敵草快誘導(dǎo)肉雞氧化損傷模型的建立及其分子機(jī)制研究

摘 要： 旨在建立敵草快誘導(dǎo)的肉雞氧化損傷模型，并初步揭示其分子機(jī)制。將160只1日齡肉雞隨機(jī)分為4組，對(duì)照組（C）、低劑量組（T1）、中劑量組（T2）和高劑量組（T3）組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只。在第16日齡（第一階段）時(shí)，每個(gè)重復(fù)抽取5只雞，第37日齡（第二階段）時(shí)抽取剩余5只雞，稱取肉雞體重，計(jì)算每組平均體重，腹腔注射敵草快。T1、T2和T3組分別腹腔注射5、10、20 mg·kg－1的敵草快，對(duì)照組注射相應(yīng)劑量的生理鹽水。兩次注射后的當(dāng)天和第5天，每個(gè)重復(fù)抽取2只，采血并取樣。結(jié)果表明：兩次注射敵草快后，與對(duì)照組相比，1）試驗(yàn)組肉雞精神沉郁、飲食減少，T3組注射后6 h有2只雞出現(xiàn)死亡，注射后72 h和96 h試驗(yàn)組肉雞體重均極顯著降低（Plt;0.01）；2）T2和T3組血清中二胺氧化酶（DAO）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性均極顯著（Plt;0.01）升高；3）T2和T3組血清中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性均極顯著降低（Plt;0.01），丙二醛（MDA）水平均極顯著升高（Plt;0.01），第二階段T3組血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著降低（Plt;0.05）；4）試驗(yàn)組各組血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）含量均極顯著升高（Plt;0.01）；5）試驗(yàn)組出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肝細(xì)胞空泡樣變，細(xì)胞質(zhì)疏松明顯，且各腸段絨毛脫落較為嚴(yán)重；組織學(xué)評(píng)分顯示，與對(duì)照組相比，T2組與T3組肝臟和小腸評(píng)分均極顯著升高（Plt;0.01），除第二階段十二指腸評(píng)分外，T1組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異；6）各試驗(yàn)組肉雞肝臟和空腸中ZO-1和OCLDN mRNA表達(dá)量均極顯著降低（Plt;0.01）；7）肝臟中T2組HO-1 mRNA表達(dá)量顯著低于T1組（Plt;0.05）；空腸中T2組和T3組Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)量較T1組均極顯著降低（Plt;0.01）。綜上所述，本研究成功建立敵草快誘導(dǎo)的肉雞氧化損傷模型，且以10 mg·kg-1的注射劑量為建立氧化損傷模型最為適宜，同時(shí)發(fā)現(xiàn)敵草快可能通過Nrf2/HO-1信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)炎癥相關(guān)因子生成且抑制抗氧化酶的表達(dá)，引起肉雞腸道屏障損傷，從而引起肉雞炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞： 敵草快；氧化損傷；Nrf2/HO-1信號(hào)通路；炎癥反應(yīng)

中圖分類號(hào)：S858.31

"文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）11-5101-13

收稿日期：2024-01-25

基金項(xiàng)目：天津市“131”創(chuàng)新型人才團(tuán)隊(duì)（20180338）

作者簡(jiǎn)介：胡 月（1999-），女，內(nèi)蒙古呼倫貝爾人，碩士生，主要從事動(dòng)物性食品生產(chǎn)與安全研究，E-mail： 734853801@qq.com

*通信作者：李?；?，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與免疫研究，E-mail： lihaihuaok@126.com；喬家運(yùn)，主要從事畜禽健康養(yǎng)殖研究，E-mail： qiaojy1979@126.com

Establishment and Molecular Mechanism Study of Diquat Induced Oxidative Damage Model in Broilers Chickens

HU" Yue1， YI" Ting1， QIAO" Jiayun2*， LI" Yupeng3，4，5， LI" Haihua1*

（1.Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry，

College of Animal Science and Veterinary Medicine， Tianjin Agricultural University，

Tianjin 300384，" China; 2.Tianjin Key Laboratory of Conservation and Utilization of

Animal Diversity， College of Life Sciences， Tianjin Normal University， Tianjin 300387，" China;

3.Institute of Animal Science and Veterinary， Tianjin Academy of

Agricultural Sciences， Tianjin 300381， China;

4.Tianjin Key Laboratory of

Animal Molecular Breeding and Biotechnology， Tianjin 300381，" China;

