山羊痘病毒錨蛋白ORF140對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用

摘 要： NF-κB通路是病毒調(diào)控宿主免疫功能的一個(gè)重要靶點(diǎn)，在病毒感染致病的過程中發(fā)揮重要作用。研究證明，一些痘病毒編碼的錨蛋白可通過多種方式調(diào)控NF-κB通路，但山羊痘病毒編碼的錨蛋白對(duì)NF-κB通路有怎樣的調(diào)控作用尚未有研究報(bào)道。為了探究山羊痘病毒編碼的錨蛋白ORF140對(duì)NF-κB通路的調(diào)控作用，作者通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)山羊痘病毒錨蛋白ORF140對(duì)NF-κB通路的影響；采用間接免疫熒光檢測(cè)ORF140在HEK293T細(xì)胞中的定位；應(yīng)用Western blot技術(shù)分別檢測(cè)在NF-κB通路被激活的不同時(shí)間點(diǎn)ORF140對(duì)NF-κB通路相關(guān)因子的影響。結(jié)果顯示：ORF140能夠抑制NF-κB通路；ORF140定位于細(xì)胞質(zhì)中，且在NF-κB通路被激活的情況下也未發(fā)生核移位；ORF140能夠抑制NF-κB-p65的核移位與p-IκBα的降解。山羊痘病毒錨蛋白ORF140定位在細(xì)胞質(zhì)中，通過抑制NF-κB-p65的核移位與p-IκBα的降解來下調(diào)NF-κB通路的活性。

關(guān)鍵詞： 山羊痘病毒；錨蛋白；NF-κB；ORF140

中圖分類號(hào)： S852.659.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）11-5191-09

收稿日期：2024-01-17

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32260874）

作者簡(jiǎn)介：馮秋媛（1999-），女，湖北隨州人，碩士生，主要從事動(dòng)物疫病病原分子生物學(xué)研究，E-mail： fengqiuyuan0808@163.com

*通信作者：陳軼霞，主要從事動(dòng)物重大疫病病原分子生物學(xué)研究，E-mail： chenyx69@126.com；景志忠，主要從事動(dòng)物疫苗與分子免疫學(xué)研究，E-mail： zhizhongj@163.com

Regulation of the NF-κB Signaling Pathway by Goat Poxvirus Ankyin Protein ORF140

FENG" Qiuyuan1，2， YU" Hanwei1，2， YANG" Yunfeng1，2， ZHANG" Hui1，2， HANWU" Weiyi2，

SUN" Xintong2，

SHAO" Xiaolong1，2， LIU" Junlin1， CHEN" Guohua2， JING" Zhizhong2*， CHEN" Yixia1*

（1.College of Life Science and Engineering， Northwest Minzu University， Lanzhou 730030，

China;

2.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， Key Laboratory of

Veterinary Public Health of Ministry of Agriculture， Lanzhou Veterinary Research Institute，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730046，" China）

Abstract：" The NF-κB pathway is an important target for regulation of host immune function by viruses and plays an important role in the pathogenesis of viral infections. It has shown that the ankyrin protein encoded by some poxviruses regulates the NF-κB pathway in a variety of ways， but how the ankyrin protein encoded by goat poxvirus （GTPV） regulates the NF-κB pathway remains to be explored. In this paper， we aim to investigate the effects of the ankyrin protein ORF140 encoded by GTPV on the NF-κB pathway. The effects of ankyrin protein ORF140 on the NF-κB pathway were detected using dual luciferase reporter system， its localization in HEK293T cells was observed by indirect immunofluorescence and its effects on expression of the factors associated with the activated NF-κB pathway at different time points by Western blot. Results showed that ORF140 was able to inhibit the NF-κB pathway. It was localized in the cytoplasm and did not undergo nuclear translocation even when the NF-κB pathway was activated. ORF140 was able to inhibit the nuclear translocation of NF-κB-p65 and the degradation of p-IκBα. GTPV ORF140 localizes in the cytoplasm and downregulates NF-κB transcriptional activity by inhibiting the nuclear translocation of NF-κB-p65 and the degradation of p-IκBα.

