達(dá)框，進(jìn)行融合后與pUC19T載體連接，構(gòu)建出pUC19T-ORFV-ΔORF112-EGFP基因轉(zhuǎn)移載體。將轉(zhuǎn)移載體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞與WT-ORFV基因組進(jìn)行同源重組。采取有限稀釋法和挑取單細(xì)胞克隆法，篩選并純化出純合的ORFV-ΔORF112-EGFP毒株，并對該基因缺失毒株遺傳穩(wěn)定性和增殖特性等進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：利用有限稀釋和挑取單細(xì)胞克隆方法，進(jìn)行陽性重組病毒純化，通過PCR驗(yàn)證和測序，成功地獲得ORFV-ΔORF112-EGFP重組毒株。該重組毒株在系列傳代過程中EGFP穩(wěn)定表達(dá)且無減弱現(xiàn)象。該重組ORFV-ΔORF112-EGFP毒株與野生毒株的復(fù)制生長特性基本一致。成功構(gòu)建并篩選得到純化的ORFV-ΔORF112-EGFP基因缺失毒株，該毒株具有良好的遺傳穩(wěn)定性和復(fù)制能力，為后續(xù)ORFV基因工程疫苗的研制提供了候選毒株。

關(guān)鍵詞： 羊口瘡病毒；ORF112基因；同源重組；基因缺失

中圖分類號： S852.659.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-5200-11

收稿日期：2024-01-15

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（32302850）；甘肅省科技計劃項(xiàng)目（22JR5RA035）；甘肅省科技重大專項(xiàng)（22ZD6NA001）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（1610312021008）

作者簡介：尤 婷（2000-），女，甘肅臨夏人，碩士生，主要從事草食動物病毒病感染致病機(jī)制研究，E-mail：1756404726@qq.com

*通信作者：王桂榮，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)相關(guān)研究，E-mail：wangguirong@gsau.edu.cn；任善會，主要從事草食動物病毒致病機(jī)制相關(guān)研究，E-mail：renshanhui@caas.cn

Construction and Replication Ability of the ORF112 Gene Deleted Orf Virus Strain

YOU" Ting1， REN" Shanhui2*， WANG" Meng1， ZHANGnbsp; Hongqiang1， GAO" Xiaolong3， YAO" Wei4，

WANG" Hui1， YANG" Xue1， MA" Chunling2， LIU" Minyi1， ZHANG" Yuzhe1， WANG" Jinlong1，

SUN" Yuefeng2， CHEN" Haotai2， WANG" Guirong1*

（1.Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，" China;

2.Lanzhou Institute of

Veterinary Medicine， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730016，" China;

3.College of Animal Science and Technology， Qinghai University， Xining 810003，" China;

4.Animal Husbandry Industry Development Center， Wanzhou District， Chongqing 400000，" China）

Abstract：" To provide a candidate strain for the development of an efficient and safe ORFV genetic engineering vaccine， the deleted ORF112 gene recombinant ORFV strain was constructed using the homologous recombination technique. Taking the ORF 112 gene as the targeted gene， the left and right homology arms and the enhanced green fluorescent protein gene （EGFP） expression frame were in-fused by the overlapping PCR method， which was connected with the pUC19T vector to construct the pUC19T-ORFV-ΔORF112-EGFP transfer vector. Subsequently， the pUC19T-ORFV-ΔORF112-EGFP transfer vector was transfected into the Vero cells to cause the homologous recombination events with the wild-type ORFV genome. The positive ORFV-ΔORF112-EGFP strain was screened and purified by limited dilution and picking a single-cell clone method. The genetic stability and replication ability of the deleted ORF112 ORFV recombinant strain were further investigated. The positive recombinant ORFV strain was purified using limited dilution and picking a single-cell clone method. After the PCR verification and sequencing identification， the recombinant ORFV-ΔORF112-EGFP strain was successfully obtained. The expression of EGFP in the recombinant virus genome was stable， with no attenuating characteristics during the serial passages. The replication and growth characteristics of this recombinant ORFV stain are the same as wild-type ORFV. The ORFV-ΔORF112-EGFP recombinant strain has been successfully constructed， purified， and screened， which maintains good genetic stability and replication ability， providing the candidate strain for the development of a genetic engineering ORFV vaccine.