5.Tianjin

Engineering Research Center of Animal Healthy Farming， Tianjin 300381，" China）

Abstract：" The aim of this study was to establish a model of oxidative damage induced by diquat in broilers and to preliminarily reveal its molecular mechanism. A total of 160 1-day-old broilers were randomly divided into four groups： control group （C）， low-dose group （T1）， medium-dose group （T2） and high-dose group （T3）， 4 replicates per group， 10 replicates each. Five chickens were sampled in each replicate at the 16th（the first stage）， and the remaining five chickens were sampled at 37th （the second stage） day of age， broilers were weighed， the average body weight of each group was calculated， and diquat was injected intraperitoneally. The T1， T2 and T3 groups were intraperitoneally injected with 5， 10， and 20 mg·kg-1 of diquat， respectively， and the control group was injected with the corresponding dose of normal saline. The day and the fifth day after the two injections， two broilers were randomly taken from each replicate and blood collection and sampling were conducted. The results showed that after two injections of diquat， compared with the control group， 1） The broilers in the experimental groups were depressed and drank less water and eaten less， 2 broilers in the T3 group died at 6 h after each injection， and the body weight of broilers in the experimental groups were extremely significant reduced at 72 h and 96 h after each injection （Plt;0.01）; 2） The serum activity of diamine oxidase （DAO）， alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST） in the T2 and T3 groups were extremely significant increased （Plt;0.01）; 3） The serum activity of glutathione peroxidase （GSH-Px） in the T2 and T3 groups were extremely significant decreased （Plt;0.01）， and the serum levels of malondialdehyde （MDA） were extremely significant increased （Plt;0.01）. The serum activity of superoxide dismutase （SOD） in the T3 group after the second infection was significantly decreased （Plt;0.05）; 4） The serum contents of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in each experimental group were extremely significant increased （Plt;0.01）; 5） In the experimental groups， inflammatory cell infiltration was present， some hepatocytes were vacuolated， cytoplasmic was obvious laxity， and the villi loss of each intestinal segment was serious; Histological scores showed that the liver and small intestine scores in both the T2 and T3 groups were extremely significant higher than control group（Plt;0.01），

and except the histological score of duodenum at the second stage， there was no significant difference between the T1 group and the control group; 6） The mRNA expressions of ZO-1 and OCLDN in the liver and jejunum of broilers in each experimental group were extremely significant decreased（Plt;0.01）; 7） The mRNA expression of HO-1 in the liver of T2 group was significantly lower than T1 group （Plt;0.05）; The mRNA expressions of Nrf2 and HO-1 in jejunum of T2 and T3 groups were extremely significant lower than T1 group（Plt;0.01）. In summary， this study successfully established a model of oxidative damage induced by diquat in broilers， and the injection dose of 10 mg·kg-1 was the most appropriate to establish the oxidative damage model， and it was found that diquat may induce the production of inflammation-related factors and inhibit the expression of antioxidant enzymes through the Nrf2/HO-1 signaling pathway， causing intestinal barrier damage in broilers， thereby causing inflammatory response in broilers.

Key words： diquat; oxidative damage;" Nrf2/HO-1 signaling pathway; inflammatory response

*Corresponding authors：" LI Haihua， E-mail： lihaihuaok@126.com; QIAO Jiayun， E-mail： qiaojy1979@126.com

在養(yǎng)雞過程中，常常會(huì)遇到外界環(huán)境刺激、病原體、霉菌毒素、重金屬等因素［1］帶來(lái)的氧化應(yīng)激。此時(shí)，動(dòng)物體內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生過量的活性氧（ROS）和活性氮（RNS），導(dǎo)致體內(nèi)氧化程度超出抗氧化物的清除能力，氧化失衡會(huì)造成細(xì)胞膜的完整性受到破壞、組織器官受損，進(jìn)而引發(fā)疾病、影響動(dòng)物正常代謝和生長(zhǎng)。在高密度、集約化飼養(yǎng)的環(huán)境下，肉雞生產(chǎn)中出現(xiàn)的生產(chǎn)性能下降、產(chǎn)品品質(zhì)降低、發(fā)病率升高及免疫機(jī)能下降等都與氧化應(yīng)激有關(guān)［2］。為降低應(yīng)激對(duì)肉雞產(chǎn)業(yè)造成的影響，一些抗氧化飼料添加劑已經(jīng)普遍用于肉雞生產(chǎn)中。盡管目前已有建立蛋雞氧化損傷模型的報(bào)道［3］，由于不同品種對(duì)應(yīng)激源的敏感性不同，很難用于評(píng)價(jià)抗氧化飼料添加劑在肉雞上的功效。因此，建立一個(gè)穩(wěn)定的肉雞氧化應(yīng)激模型，其重要性不言而喻。

敵草快（diquat，DQ）是一種在構(gòu)建氧化損傷模型時(shí)常用的應(yīng)激源，它在氧分子存在下很容易轉(zhuǎn)化為自由基，從而產(chǎn)生高活性超氧陰離子和其他氧化還原產(chǎn)物如過氧化氫（H2O2），啟動(dòng)下游的靶基因隨后通過擾亂氧化劑和抗氧化過程之間的平衡而造成細(xì)胞蛋白、脂質(zhì)、核酸等大分子損傷［4］。此外，DQ還會(huì)級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)，破壞信號(hào)通路，例如，抑制核因子-E2相關(guān)因子2（Nrf2）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，下調(diào)下游的抗氧化酶如SOD、GSH-Px、血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致組織損傷。已有研究表明，DQ可以降低斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能，損害抗氧化能力，引起肝臟和腸道功能障礙，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)，并破壞腸道屏障完整性［5］。然而，有關(guān)DQ引致氧化損傷的分子機(jī)制尚不是十分清楚。因此，本研究以敵草快為應(yīng)激源，建立引致肉雞氧化損傷的動(dòng)物模型，并在模型成功建立的基礎(chǔ)上，探究敵草快對(duì)肉雞腸道屏障功能的影響，以及通過Nrf2/HO-1信號(hào)通路探討其氧化損傷的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

