代謝性疾病易感豬皮下脂肪功能障礙分子病理機(jī)制解析

摘 要： 旨在了解代謝性疾病易感豬皮下脂肪功能障礙的分子病理機(jī)制，探究皮下脂肪組織能量代謝紊亂與表觀調(diào)控的相關(guān)性。本研究選用體重相近、健康狀況良好的6月齡野生型雄性巴馬豬個體及轉(zhuǎn)基因制備的代謝性疾病易感豬，經(jīng)高脂高糖飲食（high-fat high-sugar diet，HFHSD）誘導(dǎo)3個月或12個月后，將其分為4組，分別為飲食誘導(dǎo)3個月的野生型組（WT-3，n=5）、飲食誘導(dǎo)12個月的野生型組（WT-12，n=5）、飲食誘導(dǎo)3個月的轉(zhuǎn)基因組（TG-3，n=8）和飲食誘導(dǎo)12個月的轉(zhuǎn)基因組（TG-12，n=4）。首先對試驗動物進(jìn)行血清學(xué)評價，檢測甘油三酯、游離脂肪酸、瘦素和脂聯(lián)素濃度；然后對試驗動物進(jìn)行組織學(xué)病理評價，并且通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得代謝紊亂的分子特征及富集的信號通路；隨后通過qPCR、蛋白免疫印跡（Western blot，WB）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）對關(guān)鍵基因、代謝物及表觀修飾進(jìn)行檢測。血清生化測定結(jié)果及病理組織學(xué)評價表明，轉(zhuǎn)基因及飲食誘導(dǎo)均能引起脂肪組織功能障礙，轉(zhuǎn)基因聯(lián)合飲食誘導(dǎo)組的病理損傷更嚴(yán)重；轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，脂肪組織功能障礙典型的特征是線粒體氧化磷酸化功能受損，脂肪組織糖脂代謝和蛋白質(zhì)合成等功能下降；qPCR結(jié)果顯示，TG-12組中線粒體編碼的基因表達(dá)顯著下調(diào)；WB結(jié)果顯示，TG-12組中調(diào)節(jié)糖脂代謝的關(guān)鍵基因ACLY、ACSS2和FASN顯著下調(diào)；ELISA結(jié)果顯示，關(guān)鍵的中間代謝物乙酰輔酶A含量降低；且經(jīng)WB驗證，在基因表達(dá)中具有廣泛調(diào)控作用的組蛋白乙?；浇档停赡苁侵竟δ苷系K的主要原因。利用代謝性疾病易感豬揭示了皮下脂肪線粒體功能降低通過下調(diào)乙酰輔酶A含量及組蛋白乙酰化水平，經(jīng)表觀修飾發(fā)揮廣泛的基因表達(dá)抑制作用，為人類肥胖相關(guān)皮下功能障礙疾病治療提供了模型和參考數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞： 轉(zhuǎn)基因豬；皮下脂肪組織；轉(zhuǎn)錄組；線粒體；組蛋白乙酰化

中圖分類號：S852.21

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-4938-12

收稿日期：2024-04-16

基金項目：國家自然科學(xué)基金（32070535）；國家重點研發(fā)計劃（2021YFA0805903）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS05）

作者簡介：徐 塽（1997-），女，河南信陽人，碩士生，主要從事糖尿病動物模型研究，E-mail：xushuangjlu@163.com

*通信作者：楊述林，主要從事小型豬2型糖尿病模型研究與應(yīng)用，E-mail：yangshulin@caas.cn

Molecular Pathological Mechanisms of Subcutaneous Fat Dysfunction in Metabolic Disease Susceptible Pigs

XU" Shuang， DU" Juan， ZHANG" Kaiyi， MIAO" Jiakun， YANG" Yu， WANG "Yanfang， YANG" Shulin*