Key words： goat poxvirus; ankyrin protein; NF-κB; ORF140

*Corresponding authors：" CHEN Yixia， E-mail： E-mail： chenyx69@126.com; JING Zhizhong， E-mail： zhizhongj@163.com

山羊痘病毒（goatpox virus，GTPV）是痘病毒科（Poxviridae）、脊索動(dòng)物痘病毒亞科（Chordopoxrinae）、山羊痘病毒屬（Capripoxvirus）的成員，由147個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF）組成。全基因組長(zhǎng)度約為150 kb，包括中心編碼區(qū)（ORF24～123）和兩個(gè)側(cè)翼編碼區(qū)（ORF1～23、ORF 124～147）。其引起的山羊痘被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）列為法定通報(bào)動(dòng)物疫病。該病主要流行于非洲中部和北部、中東、印度次大陸、中亞和中國(guó)部分地區(qū)［1-3］。病畜常有發(fā)熱、全身呈現(xiàn)出膿皰樣病變并伴有淋巴結(jié)腫大，羔羊死亡率高達(dá)50%以上［4］，給養(yǎng)羊業(yè)造成重大損失，嚴(yán)重阻礙國(guó)際貿(mào)易的發(fā)展。

NF-κB屬于核轉(zhuǎn)錄因子家族，對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵性的作用［5］。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，NF-κB蛋白家族包括五個(gè)成員，分別是NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）、RelA（p65）、RelB和c-Rel。這些蛋白都有一個(gè)特征性的Rel同源結(jié)構(gòu)域（Rel homology domain，RHDs），不同成員可通過這個(gè)結(jié)構(gòu)域相互形成二聚體或者與DNA結(jié)合。在缺乏外界刺激的條件下，胞質(zhì)內(nèi)的NF-κB二聚體的Rel結(jié)構(gòu)域被抑制蛋白IκBs結(jié)合，呈非活性狀態(tài)。病毒感染機(jī)體后，上游蛋白（例如TNF受體-1）激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物，催化IκBα兩個(gè)保守的絲氨酸殘基磷酸化，接著在SCF（Skpl-Cull-F-box，SCF）E3泛素連接酶復(fù)合物的催化下多泛素化而被蛋白酶體降解使NF-κB活化，隨后NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核與基因組DNA的特定位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)抗病毒基因的表達(dá)［6-7］。痘病毒為了能保證自身在宿主細(xì)胞中正常復(fù)制，進(jìn)化出多種獨(dú)特的對(duì)抗機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)的機(jī)制，其中，NF-κB信號(hào)通路是痘病毒抑制和逃避宿主免疫應(yīng)答的主要靶點(diǎn)［8-9］。

研究表明，痘病毒編碼的錨蛋白（ankyrin repeats，ANK）/F-box可以通過多種方式調(diào)控NF-κB通路［10-13］，包括拮抗PKR通路［14］、在細(xì)胞核中抑制NF-κB的功能［15］、直接影響NF-κB的活性［16］、抑制IκBα的降解［12，17］、阻止NF-κB的核移位［18］、阻斷IFN的信號(hào)傳導(dǎo)［19］等。GTPV編碼5個(gè)錨蛋白（ORF010、138、140、141.2、145）［20］，其對(duì)NF-κB信號(hào)通路有怎樣的調(diào)控作用尚未見報(bào)道。因此，本研究探討了GTPV ORF140在HEK293T細(xì)胞中的定位及其對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用，為探索山羊痘病毒編碼的錨蛋白在痘病毒感染過程中發(fā)揮的作用提供了線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒

HEK293T細(xì)胞、pcDNA3.1-3×FLAG-N載體由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存和提供。pcDNA3.1-FLAG-ORF140重組質(zhì)粒由武漢金開瑞生物工程有限公司優(yōu)化合成。