Key words： orf virus; ORF112 gene; homologous recombination; gene deletion

*Corresponding author：" WANG Guirong， E-mail： wangguirong@gsau.edu.cn; REN Shanhui， E-mail：renshanhui@caas.cn

羊口瘡（orf）又稱羊傳染性膿皰?。╟ontagious ecthyma， CE），是由痘病毒科（Poxviridae）副痘病毒屬（Parapoxvirus）中重要代表種“羊口瘡病毒（orf virus， ORFV）”，又名“羊傳染性膿皰病毒（contagious ecthyma virus， CEV）”引起的一種高度接觸性人獸共患?。?］。Orf在我國西北、東北等養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)廣泛流行，傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高，主要感染山羊和綿羊，其中3～6月齡的羔羊最為易感［2］。主要臨床特征是患該病的羊口唇、乳房、蹄部等部位出現(xiàn)紅斑、丘疹、水皰、膿皰和爛斑，最后形成疣狀結(jié)痂等病變。由于患羊口唇部位形成膿皰會阻礙正常進(jìn)食，從而影響生長性能，繼發(fā)細(xì)菌感染后的死亡率高達(dá)93%［3］，嚴(yán)重阻礙養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展。同時，Orf作為一種人獸共患病，對全球公共衛(wèi)生安全帶來嚴(yán)重影響。

ORFV是痘病毒科（Poxvirdae）副痘病毒屬中的重要代表種，為線性雙鏈有囊膜的DNA病毒，其病毒粒子大小約260 nm×160 nm，外觀多呈卵圓形，其表面有十字交錯的“8”字型螺旋狀突起［4］。ORFV基因組大小約為134～139 kb，其中C+G約占總核酸的64%［5-6］。其中編碼區(qū)包括中心保守區(qū)（ORFs009―111）與兩個末端反向重復(fù)變異區(qū)（ORFs001―008、ORFs112―134）。ORFV是最大的一類DNA病毒，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，感染后機(jī)體主要產(chǎn)生細(xì)胞免疫，故傳統(tǒng)滅活疫苗對其作用有限甚至無效，而傳代減毒活疫苗由于致弱機(jī)制尚不明確，存在毒力返強(qiáng)風(fēng)險，難以保證疫苗的安全性，從而嚴(yán)重制約ORFV疫苗研發(fā)，目前國內(nèi)尚未有對其安全有效的商品化疫苗。因此對ORFV的主要毒力基因進(jìn)行缺失，構(gòu)建毒力基因缺失的弱毒株，是當(dāng)下ORFV疫苗的重要研究方向。同時由于ORFV的宿主范圍有限、基因組龐大且可編輯、有廣泛的免疫調(diào)節(jié)特性，并且誘導(dǎo)宿主快速啟動特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，但并未誘導(dǎo)宿主有效中和性抗體的產(chǎn)生［7-8］。有研究提出ORFV基因缺失位點(diǎn)可作為異源基因的插入位點(diǎn)用作疫苗載體［9-10］。因此缺失主要毒力基因，開發(fā)更安全的ORFV載體平臺有著重要意義。