（State Key Laboratory of Animal Biotech Breeding， Institute of Animal Science， Chinese Academy

of Agricultural Sciences， Beijing 100193，" China）

Abstract： The aim of this study was to understand the molecular pathological mechanisms of subcutaneous adipose dysfunction in pigs susceptible to metabolic diseases， and to investigate the correlation between disturbances of energy metabolism in subcutaneous adipose tissue and epigenetic regulation. The study selected wild-type male Bama pigs with similar weight and good health at 6 months old， as well as transgenic pigs susceptible to metabolic diseases， and divided them into 4 groups after being induced by a high-fat high-sugar diet （HFHSD） for 3 or 12 months. The wild-type groups were named WT-3 （n=5） and WT-12 （n=5）， while the transgenic groups were named TG-3 （n=8） and TG-12 （n=4）. Firstly， the animals were evaluated by serum biochemistry， containing the concentrations of triglycerides， free fatty acids， leptin， and adiponectin. Then， the animals were subjected to histopathological evaluation， and molecular features and enriched signaling pathways of metabolic disorders were obtained through transcriptome sequencing. Subsequently， key genes， metabolites， and epigenetic modifications were detected using qPCR， Western blot， and ELISA. The results of serum biochemical assay and histopathological evaluation showed that both transgenic and diet induction could cause adipose tissue dysfunction， and the pathological injury of transgenic combined diet induction group was more serious. Transcriptome sequencing results showed that adipose tissue dysfunction was characterized by impaired mitochondrial oxidative phosphorylation and decreased glucose and lipid metabolism and protein synthesis in adipose tissue. qPCR results showed that the expression of mitochondria-encoded genes was significantly down-regulated in TG-12 group. WB results showed that the key genes regulating glucose and lipid metabolism， ACLY， ACSS2 and FASN， were significantly down-regulated in TG-12 group. ELISA results showed that the content of acetyl-coA， the key intermediate metabolite， was decreased. Moreover， WB verified that the reduction of histone acetylation， which has a wide regulatory role in gene expression， may be the main cause of adipose dysfunction. The use of metabolic disease susceptible pigs reveals that reduced subcutaneous adipose mitochondrial function exerts extensive gene expression inhibitory effects through down-regulation of acetyl coenzyme A content and histone acetylation levels via epigenetic modification， providing a model and reference data for the treatment of obesity-associated subcutaneous dysfunction diseases in humans.

Key words： transgenic pig; subcutaneous adipose tissue; RNA-Seq; mitochondria; histone acetylation

*Corresponding author：YANG Shulin， E-mail：yangshulin@caas.cn

肥胖是一種全球性流行病，與之相伴的代謝綜合征、代謝紊亂相關(guān)脂肪性肝病、2型糖尿病和心血管疾病等已嚴(yán)重危害人類健康［1-2］。皮下脂肪功能障礙導(dǎo)致其儲脂能力下降，進(jìn)而異位沉積形成內(nèi)臟脂肪，并誘發(fā)多種代謝性疾?。?］，因此，解析皮下脂肪功能障礙的形成機(jī)制對代謝性疾病的防治具有重要意義。線粒體是脂肪細(xì)胞的能量中心，參與脂肪細(xì)胞許多關(guān)鍵代謝功能的調(diào)控，包括脂肪酸的合成和氧化以及維持細(xì)胞的甘油三酯平衡。脂肪細(xì)胞線粒體功能受損會引發(fā)代謝性疾病和肥胖相關(guān)疾?。?］。乙酰輔酶A是線粒體代謝反應(yīng)的中心產(chǎn)物，同時也是組蛋白乙酰化乙?；奈ㄒ还w［5］。研究表明，乙?；揎椡ㄟ^直接調(diào)控代謝酶從而參與糖脂代謝和氨基酸代謝等過程［6］。組蛋白的乙?；揎検潜碛^調(diào)控的重要組成部分［7］，廣泛參與細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)和代謝狀態(tài)的調(diào)節(jié)［8］。目前，關(guān)于能量代謝中間產(chǎn)物乙酰輔酶A通過表觀修飾導(dǎo)致皮下脂肪功能障礙的機(jī)制還不明確。

本課題組前期通過將人類代謝性疾病易感基因PNPLA3I148M、GIPRdn、hIAPP整合到豬基因組H11位點，建立了代謝性疾病易感模型豬。轉(zhuǎn)基因豬經(jīng)過短期HFHSD誘導(dǎo)后表現(xiàn)出糖耐量受損、胰腺脂肪細(xì)胞浸潤增加、肝臟和內(nèi)臟脂肪炎性細(xì)胞浸潤增加［9］。本研究以該模型豬為材料，進(jìn)一步增長其HFHSD誘導(dǎo)周期，旨在解析豬皮下脂肪組織代謝紊亂的分子特征和發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為人類代謝性疾病防治的臨床前研究提供有利參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