160只1日齡817雜交肉雞，自然光照下，雞舍溫度控制在33 ℃，逐漸下降恒定至23 ℃，每日按標(biāo)準(zhǔn)飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)期間自由采食和飲水，試驗(yàn)期為42 d。隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組（C）、低劑量組（T1）、中劑量組（T2）和高劑量組（T3），每個(gè)組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只?；谌怆u生長(zhǎng)階段，分別在第16日齡（第一階段）時(shí)每個(gè)重復(fù)抽取5只雞，第37日齡（第二階段）時(shí)抽取剩余5只雞，稱取肉雞體重，計(jì)算每組平均體重，腹腔注射敵草快（購(gòu)自上海農(nóng)藥研究所有限公司）。敵草快的注射劑量參考王曼等［6］方法并有所改進(jìn)，T1組為5 mg·kg－1，T2組為10 mg·kg－1，T3組為20 mg·kg－1，對(duì)照組注射相應(yīng)劑量的生理鹽水。

1.2 臨床觀察與體重稱量

在第16日齡（第一階段）和37日齡（第二階段）注射敵草快后，觀察肉雞精神狀況、糞便等臨床表現(xiàn)，并在注射后5 d稱量每只肉雞體重。

1.3 樣品采集

兩次注射后的當(dāng)天和第5天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取2只肉雞，進(jìn)行頸靜脈采血并分離血清，置于-80 ℃保存，用于血清相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。解剖肉雞并采集腸道和肝組織樣品，將組織分別置于4%多聚甲醛和-80 ℃中保存，用于組織切片試驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 血清中生化、氧化損傷及炎性指標(biāo)含量的測(cè)定

使用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（購(gòu)自美國(guó)BD公司）檢測(cè)DAO、TNF-α和IL-6的含量，使用試劑盒（購(gòu)自南京建成生物工程研究所）檢測(cè)ALT、AST、SOD、GSH-Px和MDA的含量。血清樣品按照試劑盒操作說明進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2 肉雞肝和小腸組織切片的制作與觀察

參考吳悅等［7］組織切片方法，將4%多聚甲醛內(nèi)的肉雞的肝和小腸過夜脫水、石臘包埋，并以5 μm厚進(jìn)行切片，蘇木素-伊紅染色后，中性樹膠封固，使用Revolve正倒置一體顯微鏡觀察切片。參考Pang等［8］評(píng)分方法對(duì)肝細(xì)胞腫脹程度、肝細(xì)胞空泡樣變的范圍、肝細(xì)胞壞死程度進(jìn)行評(píng)分，參考Ferrocino等［9］評(píng)分方法對(duì)十二指腸、空腸和回腸的腸絨毛脫落情況、腸上皮細(xì)胞腫脹和變性程度、腸黏膜下層水腫程度等病理變化程度進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.4.3 熒光定量PCR檢測(cè)肝和空腸內(nèi)關(guān)鍵緊密連接蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

按照試劑盒說明書對(duì)肉雞組織進(jìn)行RNA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系。參照劉雪姣等［10］的方法，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參基因，通過2-△△Ct方法計(jì)算ZO-1和OCLDN基因的相對(duì)表達(dá)。引物序列參考文獻(xiàn)［11］，引物均由生工生物工程科技（北京）股份有限公司合成，引物信息見表2。所使用的熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司。

1.4.4 熒光定量PCR檢測(cè)肝和空腸內(nèi)Nrf2/HO-1信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

肝和空腸中Nrf2和HO-1基因的相對(duì)表達(dá)分析方法同操作步驟同“1.4.3”所述。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中肉雞Nrf2、HO-1和GAPDH的mRNA序列，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物均由生工生物工程科技（北京）股份有限公司合成，引物信息見表2。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，通過SPSS 20.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，使用GraphPad Prism 9.0進(jìn)行繪圖。P≤0.05為差異顯著，Plt;0.01為差異極顯著，Pgt;0.05為無(wú)顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 肉雞的臨床表現(xiàn)及體重變化

在試驗(yàn)期間，對(duì)照組肉雞體態(tài)活潑、呼吸平穩(wěn)、糞便性狀及飲水進(jìn)食均正常。注射敵草快48 h后，試驗(yàn)組均出現(xiàn)精神沉郁、呆臥少動(dòng)、呼吸淺快、飲水進(jìn)食減少、糞便不成形等現(xiàn)象，至注射后72 h，出現(xiàn)掉毛、眼部輕度充血、偶見眼鼻部血性分泌物，且注射劑量越高，上述臨床表現(xiàn)越明顯。隨著攻毒時(shí)間延長(zhǎng)，至96 h后，肉雞精神狀態(tài)、食欲、行為活動(dòng)等逐漸緩解。兩次攻毒后對(duì)照組和試驗(yàn)組的臨床表現(xiàn)基本相似。觀察不同攻毒劑量肉雞21 d和42 d的存活情況發(fā)現(xiàn)，T3組均在注射敵草快6 h后，出現(xiàn)2只肉雞死亡，其余組各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)死亡。