ORFV表達(dá)多個免疫調(diào)節(jié)毒力蛋白，如干擾素抗性蛋白（interferon resistance protein， IFNR）、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子抑制因子（granulocyte-macrophage colony stimulating inhibitory factor， GIF）、趨化因子結(jié)合蛋白（chemokine binding protein， CBP）、病毒白細(xì)胞介素10（viral interleukin-10 homologue， vIL-10）［11］等，其通過抑制免疫細(xì)胞運(yùn)輸、炎癥和NF-k B信號傳導(dǎo)和增加病毒的復(fù)制及適應(yīng)性反應(yīng)等來抵抗宿主的免疫反應(yīng)。其中編碼CPB的ORF112作為毒力基因，主要在病毒感染早期發(fā)揮作用。趨化因子是一類小分子細(xì)胞因子家族蛋白，主要作用是激活和調(diào)節(jié)炎癥誘導(dǎo)的白細(xì)胞招募到感染部位［12］，以及白細(xì)胞通過淋巴器官的穩(wěn)態(tài)遷移［13］。ORFV的CBP在用高親和力結(jié)合和抑制趨化因子的能力方面與CBP-II蛋白功能相似［14］，通過與機(jī)體趨化因子結(jié)合，阻斷了免疫細(xì)胞向感染部位募集的過程，因此抑制了免疫細(xì)胞的抗病毒機(jī)制，在抑制機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)、降低宿主免疫力中發(fā)揮重要作用［15］。樹突狀細(xì)胞（dendritic cell， DC）是誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫的抗原呈遞細(xì)胞，它們在皮膚感染部位的募集和向外周淋巴結(jié)的遷移。分別依賴于炎癥和組成性趨化因子，有研究發(fā)現(xiàn)ORFV的CBP能分別抑制未成熟和成熟DC分別響應(yīng)于這些炎癥和組成性趨化因子的運(yùn)動［16］。鑒于此，本試驗(yàn)利用同源重組技術(shù)，將ORF112基因缺失并替換為綠色熒光蛋白EGFP，探究缺失ORF112基因后ORFV-ΔORF112-EGFP基因缺失毒株的生長特性，為后期ORFV基因工程疫苗的研制提供備選毒株，為基于ORFV病毒載體的多價聯(lián)苗的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要毒株、細(xì)胞和載體

ORFV毒株（ORFV/YL01/CHA/2022，基因組信息未提交Genbank數(shù)據(jù)庫）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所草食動物病毒病團(tuán)隊保存；非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）和永生化綿羊睪丸細(xì)胞（hTERT-ST）［17］均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所本實(shí)驗(yàn)室保存；pUC19T載體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所本實(shí)驗(yàn)室保存。所有細(xì)胞和毒株支原體檢測陰性。

1.1.2 主要試劑

DNA Marker（貨號：60130E-5K）、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（貨號：P505-d1）和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（貨號：C502-02），均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BamH Ⅰ（貨號：R3142S和R0136V），均購自New England Biolabs有限公司；膠回收試劑盒（貨號：D2500-02）購自深圳康體生命科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒（貨號：DP105-3）、病毒DNA提取試劑盒（貨號：DP315），均購自Tiangen公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑jetPRIME（貨號：DP105-3），購自Poly plus公司；胎牛血清（FBS）（貨號CF602/C04001-500），購自諾萊和上海逍鵬生物有限公司；DMEM培養(yǎng)基（貨號：11995），購自Solarbio有限公司；Taq 2×PCR Mix with Dye V2（貨號：RK20608），購自愛博泰克公司；支原體檢測試劑盒（貨號：40601ES20），購自上海翊圣生物有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

PCR儀，購于廣州威佳科技有限公司產(chǎn)品；核酸電泳儀，購于北京六一生物有限公司；37℃恒溫二氧化碳（5%）培養(yǎng)箱和-80℃超低溫冰箱，購于Thermo有限公司；恒溫?fù)u床，購于上海知楚儀器公司；高速低溫離心機(jī)，購于德國Eppendorf公司；EVOS M5000 Leica激顯微鏡，購于德國徠卡公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

以O(shè)RFV/YL01/CHA/2022基因序列為參照，如表1，用軟件Primer Premier 6設(shè)計出用于擴(kuò)增的左右同源臂、EGFP插入基因和鑒定純化毒株的引物（斜體下劃線部分為引物序列重疊區(qū)），由金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 融合PCR反應(yīng)擴(kuò)增左右同源臂

首先以O(shè)RFV病毒DNA為模板，利用引物ORF112L-F、ORF112L-R、ORF112R-F、ORF112R-R分別擴(kuò)增出ORF112L（左同源臂）和ORF112R（右同源臂）；以質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP-LC3為模板，利用引物EGFP-F、EGFP-R擴(kuò)增出綠色熒光蛋白表達(dá)框（EGFP）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測將大小正確的目的條帶進(jìn)行膠回收。之后將膠回收產(chǎn)物左同源臂（ORF112L）、右同源臂（ORF112R）分別同綠色熒光蛋白表達(dá)框（EGFP）進(jìn)行第一次融合PCR反應(yīng)，將獲得的ORF112L+EGFP和EGFP+ORF112R PCR產(chǎn)物膠回收后進(jìn)行第二次融合PCR反應(yīng)，膠回收后測定核酸濃度，置于-20 ℃冰箱保存。PCR反應(yīng)體系：模板1 μL、2×phanta Max Buffer 25 μL、dNTP Mix 1 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL和ddH2O 18 μL；反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 3 min；變性95 ℃ 15 s，退火58℃15 s，延伸72℃ 1 000 bp·min-1共32個循環(huán)；終延伸72 ℃ 5 min。