本研究所開展的動物試驗經(jīng)過中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所實驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)（批號：IAS2019-12）。本研究使用年齡和體重相近、健康狀況良好的6月齡雄性野生型巴馬豬（n=10）和轉(zhuǎn)基因豬（n=12）。這些豬均進(jìn)行單欄飼養(yǎng)，每天定時飼喂兩次，自由飲水。豬舍內(nèi)的溫度保持在16 ℃～28 ℃，相對濕度保持在40%～70%［10］，光照12 h，黑暗12 h。

試驗豬分為4組：經(jīng)HFHSD（37%蔗糖、10%豬油、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉和50.5%基礎(chǔ)料）處理3個月的WT-3（野生型，n=5）和TG-3（轉(zhuǎn)基因，n=8）組，以及HFHSD處理12個月的WT-12（n=5）和TG-12（n=4）組。采集前腔靜脈血進(jìn)行血清學(xué)檢測，動物安樂死后采集皮下脂肪組織（subcutaneous adipose tissue， SAT），迅速用4%多聚甲醛（P1110，Solarbio）固定用于組織病理分析，剩余組織放入液氮中儲存用于轉(zhuǎn)錄組及分子檢測。

1.2 血清學(xué)檢測

試驗豬禁食過夜后采集前腔靜脈血20 mL，迅速置于促凝管中。室溫靜置1 h后，4 ℃，3 000 r·min-1離心10 min，收集血清測定甘油三酯、游離脂肪酸、瘦素、脂聯(lián)素濃度。

1.3 組織病理學(xué)觀察

將固定后的組織用石蠟包埋并且連續(xù)切片，切"" 片經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色后采集圖像，隨機(jī)選取3個視野（20×），使用ImageJ軟件對脂肪細(xì)胞面積進(jìn)行統(tǒng)計。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序

Trizol（15596018，Invitrogen）提取SAT總RNA，測定RNA濃度并對其質(zhì)量進(jìn)行評估，合格后進(jìn)行后續(xù)測序試驗。本試驗委托廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行。

1.5 qPCR驗證

提取SAT總RNA，經(jīng)濃度測定、反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用TB Green Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（RR420A，TaKaRa）和ABI-Prism 7500序列檢測系統(tǒng)進(jìn)行qPCR檢測，內(nèi)參基因使用18S。

1.6 引物設(shè)計與合成

通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得目的基因mRNA的序列，使用NCBI-Primer BLAST設(shè)計引物。引物序列見表1。

1.7 Western blot

稱取0.3 g脂肪組織，使用蛋白裂解液（78510， Thermol fisher scientific）提取組織總蛋白，變性后進(jìn)行電泳，分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。封閉后孵育一抗，使用的抗體為ATP5A 1∶1 000（18023， CST）、ND5 1∶1 000（bs-3952R， Bioss）、COX1 1∶2 000（ab109025， abcam）、ACLY 1∶2 000（ab40793， abcam）、ACSS2 1∶2 000（ab133664， abcam）、FASN 1∶1 000（3180， CST）、Histone H3 1∶1 000（ab300641， abcam）、β-actin 1∶1 000（3700S， CST）。一抗孵育完成后孵育二抗，使用的二抗為Anti-rabbit IgG 1∶3 000（7074， CST）、Anti-mouse IgG 1∶3 000（7076S， CST）。

1.8 ELISA測定乙酰輔酶A

使用生工生物BBI酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒（D751001， BBI）測定脂肪組織中乙酰輔酶A的含量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行t-test分析，*表示Plt;0.05，**表示Plt;0.01。