兩次攻毒敵草快后肉雞體重變化情況見圖1。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組在兩次注射敵草快后均出現(xiàn)不同程度的體重下降。在注射敵草快后0、24和48 h時(shí)，各組之間體重?zé)o顯著差異。在注射后72、96和120 h時(shí)，試驗(yàn)組各組體重均極顯著低于對(duì)照組（Plt;0.01），其中，在注射后72 h時(shí)，T3組體重極顯著低于T1組（Plt;0.01）；在注射后96 h時(shí)，T3組體重極顯著（Plt;0.01）低于T1和T2組；在注射后120 h時(shí)，T3組體重極顯著低于T1和T2組（Plt;0.01），但在第一次注射時(shí)，T3和T2組體重?zé)o顯著差異。試驗(yàn)組攻毒至96 h后，體重均逐步回升，但仍低于正常水平。

2.2 敵草快對(duì)肉雞血清中生化指標(biāo)的影響

注射當(dāng)天對(duì)各組肉雞血清及組織檢測(cè)均無(wú)顯著差異，故數(shù)據(jù)未顯示，下同。

敵草快對(duì)肉雞血清生化指標(biāo)的影響結(jié)果見圖2。與對(duì)照組相比，第一次注射敵草快后T1組血清中DAO（Plt;0.01）和第二次注射敵草快后T1組血清ALT和AST的活性極顯著升高（Plt;0.01），而兩次注射敵草快后T2和T3組血清中DAO、ALT和AST的活性均極顯著升高（Plt;0.01，圖2A～2F）。

2.3 敵草快對(duì)肉雞血清中氧化損傷指標(biāo)的影響

第一階段注射敵草快對(duì)肉雞血清氧化損傷指標(biāo)的影響，結(jié)果如圖3A～3C所示。與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組血清中SOD活性無(wú)顯著差異（圖3A）；T2和T3組GSH-Px活性極顯著低于對(duì)照組（Plt;0.01），且T3組極顯著低于T1組（Plt;0.01，圖3B）；T2和T3組MDA水平均極顯著高于對(duì)照組（Plt;0.01），且T2和T3組MDA水平均極顯著高于T1組（Plt;0.01，圖3C）。

第二階段注射敵草快對(duì)肉雞血清氧化損傷指標(biāo)的影響，結(jié)果如圖3D～3F所示。與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組SOD和GSH-Px活性均降低，其中，T3組SOD活性顯著低于對(duì)照組（Plt;0.05），T2和T3組GSH-Px活性均極顯著低于對(duì)照組（Plt;0.01，圖3D、3E）；T2和T3組MDA水平均極顯著高于對(duì)照組（Plt;0.01），且T3組中MDA水平極顯著高于T1組（Plt;0.01，圖3F）。

2.4 敵草快對(duì)肉雞血清中炎性指標(biāo)的影響

敵草快對(duì)肉雞血清炎性指標(biāo)的影響結(jié)果見圖4。兩次注射敵草快后，各試驗(yàn)組血清中TNF-α含量均極顯著高于對(duì)照組（Plt;0.01，圖4A、4C），且T3組極顯著高于T1組（Plt;0.05）；與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組血清中IL-6含量均極顯著升高（Plt;0.01），且各試驗(yàn)組之間無(wú)顯著差異（圖4B、4D）。

2.5 肉雞組織切片觀察

第一階段和第二階段注射敵草快肉雞組織切片觀察結(jié)果分別見圖5和圖6。兩次注射敵草快后，肝組織的變化情況是：與對(duì)照組相比，T1組均為結(jié)構(gòu)組織松散，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；T2組炎性細(xì)胞增多，部分肝細(xì)胞空泡樣變，肝竇輕度擴(kuò)張；T3組肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，炎性細(xì)胞增多，組織結(jié)構(gòu)松散嚴(yán)重。小腸組織的變化情況是：對(duì)照組各段小腸腸絨毛排列整齊，少有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；T1組均出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞，部分絨毛脫落，空腸固有層出現(xiàn)病理水腫；T2組均為炎性細(xì)胞增多，絨毛脫落較為嚴(yán)重且部分隱窩丟失，空腸和回腸出現(xiàn)固有層病理水腫；T3組均為絨毛壞死脫落嚴(yán)重，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)且出現(xiàn)長(zhǎng)絨毛水腫，十二指腸固有層出現(xiàn)病理水腫。

采用組織學(xué)評(píng)分分析敵草快對(duì)肝和小腸組織結(jié)構(gòu)影響，結(jié)果如圖7所示。兩次注射敵草快后，與對(duì)照組相比，T1組肝臟和小腸各段評(píng)分均無(wú)顯著差異（圖7A和7B），但在第二階段注射后，T1組十二指腸評(píng)分極顯著高于對(duì)照組（Plt;0.01，圖7B）；與對(duì)照組相比，T2和T3組肝和小腸各段評(píng)分均極顯著（Plt;0.01）升高，但T3和T2組相比無(wú)顯著差異。

綜合組織切片觀察及組織學(xué)評(píng)分結(jié)果，在后續(xù)試驗(yàn)中選用肝和空腸進(jìn)行研究。

2.6 敵草快對(duì)肉雞肝和空腸緊密連接蛋白mRNA表達(dá)的影響

敵草快對(duì)肉雞肝和空腸緊密連接蛋白mRNA表達(dá)分析見圖8。兩次注射敵草快后，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組肉雞肝和空腸中ZO-1和OCLDN mRNA表達(dá)量均極顯著降低（Plt;0.01），其中，T2組和T3組尤為明顯，但在第二階段注射后，T2組肝和空腸中OCLDN mRNA表達(dá)量與T1組相比無(wú)顯著差異，T3組極顯著低于T1組（Plt;0.01），且與T2組無(wú)顯著差異（圖8C和8D）。