1.2.3 轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建與鑒定

pUC19T載體用KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切后同第二次融合PCR產(chǎn)物連接（37℃，30 min）后在大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，加入無抗2YT培養(yǎng)基1 mL，在37 ℃恒溫?fù)u床中搖菌1 h后離心，棄掉上清

900 μL，將剩余菌液吹打混勻，均勻地涂布于2YT固體平板（含10 μg·mL-1氨芐霉素）中，37℃培養(yǎng)箱中過夜，次日挑取單個菌落，搖菌提取質(zhì)粒后，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，將陽性質(zhì)粒命名為pUC19T-ORFV-ΔORF112-EGFP。

1.2.4 缺失112基因綠色熒光重組病毒（ORFV-ΔORF112-EGFP）的拯救

將Vero細(xì)胞均勻鋪入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待密度達(dá)到60%～80%時，用pUC19T-ORFV-ΔORF112-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，12～18 h后接種野生型ORFV毒株（ORFV-WT），分別觀察并拍照記錄感染后6、12、24、36、48、60和72 h的細(xì)胞病變及綠色熒光情況。待ORFV感染Vero細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病理變化（cytopathic effect， CPE）時收取病毒液，保存于-80 ℃冰箱。凍融一次后收集到1.5 mL離心管保存。

1.2.5 缺失112基因綠色熒光重組病毒（ORFV-ΔORF112-EGFP）的純化

將T 75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的hTERT-ST細(xì)胞消化后，鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，取100 μL收集凍存的病毒液，以10倍梯度等比稀釋接種于96孔板中置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞病變及熒光情況，3 d后選取病變最明顯且熒光最強(qiáng)的一孔，挑取單細(xì)胞克隆。具體步驟：棄去96孔板中原有的培養(yǎng)基，加入100 μL胰酶，消化1 min后加入100 μL培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打混勻后加至已準(zhǔn)備的裝有1 000 μL培養(yǎng)基的1.5 mL離心管中再次反復(fù)吹打直至混勻，之后加到35 cm細(xì)胞皿中在熒光顯微鏡下吸取有綠色熒光的單細(xì)胞，重復(fù)該步驟2～3次后將挑取的單個細(xì)胞分別加到裝有200 μL培養(yǎng)基的1.5 mL離心管中，凍存于-80 ℃冰箱。凍融一次后，棄去原來96孔板中的培養(yǎng)基，接種挑取的單個細(xì)胞，觀察病變及熒光情況進(jìn)行病毒篩選和純化。

1.2.6 缺失112基因綠色熒光重組病毒（ORFV-ΔORF112-EGFP）的鑒定

在96孔板中觀察不到由野毒形成的病變時，再次挑取單細(xì)胞，將挑取的單細(xì)胞接種于hTERT-ST細(xì)胞48孔板中，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯綠色熒光病變時，-80 ℃凍融一次后收集到1.5 mL離心管中，取200 μL利用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取病毒DNA。分別利用設(shè)計的引物Primer1、Primer2和Primer3，以提取的病毒DNA作為模板，ddH2O為陰性對照，ORFV-WT為陽性對照，進(jìn)行三次PCR。PCR產(chǎn)物取20 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)電泳結(jié)果驗(yàn)證條件正確后將剩余30 μL送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序（引物自備），若序列比對正確且測序峰單一無雜峰，則證明重組病毒純化成功。驗(yàn)證PCR反應(yīng)體系：Taq 2×PCR Mix with Dye V2 25 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DNA模板1 μL和ddH2O 22 μL；反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃ 3 min；變性98℃ 7 s，退火58℃ 25 s，延伸 65℃ 1 000 bp·min-1，共30個循環(huán)；終延伸67℃ 5 min。