2 結(jié) 果

2.1 血清生化指標(biāo)測定及病理組織學(xué)評價

試驗動物分別經(jīng)3個月及12個月的HFHSD誘導(dǎo)處理。如圖1A-D所示，與WT-3組相比，WT-12組豬的血清甘油三酯、游離脂肪酸和瘦素有升高趨勢，脂聯(lián)素有下調(diào)趨勢；TG-3組血清甘油三酯水平和游離脂肪酸略有升高，脂聯(lián)素略有下降，但均未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著差異水平（Pgt;0.05）。與TG-3組相比，TG-12組甘油三酯（Plt;0.01）、游離脂肪酸（Plt;0.01）和瘦素（Plt;0.05）顯著升高。與WT-3組相比，TG-12組的甘油三酯（Plt;0.05）和游離脂肪酸（Plt;0.01）顯著升高，脂聯(lián)素（Plt;0.05）顯著降低，表明TG-12組出現(xiàn)脂代謝紊亂的特征。進(jìn)一步的脂肪組織病理學(xué)分析顯示，飲食誘導(dǎo)使兩組動物脂肪細(xì)胞面積顯著增大（圖1E-F）。TG-12組比WT-12組脂肪細(xì)胞面積約有增大，但未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著差異水平（Pgt;0.05）。以上結(jié)果表明在長時間飲食誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)基因豬更容易出現(xiàn)脂肪因子分泌受損。

2.2 豬皮下脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因富集分析

為了解析轉(zhuǎn)基因豬SAT的分子機(jī)制，對WT-3（n=5）、WT-12（n=5）、TG-3（n=8）、TG-12（n=4）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。對組間差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行了KEGG富集分析（Fold changegt;1，Plt;0.05）（圖2）。結(jié)果表明，WT-12/WT-3組間差異表達(dá)基因富集到氧化磷酸化（OXPHOS）、三羧酸循環(huán)、產(chǎn)熱、AMPK信號通路、碳代謝、氨基酸的生物合成等代謝相關(guān)的通路；TG-12/TG-3組間差異表達(dá)基因富集到趨化因子信號通路、Fcγ R介導(dǎo)的吞噬作用、B細(xì)胞受體信號通路、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)等在內(nèi)的炎癥相關(guān)通路。TG-3/WT-3和TG-12/WT-12兩個比較組間的DEGs同樣富集到代謝和炎癥相關(guān)通路，但是差異不如WT-12/WT-3組及TG-12/TG-3組相比顯著，為此進(jìn)行了富集到能量代謝及炎癥通路的關(guān)鍵基因表達(dá)量差異比較。

2.3 高脂高糖飲食及轉(zhuǎn)基因?qū)ζは轮窘M織功能損傷的影響

飲食誘導(dǎo)差異基因KEGG通路富集分析顯示，WT-12/WT-3和TG-12/TG-3分別富集到能量代謝及炎癥相關(guān)的通路，為此利用基因集富集分析（GSEA）對其生物學(xué)通路特征進(jìn)行探究（圖3A-B）。結(jié)果顯示，與WT-3組相比，WT-12組在OXPHOS、果糖和甘露糖代謝、氨基酸的生物合成、三羧酸循環(huán)顯著下調(diào)。與TG-3組相比，TG-12組在造血細(xì)胞譜系、細(xì)胞凋亡、趨化因子信號通路、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、Fcγ R介導(dǎo)的吞噬作用、B細(xì)胞受體信號通路顯著上調(diào)。為深入了解轉(zhuǎn)基因?qū)@些通路的影響，篩選具有代表性的OXPHOS、趨化因子信號通路、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)信號通路的基因進(jìn)行表達(dá)量熱圖比較。在能量代謝方面，轉(zhuǎn)基因組TG-3在飲食誘導(dǎo)前核編碼的線粒體呼吸鏈基因已出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，飲食誘導(dǎo)后TG-12組進(jìn)一步下調(diào)（圖3C）；而轉(zhuǎn)基因組的炎性相關(guān)基因在飲食誘導(dǎo)前已出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，飲食誘導(dǎo)后上調(diào)程度更顯著（圖3D和E）。表明轉(zhuǎn)基因豬飲食誘導(dǎo)前皮下脂肪已出現(xiàn)能量代謝紊亂和慢性炎癥，長期飲食誘導(dǎo)后，脂肪組織功能障礙及炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加劇。然而，由于WT飲食誘導(dǎo)后也存在相同方向的病理損傷，使得TG-12/WT-12并未富集到更多的差異顯著信號通路。