2.7 敵草快對(duì)肉雞肝和空腸Nrf2/HO-1信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白mRNA表達(dá)的影響

敵草快對(duì)肉雞肝臟和空腸Nrf2/HO-1信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白mRNA表達(dá)分析見圖9。兩次注射敵草快后，與對(duì)照組相比，肝和空腸中各試驗(yàn)組Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)量均極顯著降低（Plt;0.01），其中，T2組肝中HO-1 mRNA表達(dá)量顯著（Plt;0.05）低于T1組，T3組極顯著（Plt;0.01）"" 或顯著（Plt;0.05）低于T1和T2組（圖9A和9C）；空腸中T2和T3組Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)量較T1組均極顯著降低（Plt;0.01），T2和T3組Nrf2 mRNA表達(dá)量無(wú)顯著差異（圖9B和9D）。

3 討 論

腸道不僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場(chǎng)所，也是人體最大的免疫器官，完整的腸道結(jié)構(gòu)是免疫防御的基礎(chǔ)。DAO是具有高度活性的細(xì)胞結(jié)構(gòu)酶，在動(dòng)物小腸黏膜上層絨毛中，DAO不僅參與核酸和蛋白質(zhì)的合成，還調(diào)控腸黏膜細(xì)胞增殖。當(dāng)血清中DAO水平升高，表明腸道黏膜屏障功能衰竭或細(xì)胞壞死，因此，DAO活性或含量常用于反映腸道屏障功能［12］。在本研究中，與對(duì)照組相比，T2和T3組DAO含量極顯著升高，表明注射敵草快對(duì)肉雞腸道產(chǎn)生了負(fù)面影響，一定程度上對(duì)腸道屏障功能造成了損傷。此外，腸屏障功能受損、肝炎癥反應(yīng)和肝氧化應(yīng)激都與肝損傷的產(chǎn)生有著復(fù)雜的聯(lián)系［13］。當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)的ALT和肝細(xì)胞線粒體中的AST會(huì)釋放到血液中，即血清中的ALT與AST水平會(huì)增加。有研究表明，小鼠在受到氧化應(yīng)激時(shí)，血清中ALT與AST含量會(huì)顯著升高［14］。與前人研究一致，在本試驗(yàn)中，T2和T3組血清中ALT和AST含量與對(duì)照組相比極顯著升高，而T1組在第一階段注射后血清中ALT和AST含量含量相較于對(duì)照組和T2組無(wú)顯著差異，這說明注射不同劑量敵草快會(huì)導(dǎo)致肉雞受到不同程度的應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體代謝異常。

在畜禽生產(chǎn)中，當(dāng)機(jī)體氧化應(yīng)激使動(dòng)物處于亞健康狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)過多的氧自由基會(huì)對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA造成不可逆的損害，進(jìn)而破壞組織器官黏膜屏障，使機(jī)體功能損傷，容易引起疾病的發(fā)生，最終導(dǎo)致畜禽生產(chǎn)性能、繁殖性能、畜產(chǎn)品品質(zhì)降低等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益。SOD和GSH-Px在抗氧化防御系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用。SOD和GSH-Px可以有效清除體內(nèi)過多的自由基，減少脂質(zhì)過氧化，防止自由基對(duì)機(jī)體造成損害，維持體內(nèi)氧化平衡。MDA是氧化損傷的標(biāo)志物，是脂質(zhì)過氧化的結(jié)果，可導(dǎo)致DNA重組和細(xì)胞凋亡［15］。研究表明，動(dòng)物發(fā)生氧化損傷反應(yīng)，其血清或組織中抗氧化酶活性或表達(dá)量顯著降低，SOD和GSH-Px含量降低，MDA水平顯著升高，而組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、生長(zhǎng)性能等指標(biāo)可用于說明機(jī)體氧化損傷程度［16］。本研究中，腹腔注射敵草快不同程度的降低了肉雞血清中SOD和GSH-Px含量，并促使MDA水平的升高，尤其T2與T3組GSH-Px含量相較于對(duì)照組極顯著降低，且MDA水平極顯著升高，這與前人研究一致。此外，結(jié)合肉雞臨床表現(xiàn)、體重和生化相關(guān)指標(biāo)和組織病理觀察結(jié)果可知，在注射敵草快后，肉雞體重下降，血清生化指標(biāo)升高，腸道組織形態(tài)受損，顯示氧化還原失衡且超過了機(jī)體自身的調(diào)節(jié)能力，使機(jī)體發(fā)生了氧化損傷反應(yīng)，即肉雞氧化損傷模型建立成功。