1.1.2 主要試劑

質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。DNA Marker購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。蛋白Marker、RIPA裂解液、Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ快切酶、Lipofectamine 2000、TNF-α購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；胞質(zhì)和胞核提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗IKKα抗體、兔抗IκBα抗體、兔抗磷酸化的IκBα （phosphorylated I-kappa B proteins α，p-IκBα）抗體、兔抗NF-κB-p65抗體、兔抗組蛋白H3（histone H3）抗體、山羊抗小鼠IgG Hamp;L（Alexa Fluor 594）和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購(gòu)自Abcam公司；小鼠抗標(biāo)簽（FLAG）抗體、兔抗β-tubulin抗體、小鼠抗β肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。報(bào)告質(zhì)粒pGL4.32［luc2P/NF-κB-RE/Hygro］、內(nèi)參質(zhì)粒pGL4.74［hRluc/TK］和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA3.1-FLAG-ORF140重組質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證及表達(dá)

在NCBI上搜索得到GTPV Pellor株錨蛋白ORF140基因序列。由武漢金開瑞優(yōu)化合成重組質(zhì)粒pcDNA3.1-FLAG-ORF140。雙酶切驗(yàn)證：5 μL 10×FastDigest緩沖液，30 μL pcDNA3.1-FLAG-ORF140重組質(zhì)粒，1 μL KpnⅠ，1 μL BamHⅠ，13 μL ddH2O。將配好的體系放入37℃水浴5 min后，加入10 μL 6×DNA上樣染料，取10 μL進(jìn)行瓊脂凝膠電泳驗(yàn)證雙酶切片段大小。

將生長(zhǎng)良好的HEK293T細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞匯合至75%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-3×FLAG-N和pcDNA3.1-FLAG-ORF140各2.5 μg，轉(zhuǎn)染24 h后，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白。取上述蛋白樣品20 μg進(jìn)行SDS-PAGE。4 ℃、250 mA轉(zhuǎn)膜1 h。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h（稀釋液為1×TBST）。分別用小鼠抗FLAG抗體（1∶3 000）、小鼠抗β-actin抗體（1∶2 000），4 ℃搖床過夜孵育；TBST洗滌3次后，分別加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）或HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶10 000），室溫孵育1 h；TBST充分洗膜，滴加ECL發(fā)光顯色試劑盒的A與B液的混合液于Bio-Rad Western顯色儀曝光。

1.2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)ORF140對(duì)NF-κB通路的影響

將生長(zhǎng)良好的HEK293T細(xì)胞接種于24孔板，分4組，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔，待細(xì)胞匯合至75%時(shí)利用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FLAG-ORF140、報(bào)告質(zhì)粒pGL4.32［luc2P/NF-κB-RE/Hygro］及內(nèi)參質(zhì)粒pGL4.74［hRluc/TK］。pcDNA3.1-3×FLAG-N、pcDNA3.1-FLAG-ORF140總量均為500 ng·孔-1，報(bào)告質(zhì)粒pGL4.32［luc2P/NF-κB-RE/Hygro］為500 ng·孔-1，內(nèi)參質(zhì)粒pGL4.74［hRluc/TK］為50 ng·孔-1。pcDNA3.1-FLAG-ORF140設(shè)4個(gè)劑量梯度，分別為0、125、250、500 ng·孔-1，不足100 ng時(shí)用pcDNA3.1-3×FLAG-N空載體補(bǔ)足。轉(zhuǎn)染24 h后每組3個(gè)重復(fù)孔加入1 μL濃度為10 ng·μL-1的TNF-α溶液，使培養(yǎng)液中TNF-α的終濃度為20 ng·mL-1，另外3個(gè)重復(fù)孔加入相同體積的無血清DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液。刺激細(xì)胞6 h后收獲細(xì)胞，通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定螢光素酶活性。