2.4 轉(zhuǎn)基因豬經(jīng)長期高脂高糖飲食誘導(dǎo)后皮下脂肪線粒體損傷加劇

為全面展示轉(zhuǎn)基因豬經(jīng)長期HFHSD誘導(dǎo)對SAT的影響，將WT-12和TG-12同時與WT-3進(jìn)行了表達(dá)基因差異分析和GSEA富集分析。與WT-3相比，WT-12和TG-12組在OXPHOS、三羧酸循環(huán)、氨基酸的生物合成、果糖和甘露糖代謝通路的基因均顯著下調(diào)，且TG-12的富集程度及顯著性高于或與WT-12相當(dāng)，同時還富集到蛋白質(zhì)的消化和吸收、產(chǎn)熱通路，這是WT-12沒有富集到的（圖4A-B）。在代謝炎癥方面，與WT-3相比較，WT-12及TG-12均有GPNMB、PEA15和CTSS顯著上調(diào)，且TG-12上調(diào)的倍數(shù)更大，同時，TG-12中還發(fā)現(xiàn)NKG7、CD68、CTSD和CD209等慢性炎癥的標(biāo)志基因顯著上調(diào)（圖4C-D）。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因豬經(jīng)長期HFHSD誘導(dǎo)后能量代謝紊亂及慢性炎癥的特征更加明顯。

在進(jìn)一步的分析中，發(fā)現(xiàn)包括參與葡萄糖和果糖轉(zhuǎn)運(yùn)的基因SLC2A4、SLC2A5，乙酰乙酰輔酶A合成酶（AACS），乙酰輔酶A合成酶（ACLY），脂肪酸合成酶（FASN）在TG-12組下調(diào)程度均高于WT-12，表明線粒體中除OXPHOS外，三羧酸循環(huán)的底物來源也顯著下調(diào)（圖4C-D）。針對線粒體編碼的基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)WT-3、TG-3及WT-12三組間，組成呼吸鏈的13個基因組間差異均不顯著，而TG-12組全部顯著下調(diào)（圖4E）。有研究表明，在衰老和疾病人群中線粒體基因表達(dá)會發(fā)生改變［11］。綜合以上結(jié)果，飲食誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)基因均能引起能量代謝紊亂，早期階段是細(xì)胞核編碼的OXPHOS相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步損傷時，線粒體編碼的基因也表達(dá)下調(diào)，并伴隨著代謝性炎癥的加劇。

2.5 皮下脂肪組織中線粒體功能紊亂相關(guān)基因的表達(dá)驗證

為了驗證轉(zhuǎn)基因豬經(jīng)長期HFHSD誘導(dǎo)后更易引起線粒體功能損傷，在mRNA和蛋白水平分別對篩選出的與線粒體代謝有關(guān)的DEGs進(jìn)行驗證。qPCR結(jié)果顯示（圖5A），與WT-3組相比，TG-12組中包括NDUFA4（Plt;0.05）、NDUFA6（Plt;0.01）、NDUFB10（Plt;0.05）、COX6C（Plt;0.05）在內(nèi)的線粒體核編碼基因顯著下調(diào)；在蛋白水平上乙酰輔酶A合成酶ACLY、ACSS2表達(dá)顯著降低（Plt;0.01），且脂肪酸合成酶FASN表達(dá)顯著下調(diào)（Plt;0.01）（圖5D-E）。此外，發(fā)現(xiàn)在TG-12組中，線粒體核編碼基因ATP5A、mtDNA ND5和COX1的蛋白表達(dá)水平顯著降低（Plt;0.01）（圖5B-C）。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因豬經(jīng)長期HFHSD誘導(dǎo)后更易導(dǎo)致線粒體的形態(tài)和功能損傷以及脂代謝反應(yīng)障礙。