動(dòng)物在被不同的刺激劑激活后，會(huì)表達(dá)過量的炎癥介質(zhì)，如一氧化氮（NO），以及TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎性細(xì)胞因子［17］。當(dāng)機(jī)體內(nèi)TNF-α過量產(chǎn)生或釋放時(shí)，可引發(fā)炎癥信號(hào)通路的激活，抑制OCLDN和ZO-1表達(dá)，誘發(fā)腸道和肝臟等組織損傷［18-19］。此外，TNF-α可作用于多種細(xì)胞，使機(jī)體釋放大量的IL-6，從而激發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。Tacke和Weiskirchen［20］發(fā)現(xiàn)，IL-6通過上調(diào)高脂飲食喂養(yǎng)小鼠中脂肪生成基因的表達(dá)，可導(dǎo)致肝臟脂肪炎癥和脂肪變性。因此，TNF-α和IL-6作為促炎因子常被用于評(píng)價(jià)畜禽的炎癥和感染反應(yīng)［21］。有研究表明，利用敵草快誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，會(huì)引起斷奶仔豬血清中TNF-α和IL-6含量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)［22］。與上述研究相似，本研究發(fā)現(xiàn)，注射敵草快會(huì)誘導(dǎo)肉雞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，且T2與T3組血清中TNF-α和IL-6含量均極顯著升高，說明肉雞的免疫系統(tǒng)被激活，導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子過量產(chǎn)生，加劇了肉雞的炎性反應(yīng)。此外，結(jié)合組織病理觀察結(jié)果可知，利用敵草快攻毒肉雞可導(dǎo)致肝細(xì)胞受損加重肝臟損傷，以及破壞腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響腸道屏障功能。

緊密連接蛋白由OCLDN、CLAUDIN和ZO-1等多種蛋白組成，這些蛋白可調(diào)節(jié)相鄰細(xì)胞中水、離子和大分子的胞外通透性，還可作為屏障來(lái)限制分子和離子的通過，從而防止某些炎癥性疾病的發(fā)生，加強(qiáng)細(xì)胞間連接，避免細(xì)胞損傷。OCLDN具有維持緊密連接穩(wěn)定性以及小腸通透性的作用；ZO-1可維持上皮細(xì)胞極性和腸道屏障通透性，并且決定了細(xì)胞間聚合的位置，調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞增殖［23］。緊密連接蛋白的減少，降低了腸上皮的硬度，提高了腸屏障的通透性，從而增加了腸道炎癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［24］。此外，肝中緊密連接蛋白與肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞結(jié)合，并參與膽汁分泌、流動(dòng)和代謝相關(guān)的生理功能。因此，OCLDN和ZO-1在蛋白水平和基因水平上的表達(dá)情況常被用于評(píng)價(jià)肝的損傷以及腸機(jī)械屏障功能的完整性［25］。本試驗(yàn)中，注射敵草快顯著降低了肉雞肝臟和空腸中緊密連接蛋白的表達(dá)量，特別是T2與T3組與對(duì)照組相比，肝臟和空腸中ZO-1和OCLDN mRNA含量均極顯著降低，但在第42日齡時(shí)，T2組肝和空腸中OCLDN mRNA表達(dá)量T1組相比無(wú)顯著差異，而T3組極顯著低于T1組。結(jié)合以上指標(biāo)的結(jié)果可知，敵草快導(dǎo)致肉雞發(fā)生氧化損傷是影響肝和腸道屏障損傷的一個(gè)重要原因，提示與其它試驗(yàn)組相比，兩個(gè)階段均以注射劑量為10 mg·kg－1的敵草快用于建立肉雞氧化損傷模型較為穩(wěn)定且最為適宜。

機(jī)體內(nèi)正常的代謝遭受外源刺激時(shí)會(huì)源源不斷地產(chǎn)生ROS，而ROS升高能夠使細(xì)胞質(zhì)中的Keap1失活，導(dǎo)致細(xì)胞中的Nrf2清除受阻，積累的Nrf2異位到細(xì)胞核中，促進(jìn)HO-1的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，發(fā)揮抗氧化作用，并增加抗氧化蛋白的表達(dá)，減少炎癥和氧化損傷［26］。研究表明，Nrf2/HO-1信號(hào)通路是體內(nèi)最重要的抗氧化防御機(jī)制之一［27］。Nrf2是抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)、炎癥反應(yīng)和其他生物過程［28］。HO-1是機(jī)體內(nèi)主要的抗氧化蛋白，可以促進(jìn)血紅素的降解以及膽綠素的生成，并清除氧化還原失衡所積累的自由基，從而發(fā)揮抗氧化作用［29］。此外，Nrf2可抑制NF-κB、TNF-α、IL-6和其他促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，并發(fā)揮抗炎作用［26］。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肝細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS時(shí)，GSH抗氧化系統(tǒng)被激活，泛素化的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核受到抑制，HO-1減少，進(jìn)而導(dǎo)致肝功能損傷［30］。并且，炎性細(xì)胞因子和趨化因子可通過抗氧化應(yīng)激信號(hào)失活和炎癥信號(hào)通路激活導(dǎo)致腸道氧化應(yīng)激和腸道屏障損傷，而Nrf2/HO-1信號(hào)通路是腸炎介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［31］。還有研究表明，激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路可有效改善動(dòng)物肝臟和腸道中的抗氧化能力［32-33］。在本試驗(yàn)中，隨著敵草快濃度的增加，肉雞肝臟和空腸中Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)量相對(duì)幅度的顯著降低，推測(cè)敵草快可能是通過Nrf2/HO-1信號(hào)通路導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力降低，引起肉雞氧化損傷。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功建立敵草快誘導(dǎo)的肉雞氧化損傷模型，且以注射劑量為10 mg·kg－1的敵草快建立肉雞氧化損傷模型最為適宜。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，敵草快可能通過抑制Nrf2和HO-1的mRNA表達(dá)量，從而促進(jìn)炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的生成增多，引起腸道屏障損傷，導(dǎo)致肉雞出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ SURAI P F，KOCHISH I I，F(xiàn)ISININ V I，et al.Antioxidant defence systems and oxidative stress in poultry biology：an update［J］.Antioxidants （Basel），2019，8（7）：235.