1.2.3 間接免疫熒光檢測(cè)ORF140蛋白在HEK293T細(xì)胞的定位

使用多聚賴氨酸在室溫包被20 mm的共聚焦皿30 min，干燥后將生長(zhǎng)良好的HEK293T細(xì)胞接種于20 mm的共聚焦皿中，分3組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，待共聚焦皿的細(xì)胞匯合至75%時(shí)，試驗(yàn)組兩組利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FLAG-ORF140 2.5 μg；對(duì)照組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-3×FLAG-N 2.5 μg。轉(zhuǎn)染24 h后，取一組試驗(yàn)組加入4 μL濃度為10 ng·μL-1的TNF-α溶液，使培養(yǎng)液中TNF-α的終濃度為20 ng·mL-1，另外兩組加入相同體積的無血清DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液。刺激細(xì)胞6 h后，棄去原有培養(yǎng)基，吸棄細(xì)胞上清液，用4%多聚甲醛室溫固定15 min、0.1% Triton X-100室溫通透30 min、含10%山羊血清的PBS封閉液室溫封閉30 min。然后，加入小鼠抗FLAG單克隆抗體作為一抗，4 ℃放置過夜；再加入Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體作為二抗，室溫孵育1 h；最后，加入DAPI對(duì)細(xì)胞核室溫染色5 min，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察ORF140的定位情況。

1.2.4 ORF140對(duì)NF-κB通路關(guān)鍵因子的影響

將生長(zhǎng)良好的HEK293T細(xì)胞接種于12孔板，待細(xì)胞匯合至75%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-3×FLAG-N和pcDNA3.1-FLAG-ORF140各2.5 μg，轉(zhuǎn)染24 h后，加入4 μL濃度為10 ng·μL-1的TNF-α溶液，使培養(yǎng)液中TNF-α的終濃度為20 ng·mL-1，繼續(xù)培養(yǎng)0、15、30、60 min后收集細(xì)胞，利用胞質(zhì)胞核蛋白提取試劑盒，分別提取胞質(zhì)蛋白和胞核蛋白。取上述蛋白樣品20 μg進(jìn)行SDS-PAGE。4 ℃、250 mA轉(zhuǎn)膜1 h。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h（稀釋液為1×TBST）。分別用兔抗IKKα抗體（1∶1 000）、兔抗IκBα抗體（1∶1 000）、兔抗p-IκBα抗體（1∶1 000）、兔抗NF-κB-p65抗體（1∶1 000）、兔抗histone H3抗體（1∶1 000）、兔抗β-tubulin抗體（1∶2 000）、小鼠抗β-actin抗體（1∶2 000），4 ℃搖床過夜孵育；TBST洗滌3次后，分別加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）或HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶10 000），室溫孵育1 h；TBST充分洗膜，滴加ECL發(fā)光顯色試劑盒的A與B液的混合液于Bio-Rad Western顯色儀曝光。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有涉及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次，以“x±s”表示，用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)平均值間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。*. Plt;0.05；**. Plt;0.01；***. Plt;0.001；****. Plt;0.000 1。

2 結(jié) 果

2.1 ORF140蛋白在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)

通過質(zhì)粒圖譜分析，pcDNA3.1-FLAG-ORF140重組質(zhì)粒中ORF140蛋白基因大小為1 509 bp，其編碼蛋白分子大小為61.7 ku。將pcDNA3.1-FLAG-ORF140重組質(zhì)粒通過KpnⅠ、BamH Ⅰ進(jìn)行雙酶切鑒定，得到1 509 bp的目的條帶（圖1A），這說明pcDNA3.1-FLAG-ORF140重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞24 h后，收集并裂解細(xì)胞，通過Western blot技術(shù)檢測(cè)ORF140蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，檢測(cè)出一條約61.7 ku帶FLAG標(biāo)簽的目的蛋白，表明重組質(zhì)粒pcDNA3.1-FLAG-ORF140可在HEK293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)（圖1B）。

2.2 ORF140蛋白對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響

為研究ORF140對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，在HEK293T細(xì)胞中通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)ORF140的對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度的遞增，ORF140蛋白的表達(dá)量逐漸增加（圖2A）；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)顯示，pcDNA3.1-FLAG-ORF140對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性具有顯著的抑制作用，且抑制作用隨ORF140表達(dá)量的增加有逐步增強(qiáng)的趨勢(shì)（圖2B）。