2.6 皮下脂肪組織中組蛋白乙酰化修飾水平的下降可能引起線粒體損傷

如前所述，發(fā)現(xiàn)與乙酰輔酶A生成相關(guān)基因ACLY、ACSS2以及以乙酰輔酶A為原料進(jìn)行的脂肪酸合成的相關(guān)基因FASN在TG-12組中顯著下調(diào)。為此，對SAT中乙酰輔酶A的含量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)乙酰輔酶A隨轉(zhuǎn)基因及飲食誘導(dǎo)效應(yīng)下調(diào)，在TG-12組中SAT中乙酰輔酶A的濃度下調(diào)達(dá)到顯著水平（Plt;0.05）（圖6A）。研究表明，乙酰輔酶A含量的改變會引起組蛋白乙?；揎椝桨l(fā)生改變［12］，進(jìn)而對基因的表觀調(diào)控水平產(chǎn)生影響。對4組動物的賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（KAT）和賴氨酸去乙?；福↘DAC）的表達(dá)量進(jìn)行比較顯示，所有的酶在組間均沒有顯著差異（圖6B），但組蛋白乙?；揎椝皆赥G-12組中顯著下調(diào)（Plt;0.05）（圖6C-D）。根據(jù)以上結(jié)果，認(rèn)為皮下脂肪組織能量代謝紊亂引起乙酰輔酶A濃度降低，從而引起組蛋白乙酰化修飾水平下降。組蛋白乙?；揎椏蓪χ窘M織產(chǎn)生廣泛的表觀調(diào)控，可能通過下調(diào)線粒體相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)一步加劇線粒體功能的損傷。

3 討 論

課題組前期研究表明，轉(zhuǎn)基因豬經(jīng)3個月短期HFHSD誘導(dǎo)表現(xiàn)出了代謝紊亂特征［9］，如糖耐量受損、胰腺脂肪細(xì)胞浸潤增加、肝臟和內(nèi)臟脂肪炎性細(xì)胞浸潤增加。為了進(jìn)一步加快模型豬的病理進(jìn)程，本研究對轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行了為期12個月的長期HFHSD誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)基因豬經(jīng)12個月長期HFHSD飲食誘導(dǎo)后，胰腺小葉間區(qū)域可以觀察到脂肪浸潤，小葉內(nèi)出現(xiàn)脂肪沉積［13］。血清學(xué)檢測結(jié)果顯示，與WT-3相比，WT-12組中血清甘油三酯、游離脂肪酸和瘦素有升高趨勢，脂聯(lián)素有下調(diào)趨勢，但統(tǒng)計學(xué)差異不顯著；然而TG-12組中血清甘油三酯、游離脂肪酸、瘦素水平顯著升高，脂聯(lián)素水平顯著降低。研究表明，血清甘油三酯水平的升高可能是引起代謝性疾病的直接原因［14-16］，同時血清中游離脂肪酸的積累會引起脂毒性，導(dǎo)致非脂肪細(xì)胞的功能障礙和死亡［17］。雖然瘦素的升高會增加能量的消耗，但是過多瘦素的積累可能導(dǎo)致高瘦素血癥，從而引起瘦素抵抗促進(jìn)肥胖的發(fā)展［18］。皮下脂肪是決定循環(huán)瘦素水平的主要因素，瘦素水平與能量儲存有關(guān)，因此肥胖時瘦素水平會增加［19］。隨著脂肪組織的增加，脂聯(lián)素水平會降低，脂聯(lián)素的減少與人類的胰島素抵抗、血脂異常和動脈粥樣硬化有關(guān)［20］。研究表明轉(zhuǎn)基因豬經(jīng)長期HFHSD誘導(dǎo)更易導(dǎo)致代謝紊亂。