［2］ ABO GHANIMA M M，ABD EL-HACK M E，OTHMAN S I，et al.Impact of different rearing systems on growth，carcass traits，oxidative stress biomarkers，and humoral immunity of broilers exposed to heat stress［J］.Poult Sci，2020，99（6）：3070-3078.

［3］ WANG A Q，ZHANG K X，F(xiàn)U C Y，et al.Alleviation effect of conjugated linoleic acid on estradiol benzoate induced fatty liver hemorrhage syndrome in Hy-line male chickens［J］.J Anim Sci，2023，101：skad045.

［4］ ZHA P P，WEI L Y，LIU W H，et al.Effects of dietary supplementation with chlorogenic acid on growth performance，antioxidant capacity，and hepatic inflammation in broiler chickens subjected to diquat-induced oxidative stress［J］.Poult Sci，2023，102（3）：102479.

［5］ CAO S T，WU H，WANG C C，et al.Diquat-induced oxidative stress increases intestinal permeability，impairs mitochondrial function，and triggers mitophagy in piglets［J］.J Anim Sci，2018，96（5）：1795-1805.

［6］ 王 曼，李 敏，劉宏偉，等.博落回提取物對(duì)氧化應(yīng)激蛋雛雞生長(zhǎng)性能和氧化功能的影響［J］.中國(guó)畜牧雜志，2022，58（9）：290-293.

WANG M，LI M，LIU H W，et al.Effect of Macleaya cordata extract on growth performance and oxidative function of oxidative stress egg chicks［J］.Chinese Journal of Animal Science，2022，58（9）：290-293.（in Chinese）

［7］ 吳 悅，王怡夢(mèng)，王萌萌，等.致病性大腸桿菌感染小鼠腸炎模型的建立及其分子機(jī)制研究［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2021，33（10）：5817-5826.

WU Y，WANG Y M，WANG M M，et al.Establishment of enteritis model in mice infected with enterotoxigenic Escherichia coli and its molecular mechanism［J］.Chinese Journal of Animal Nutrition，2021，33（10）：5817-5826.（in Chinese）

［8］ PANG X Y，MIAO Z Q，DONG Y Y，et al.Dietary methionine restriction alleviates oxidative stress and inflammatory responses in lipopolysaccharide-challenged broilers at early age［J］.Front Pharmacol，2023，14：1120718.

［9］ FERROCINO I，BIASATO I，DABBOU S，et al.Lactiplantibacillus plantarum，Lactiplantibacillus pentosus and inulin meal inclusion boost the metagenomic function of broiler chickens［J］.Anim Microbiome，2023，5（1）：36.

［10］ 劉雪姣，李海花，王怡夢(mèng)，等.沙門菌感染小鼠氧化應(yīng)激模型的建立及其分子機(jī)制研究［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2021，48（10）：3834-3844.

LIU X J，LI H H，WANG Y M，et al.Establishment of oxidative stress model in mice infected with Salmonella and its molecular mechanism［J］.China Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine，2021，48（10）：3834-3844.（in Chinese）

［11］ 魏 慶，魏朝陽(yáng)，王克瑋，等.植物精油和檸檬酸復(fù)合物對(duì)肉雞腸道屏障功能及炎癥反應(yīng)的影響［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2021，48（11）：4014-4024.

WEI Q，WEI Z Y，WANG K W，et al.Effects of plant essential oil-citric acid complex on intestinal barrier function and inflammatory response of broilers［J］.China Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine，2021，48（11）：4014-4024.（in Chinese）

［12］ DIERYCK I，DE BACKERE J，PAESHUYSE J.Effect of hatching system and prophylactic antibiotic use on serum levels of intestinal health biomarker diamine oxidase in broilers at an early age［J］.Animal，2022，16（4）：100493.

［13］ PARK J E，OH S H，CHA Y S.Lactobacillus brevis OPK-3 from kimchi prevents obesity and modulates the expression of adipogenic and pro-inflammatory genes in adipose tissue of diet-induced obese mice［J］.Nutrients，2020，12（3）：604.

［14］ WANG C H，GONG B，PENG D Q，et al.Agarwood extract mitigates alcoholic fatty liver in C57 mice via anti-oxidation and anti-inflammation［J］.Mol Med Rep，2023，28（5）：210.

［15］ ZHAO Z L，XU X G，CHANG Y C，et al.Protective effect of mussel polysaccharide on cyclophosphamide-induced intestinal oxidative stress injury via Nrf2-Keap1 signaling pathway［J］.Food Sci Nutr，2023，11（7）：4233-4245.

［16］ SANTOS E V，F(xiàn)ONTES D O，BENFATO M D S，et al.Mycotoxin deactivator improves performance，antioxidant status，and reduces oxidative stress in nursery pigs fed diets containing mycotoxins［J］.J Anim Sci，2021，99（10）：skab277.