2.3 ORF140蛋白在HEK293T細(xì)胞中的定位

為了探究GTPV ORF140蛋白在TNF-α刺激或不刺激情況下的細(xì)胞定位，將pcDNA3.1-FLAG-ORF140質(zhì)粒與pcDNA3.1-3×FLAG-N質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，24 h后用或不用TNF-α培養(yǎng)液刺激細(xì)胞6 h之后，通過間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)ORF140的亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，未刺激的細(xì)胞組中紅色熒光分布于細(xì)胞質(zhì)中，未與細(xì)胞核重疊；刺激的細(xì)胞組中紅色熒光也分布于細(xì)胞質(zhì)中，未與細(xì)胞核重疊（圖3），證明ORF140蛋白靶向定位于細(xì)胞質(zhì)中，且在NF-κB通路被激活的情況下也未發(fā)生核移位。綜上所述，推測(cè)ORF140蛋白可能在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用從而下調(diào)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。

2.4 ORF140對(duì)NF-κB-p65核移位的影響

NF-κB-p65的核移位是NF-κB信號(hào)通路激活的重要標(biāo)志。為探討ORF140抑制NF-κB信號(hào)通路活性的機(jī)制，通過Western blot技術(shù)分別檢測(cè)pcDNA3.1-3×FLAG-N轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1-FLAG-ORF140轉(zhuǎn)染組中，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中NF-κB-p65的蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，TNF-α刺激30 min后，pcDNA3.1-FLAG-ORF140轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1-3×FLAG-N轉(zhuǎn)染組相比，其NF-κB-p65的核移位蛋白量相對(duì)減少，而滯留在細(xì)胞質(zhì)中的量多于對(duì)照組（圖4），說明NF-κB-p65核移位受到抑制。

2.5 ORF140對(duì)IKKα磷酸化、IκBα磷酸化、p-IκBα降解的影響

NF-κB-p65核移位的前提是IKKα磷酸化、IκBα磷酸化與p-IKBα降解。為進(jìn)一步探討ORF140抑制NF-κB活性的作用位點(diǎn)，通過Western blot技術(shù)分別檢測(cè)pcDNA3.1-3×FLAG-N轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1-FLAG-ORF140轉(zhuǎn)染組中IKKα蛋白量、IκBα蛋白量和p-IκBα蛋白量。結(jié)果顯示，pcDNA3.1-FLAG-ORF140轉(zhuǎn)染組中IKKα與IκBα的總蛋白量與pcDNA3.1-3×FLAG-N對(duì)照組一致（圖5B、C）；在TNF-α刺激15 min時(shí)，pcDNA3.1-FLAG-ORF140轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1-3×FLAG-N對(duì)照組相比，p-IKBα總蛋白量相對(duì)增加（圖5D），表明IKKα的磷酸化、IκBα的磷酸化均未受到影響，而p-IκBα的降解被抑制。

3 討 論

NF-κB通路是機(jī)體免疫系統(tǒng)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，是病毒調(diào)控宿主免疫功能的一個(gè)重要靶點(diǎn)，在病毒感染致病的過程中起關(guān)鍵作用［21-22］。許多研究證明，各種痘病毒通過編碼大量的免疫調(diào)節(jié)蛋白作用于這一重要靶系統(tǒng)，應(yīng)對(duì)機(jī)體的免疫清除和免疫反應(yīng)［23］。其中錨蛋白是主要的免疫調(diào)控分子之一，但錨蛋白在感染過程中的確切作用尚不明確［24］。目前有關(guān)痘病毒錨蛋白抑制NF-κB信號(hào)通路的研究已有很多［25］，但山羊痘病毒編碼的錨蛋白對(duì)NF-κB通路有怎樣的調(diào)控作用尚未見報(bào)道。

通過生物信息學(xué)分析比對(duì)發(fā)現(xiàn)，GTPV ORF140與羊口瘡病毒（orf virus，ORFV）編碼的錨蛋白ORF008和ORF123的C末端都具有一個(gè)保守的F-box結(jié)構(gòu)域，GTPV ORF140與ORFV ORF008的N末端都含有7個(gè)錨蛋白重復(fù)序列（ANK基序），而ORFV ORF123的N末端含有9個(gè)ANK基序，說明GTPV ORF140與ORFV ORF008和ORF123可能具有相似的功能。間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)GTPV ORF140定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖3），這與ORFV ORF008與ORF123的細(xì)胞定位相同［26-27］。