線粒體數(shù)量和活性低被認(rèn)為是肥胖、2型糖尿病和代謝綜合征的潛在因素［21］。線粒體通過OXPHOS產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP），通過維持ATP的水平來促進(jìn)細(xì)胞平衡，這一過程發(fā)生障礙會導(dǎo)致病變［22］，肥胖通常與白色脂肪細(xì)胞線粒體的OXPHOS降低有關(guān)［23］。在獲得性肥胖中，SAT中的線粒體生物合成、氧化代謝途徑和OXPHOS蛋白被下調(diào)，并且在診斷的早期階段就與代謝障礙密切相關(guān)［24］。研究表明代謝紊亂患者的脂肪組織中線粒體相關(guān)通路和營養(yǎng)傳感通路下調(diào)，線粒體下調(diào)和炎癥上調(diào)可加速脂肪組織功能障礙［25-26］。轉(zhuǎn)基因豬經(jīng)長期HFHSD誘導(dǎo)后表現(xiàn)出與患者相似的病理分子特征，具體表現(xiàn)為OXPHOS、三羧酸循環(huán)、蛋白質(zhì)的消化和吸收等代謝相關(guān)通路顯著下調(diào)。乙酰輔酶A是線粒體代謝的中心產(chǎn)物，糖類、脂肪、蛋白質(zhì)氧化都會生成乙酰輔酶A［5］，乙酰輔酶A是脂肪酸合成和膽固醇合成的重要原料，同時是組蛋白乙?；阴；奈ㄒ还w［27］。細(xì)胞質(zhì)中組蛋白乙?；堑鞍踪|(zhì)表觀遺傳調(diào)控最常見的方式之一［5］。ACLY和ACSS2可促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中乙酰輔酶A生成，細(xì)胞質(zhì)乙酰輔酶A在KAT的作用下將乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白的賴氨酸殘基上促進(jìn)組蛋白發(fā)生乙?；揎?，KDAC的作用與之相反，以此來調(diào)控組蛋白乙?；揎椀乃剑?8］。本研究中，KAT和KDAC的表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異，與WT-3組相比，TG-12組的乙酰輔酶A濃度顯著降低，組蛋白乙酰化修飾水平顯著下降，而乙酰輔酶A是組蛋白乙酰化修飾的唯一底物，因此推測乙酰輔酶A的含量可以動態(tài)調(diào)控組蛋白乙?；揎椝?。

Lu和Tarnopolsky［29］的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)乙酰化可改變蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-DNA之間的相互作用，并調(diào)節(jié)與肥胖有關(guān)的酶或細(xì)胞因子的活性，從而參與代謝性疾病的發(fā)生和治療。組蛋白乙?；赏ㄟ^調(diào)控核編碼的基因表達(dá)來調(diào)控機(jī)體能量代謝過程［5］，本研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因豬經(jīng)長期HFHSD誘導(dǎo)后組蛋白乙?；揎椝斤@著下降，線粒體核編碼的基因顯著下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致SAT功能障礙。此外，蛋白質(zhì)乙?；揎椧矃⑴c肥胖的形成［30］，乙?；揎椏赡艹蔀榭刂品逝值挠行侄?。SAT中mtDNA的損耗是肥胖、胰島素抵抗、脂肪肝等疾病的特征［31］。本研究中，轉(zhuǎn)基因豬經(jīng)長期HFHSD誘導(dǎo)后mtDNA均顯著下調(diào)。研究表明，mtDNA的表達(dá)與線粒體自身的融合與裂解相關(guān)［32］，OPA1在線粒體內(nèi)膜的聚集和穩(wěn)定方面具有重要作用［33-34］，它可以恢復(fù)線粒體嵴的結(jié)構(gòu)、mtDNA豐度和能量效率［32］，OPA1的表達(dá)降低表明線粒體形態(tài)可能受損［35］進(jìn)而影響線粒體正常的生理功能。轉(zhuǎn)基因豬經(jīng)長期HFHSD誘導(dǎo)后OPA1表達(dá)有下調(diào)趨勢，推測這可能影響mtDNA的表達(dá)從而加劇線粒體損傷。

4 結(jié) 論

本研究主要通過比較HFHSD誘導(dǎo)后的野生型豬和轉(zhuǎn)基因豬的SAT病理變化以及對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，初步探討了脂肪組織代謝紊亂的病理特征和分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因豬對能量過剩的反應(yīng)更加敏感，TG-12組的脂肪細(xì)胞顯著增大，表現(xiàn)出與肥胖癥患者相似的病理表型；TG-12組轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果同時展現(xiàn)出脂肪組織炎癥和代謝功能障礙，線粒體功能出現(xiàn)損傷；脂肪組織代謝障礙減少細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A的含量，從而降低組蛋白乙?；揎椝剑唤M蛋白乙?；揎棸l(fā)揮表觀調(diào)控功能，從而調(diào)控基因的表達(dá)。

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（編輯 郭云雁）