［17］ MONTOYA T，APARICIO-SOTO M，CASTEJN M L，et al.Peracetylated hydroxytyrosol，a new hydroxytyrosol derivate，attenuates LPS-induced inflammatory response in murine peritoneal macrophages via regulation of non-canonical inflammasome，Nrf2/HO1 and JAK/STAT signaling pathways［J］.J Nutr Biochem，2018，57：110-120.

［18］ 黃思琪，曲紅焱，黃大鵬，等.L-精氨酸對(duì)冷應(yīng)激仔豬生長(zhǎng)性能、免疫功能及肝臟、腎臟中腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ基因表達(dá)量的影響［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2019，31（1）：131-139.

HUANG S Q，QU H Y，HUANG D P，et al.Effects of L-arginine on growth performance，immune function and genes expression levels of tumor necrosis factor-α and interferon-γ in liver and kidney of cold-stressed piglets［J］.Chinese Journal of Animal Nutrition，2019，31（1）：131-139.（in Chinese）

［19］ 劉 穎，田 旭，馮曉夢(mèng)，等.黃芪多糖對(duì)腸炎雛雞小腸黏膜損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2023，50（1）：76-85.

LIU Y，TIAN X，F(xiàn)ENG X M，et al.Protective effect of Astragalus polysaccharide on intestinal mucosal injury in chicks with enteritis［J］.China Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine，2023，50（1）：76-85.（in Chinese）

［20］ TACKE F，WEISKIRCHEN R.Non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）/non-alcoholic steatohepatitis （NASH）-related liver fibrosis：mechanisms，treatment and prevention［J］.Ann Transl Med，2021，9（8）：729.

［21］ CHANG S Y，LEE J H，OH H J，et al.Effect of different ratios of phytogenic feed additives on growth performance，nutrient digestibility，intestinal barrier integrity，and immune response in weaned pigs challenged with a pathogenic Escherichia Coli［J］.J Anim Sci，2023，101：skad148.

［22］ XUN W J，F(xiàn)U Q Y，SHI L G，et al.Resveratrol protects intestinal integrity，alleviates intestinal inflammation and oxidative stress by modulating AhR/Nrf2 pathways in weaned piglets challenged with diquat［J］.Int Immunopharmacol，2021，99：107989.

［23］ 楊國(guó)峰，賀佳儀，狄 斌，等.復(fù)合酸化劑對(duì)伊拉兔空腸消化酶活性、免疫功能和緊密連接蛋白表達(dá)的影響［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2023，35（3）：1948-1956.

YANG G F，HE J Y，DI B，et al.Effects of compound acidifier on digestive enzyme activity，immune function and tight junction protein expression in jejunum of Ira rabbits［J］.Chinese Journal of Animal Nutrition，2023，35（3）：1948-1956.（in Chinese）

［24］ CHU T J，YU R Y，GU Y P，et al.Kaempferol protects gut-vascular barrier from high glucose-induced disorder via NF-κB pathway［J］.J Nutr Biochem，2024，123：109496.

［25］ BECKER S L，LI Q Y，BURROUGH E R，et al.Effects of an F18 enterotoxigenic Escherichia coli challenge on growth performance，immunological status，and gastrointestinal structure of weaned pigs and the potential protective effect of direct-fed microbial blends［J］.J Anim Sci，2020，98（5）：skaa113.

［26］ WANG L，HE C Q.Nrf2-mediated anti-inflammatory polarization of macrophages as therapeutic targets for osteoarthritis［J］.Front Immunol，2022，13：967193.

［27］ BELLAVER B，SOUZA D G，SOUZA D O，et al.Hippocampal astrocyte cultures from adult and aged rats reproduce changes in glial functionality observed in the aging brain［J］.Mol Neurobiol，2017，54（4）：2969-2985.

［28］ CHEN C J，HAN X，WANG G，et al.Nrf2 deficiency aggravates the kidney injury induced by subacute cadmium exposure in mice［J］.Arch Toxicol，2021，95（3）：883-893.

［29］ GUL S，ATTAULLAH S，ALSUGOOR M H，et al.Folicitin abrogates scopolamine induced hyperlipidemia and oxidative stress mediated neuronal synapse and memory dysfunction in mice［J］.Heliyon，2023，9（6）：e16930.

［30］ LI J J，DAI W Q，MO W H，et al.Fucoidan ameliorates ferroptosis in ischemia-reperfusion-induced liver injury through Nrf2/HO-1/GPX4 activation［J］.J Clin Transl Hepatol，2023，11（6）：1341-1354.

［31］ PRAKASH A N，PRASAD N，PUPPALA E R，et al.Loganic acid protects against ulcerative colitis by inhibiting TLR4/NF-κB mediated inflammation and activating the SIRT1/Nrf2 anti-oxidant responses in-vitro and in-vivo［J］.Int Immunopharmacol，2023，122：110585.

［32］ TANG X P，XIONG K N，LI M J.Effects of dietary epidermal growth factor supplementation on liver antioxidant capacity of piglets with intrauterine growth retardation［J］.J Anim Sci，2023，101：skad323.

［33］ EL-BAZ A M，KHODIR A E，ADEL EL-SOKKARY M M，et al.The protective effect of Lactobacillus versus 5-aminosalicylic acid in ulcerative colitis model by modulation of gut microbiota and Nrf2/HO-1 pathway［J］.Life Sci，2020，256：117927.

（編輯 范子娟）