1.2.7 重組病毒ORFV-ΔORF112-EGFP與野生毒株ORFV-WT的TCID50的測定

將病毒（ORFV-ΔORF112 -EGFP、ORFV-WT）10倍梯度稀釋從10-1稀釋到10-10，并接種到生長狀態(tài)良好的hTERT-ST細(xì)胞96孔板中，每個稀釋梯度接種8孔并做三個重復(fù)。棄去96孔板中原有的培養(yǎng)基，每孔按稀釋濃度由高到低加入100 μL病毒稀釋液，置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h后在熒光顯微鏡下記錄每個稀釋度有熒光或有細(xì)胞病變的孔數(shù)，按照Reed-Muench 方法分別計算重組病毒與親本毒的組織半數(shù)感染量（TCID50）。

1.2.8 重組病毒ORFV-ΔORF112-EGFP的遺傳穩(wěn)定性分析

將純化的ORFV-ΔORF112-EGFP病毒在hTERT-ST細(xì)胞中連續(xù)培養(yǎng)觀察，待出現(xiàn)明顯病變時，將病毒液凍存一次，并接種于下一代hTERT-ST細(xì)胞中，連續(xù)培養(yǎng)12代，觀察細(xì)胞與熒光狀態(tài)。并提取每代病毒DNA利用引物Primer3進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)條件同“1.2.6”。

1.2.9 重組病毒ORFV-ΔORF112-EGFP的增殖曲線測定

將ORFV-ΔORF112-EGFP、ORFV-WT以MOI=0.01的病毒量接種于鋪好均勻的hTERT-ST細(xì)胞6孔板中，接毒后于6、12、24、48、72和96 h收集病毒上清，用Reed-Muench方法計算收獲的不同時間段的病毒液的TCID50，最后用GraphPad Prism軟件繪制病毒增殖曲線。

1.3 生物安全聲明

ORFV感染細(xì)胞試驗(yàn)均在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所完成，過程嚴(yán)格按照中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所的3級生物安全實(shí)驗(yàn)室的操作指南進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 基因缺失重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)缺失ORF112基因ORFV毒株構(gòu)建示意圖1，以O(shè)RFV病毒DNA為模板及pcDNA3.1-EGFP-LC3陽性質(zhì)粒作為模板，利用表1中引物，擴(kuò)增出左右同源臂片段以及綠色熒光蛋白表達(dá)框（EGFP）。如圖2所示，成功的擴(kuò)增出左同源臂（ORF112L）、右同源臂（ORF112R）及綠色熒光蛋白表達(dá)框（EGFP），大小分別是854 bp、816 bp和1 112 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。

將PCR得到的左同源臂（ORF112L）、右同源臂（ORF112R）及綠色熒光蛋白表達(dá)框（EGFP）基因進(jìn)行膠回收，后進(jìn)行第一次融合PCR反應(yīng)，片段大小分別為1 966 bp和1 928 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。將第一次融合PCR產(chǎn)物進(jìn)行第二次融合PCR，片段大小為2 782 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。結(jié)果如圖3所示。

將左同源臂（ORF112L）、綠色熒光蛋白表達(dá)框（EGFP）及右同源臂（ORF112R）三段重疊PCR產(chǎn)物同pUC19T雙酶切載體相連接，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐抗性的2YT固體平板后，于37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單個菌落至裝有1 mL氨芐抗性的2YT液體培養(yǎng)基的1.5 mL離心管中，搖菌6～8 h，將菌液無菌提取質(zhì)粒后送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，將測序正確的陽性質(zhì)粒命名為pUC19T-ORFV-ΔORF112-EGFP。