有研究證明ORFV編碼的錨蛋白ORF008、ORF123、ORF126、ORF128、ORF129都能夠抑制NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而為病毒復(fù)制提供有利環(huán)境［28-29］。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果顯示GTPV ORF140對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性具有顯著的抑制作用，且該抑制作用具有劑量依賴性（圖2）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GTPV ORF140能夠抑制NF-κB-p65的核移位（圖4）。IKKα磷酸化、IκBα磷酸化與p-IKBα降解是NF-κB-p65核移位的上游反應(yīng)，故深入檢測(cè)了GTPV ORF140對(duì)IKKα磷酸化、IκBα磷酸化與p-IKBα降解的影響。結(jié)果顯示，GTPV ORF140能夠顯著抑制p-IκBα的降解，但I(xiàn)KKα與IκBα的磷酸化均未受到影響（圖5），故推測(cè)GTPV ORF140可能通過抑制p-IκBα的降解與NF-κB-p65的核移位參與調(diào)控NF-κB信號(hào)通路。病毒感染機(jī)體后，上游蛋白（如TNF受體-1）激活I(lǐng)KK復(fù)合物，活化的IKK復(fù)合物催化IκBα產(chǎn)生磷酸化，磷酸化的IκBα（p-IκBα）在SCF（Skpl-Cull-F-box，SCF）E3泛素連接酶復(fù)合物的催化下降解，釋放NF-κB-p65二聚體，隨后NF-κB-p65二聚體產(chǎn)生核移位，在細(xì)胞核中與基因組DNA的特定位點(diǎn)結(jié)合，從而啟動(dòng)抗病毒基因的表達(dá)［6］。NF-κB-p65的核移位是NF-κB信號(hào)通路激活的重要標(biāo)志。ORFV ORF008與ORF123可通過抑制p-IκBα的降解來抑制NF-κB-p65的入核，進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)通路的活化［26-27］。這與本研究結(jié)果相似，進(jìn)一步說明了GTPV ORF140可能通過抑制p-IκBα的降解與NF-κB-p65的核移位來下調(diào)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。

在宿主細(xì)胞中，p-IκBα?xí)籗CF E3泛素連接酶復(fù)合物識(shí)別發(fā)生泛素化降解，而SCF E3泛素連接酶復(fù)合物由含有RING結(jié)構(gòu)域的蛋白R(shí)oc1，以及Cullin-1、Skp1和含有F-box結(jié)構(gòu)域的底物銜接蛋白β-TrCP組成。Cullin-1作為分子支架，連接Roc1與Skp1，而Skp1可與底物銜接蛋白β-TrCP的F-box結(jié)構(gòu)域互作從而形成E3泛素連接酶復(fù)合物［12］。已有研究證明鼠痘病毒（ectromelia virus，ECTV）編碼的錨蛋白EVM002、EVM005、EVM154和EVM165［12］，牛痘病毒（cowpox virus，CPXV）編碼的錨蛋白CP77［11］均可借助其F-box結(jié)構(gòu)域與Skp1互作來調(diào)節(jié)SCF E3泛素連接酶復(fù)合物從而抑制p-IκBα的降解。本研究發(fā)現(xiàn)，GTPV ORF140也能夠抑制p-IκBα的降解（圖5D），鑒于GTPV ORF140與鼠痘病毒編碼的錨蛋白及CPXV CP77也具有相似的C端F-box結(jié)構(gòu)域。因此，后續(xù)可進(jìn)一步驗(yàn)證GTPV ORF140是否也能通過其C端F-box結(jié)構(gòu)域與Skp1互作來抑制p-IκBα的降解，從而影響NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明GTPV ORF140定位在細(xì)胞質(zhì)中，可能通過阻斷p-IKBα降解與NF-κB-p65核移位來抑制NF-κB通路的活性，為闡明GTPV編碼的錨蛋白在痘病毒感染過程發(fā)揮的作用作出了新的解釋。

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（編輯 白永平）