2.2 缺失112基因綠色熒光標(biāo)記重組病毒的拯救與純化

將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pUC19T-ORFV-

ΔORF112-EGFP轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞，18～24 h后感染野生型ORFV毒株（ORFV-WT），在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后6～72 h綠色熒光情況，熒光病變是否隨時間變亮變多來判定轉(zhuǎn)移載體是否與病毒基因組發(fā)生重組。通過熒光顯微鏡可以觀察到綠色熒光與ORFV感染病變重合來判斷純化，在hTERT-ST細(xì)胞中通過有限稀釋法和挑取單細(xì)胞克隆純化綠色熒光重組ORFV病毒（ORFV-ΔORF112-EGFP）。如圖4所示，ORFV感染誘導(dǎo)產(chǎn)生的病變細(xì)胞均表達(dá)綠色熒光。

為進(jìn)一步驗(yàn)證該綠色熒光標(biāo)記的缺失ORF112基因的ORFV重組病毒是否構(gòu)建成功，采用PCR方法驗(yàn)證，將提取的重組病毒DNA作為模板，利用Primer1引物、Primer2引物和Primer3為特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，如圖5所示，利用Primer1引物的驗(yàn)證，純化的病毒不能擴(kuò)增出條帶，只有陽性對照有大小約為299 bp的單一條帶（如圖5A）；利用Primer2引物可以擴(kuò)增出大小約為1 112 bp的單一條帶，陰性和陽性對照均無條帶（如圖5B）；利用Primer3引物可以擴(kuò)增出與陽性對照大小不同的單一條帶（如圖5C），說明重組毒株純化成功。如圖5所示，可以初步證明選取的1～8號孔病毒純化成功。為進(jìn)一步證明其是否純和，隨機(jī)選取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與預(yù)期一致，無堿基缺失或突變，測序峰單一，表明已成功構(gòu)建ORFV-ΔORF112-EGFP重組毒株。

2.3 重組病毒ORFV-ΔORF112-EGFP的遺傳穩(wěn)定性

將純化并鑒定成功的ORFV-ΔORF112-EGFP重組病毒在hTERT-ST細(xì)胞中連續(xù)傳代培養(yǎng)12代，觀察熒光對并對不同代次ORFV-ΔORF112-EGFP株用引物Primer3鑒定，擴(kuò)增出與陽性對照大小不同的單一條帶目的條帶與預(yù)期結(jié)果一致，如圖6、7。結(jié)果顯示該重組病毒能穩(wěn)定遺傳并正確表達(dá)綠色熒光蛋白。

2.4 重組病毒ORFV-ΔORF112-EGFP增殖曲線的繪制

將野生型ORFV（ORFV-WT）和ORFV-ΔORF112-EGFP進(jìn)行TCID50測定。根據(jù)細(xì)胞病變記錄結(jié)果，按照Reed-Muench法計算出重組病毒ORFV-ΔORF112-EGFP的病毒滴度為105.973TCID50·0.1 mL-1，ORFV-WT病毒滴度為106.359TCID50·0.1 mL-1。隨后，將ORFV-WT和ORFV-ΔORF112-EGFP以0.1 MOI的病毒量分別感染hTERT-ST細(xì)胞，在6、12、24、48、72和96 h時收取的病毒液，測定病毒滴度后用Graph pad Prism 6.01軟件繪制病毒增殖曲線。如圖8，本研究中構(gòu)建的缺失ORF112基因的重組熒光毒株（ORFV-ΔORF112-EGFP）具有良好的生長特性，其復(fù)制力與野生毒株（ORFV-WT）基本一致。并且ORFV-WT和ORFV-ΔORF112-EGFP在72 hpi時達(dá)到復(fù)制最高峰，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒含量最高，故72 h為最佳的病毒收集時間點(diǎn)。

3 討 論

羊口瘡作為一種急性接觸性人獸共患病在世界范圍廣泛流行，容易在春秋兩季暴發(fā)［18］，是羊群常見的疫病之一。該病在羔羊中發(fā)病率高，且出現(xiàn)其他病原菌繼發(fā)感染后死亡率高達(dá)93%［3］，對畜牧業(yè)造成巨大影響，而且作為一種人獸共患病威脅著人類健康，對世界公共衛(wèi)生安全帶來重大隱患。ORFV作為最大的一類DNA病毒，通過抑制干擾素反應(yīng)、NF-κB信號通路癥反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、自噬、血管增生等復(fù)雜且獨(dú)特的機(jī)制實(shí)現(xiàn)免疫逃避機(jī)制［19］，目前沒有治療和預(yù)防羊口瘡的特效藥，疫苗免疫仍是防控該病的理想手段，但是傳統(tǒng)滅活苗存在免疫效果不明顯，且傳統(tǒng)通過連續(xù)傳代獲得減毒活疫苗有毒力返強(qiáng)等安全性隱患，從而嚴(yán)重制約ORFV疫苗研發(fā)。國內(nèi)目前沒有對其安全有效的商品化疫苗。所以有必要對ORFV的主要毒力基因進(jìn)行缺失開發(fā)出有效、安全的基因工程疫苗。

ORFV基因組在中心編碼區(qū)之外的兩端編碼病毒復(fù)制的非必需的基因，這些基因與ORFV宿主嗜性、致病力及免疫逃避密切相關(guān)［20］。編碼CPB的ORF112作為毒力基因，主要在病毒感染早期發(fā)揮作用，能夠有效地與趨化因子表面受體結(jié)合，阻止趨化發(fā)揮募集白細(xì)胞的作用，從而干擾宿主的免疫防御機(jī)制，抑制免疫因子活性，在病毒免疫逃避中發(fā)揮作用［21］。因此缺失ORF112基因在ORFV弱毒苗中有著重要的研究意義。

本試驗(yàn)以O(shè)RF112基因?yàn)榘谢?，增?qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP基因?yàn)闃?biāo)記基因，基于同源重組技術(shù)平臺，通過多次挑選單細(xì)胞克隆的純化方式，構(gòu)建缺失ORF112基因的綠色熒光標(biāo)記毒株（ORFV-ΔORF112-EGFP）。由于多片段基因重組效率較低，因此本試驗(yàn)采用重疊PCR方法將三片段基因進(jìn)行融合，后克隆至pUC19T載體中，成功構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pUC19T-ORFV-ΔORF112-EGFP重組質(zhì)粒。為了提高轉(zhuǎn)染效率，使用Vero細(xì)胞，利用轉(zhuǎn)染試劑將pUC19T-ORFV-ΔORF112-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞，12～18 h后接種ORFV病毒液感染細(xì)胞，感染12 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞病變及綠色熒光情況，72 h后收取細(xì)胞和病毒混合液。純化帶有標(biāo)記基因的重組病毒常用方法是噬斑挑取法和有限稀釋法，而本試驗(yàn)為了使重組病毒快速生長以便篩選純化，利用永生化的宿主細(xì)胞hTERT-ST，通過有限稀釋法和多次挑取單克隆細(xì)胞進(jìn)行純化的方法，極大地提高了純化效率，縮短純化時間。經(jīng)PCR鑒定成功構(gòu)建出ORFV-ΔORF112-EGFP基因缺失重組毒株。通過增殖能力分析表明，重組病毒ORFV-ΔORF112-EGFP在hTERT-ST細(xì)胞中有效復(fù)制且至少在12代內(nèi)保持其遺傳穩(wěn)定性。在hTERT-ST細(xì)胞上測定該重組病毒滴度為105.973TCID50·0.1mL-1。通過與野生毒株（ORFV-WT）對比，作者發(fā)現(xiàn)重組病毒ORFV-ΔORF112-EGFP與親本毒株體外增殖特性情況大致相同，說明CBP（ORF 112）毒力因子不影響ORFV的體外增殖，敲除該毒力基因?qū)Σ《镜捏w外增殖幾乎無影響，且該基因缺失病毒的遺傳穩(wěn)定性良好。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)以O(shè)RF112基因?yàn)榘谢?，利用同源重組技術(shù)將痘病毒早晚啟動子（pmH5）控制下的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白為標(biāo)記基因，通過多次挑選單細(xì)胞克隆的純化方式，成功構(gòu)建出缺失ORF112基因的綠色熒光標(biāo)記毒株（ORFV-ΔORF112-EGFP），且ORFV-ΔORF112-EGFP生長特性良好，可為后續(xù)ORFV基因缺失疫苗的研制提供候選毒株，為研究新型基因工程弱毒疫苗奠定基礎(chǔ)。

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（編輯 白永平）