間性豬垂體的全轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征分析

摘 要： 旨在探索間性豬垂體的編碼與非編碼RNAs的表達(dá)特征，為解析間性豬垂體功能紊亂的分子機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。以5月齡正常母豬和間性豬各3頭為研究對(duì)象，進(jìn)行血清激素檢測(cè)和垂體組織的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析鑒定間性豬垂體差異表達(dá)的mRNAs、lncRNAs、miRNAs，并構(gòu)建間性豬垂體中相關(guān)基因調(diào)控的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNAs（ceRNAs）。結(jié)果表明，間性豬血清激素分泌紊亂，垂體功能異常。與正常母豬對(duì)比，間性豬垂體差異表達(dá)的mRNAs有1 451個(gè)，差異表達(dá)的lncRNAs有277個(gè)，差異表達(dá)的miRNAs有17個(gè)。其中差異表達(dá)mRNAs主要富集在MAPK信號(hào)通路、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、PRL信號(hào)通路等生物通路上；ceRNAs網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，TCONS_00175477-novel_265-CCNB3、TCONS_00134726-novel_265-ZNF366和TCONS_00212783-novel_265-ZNF366競(jìng)爭(zhēng)組合可能與間性豬垂體激素分泌異常有關(guān)。綜上所述，本研究揭示了間性豬垂體mRNAs、lncRNAs和miRNAs差異表達(dá)并構(gòu)建ceRNAs，其特定lncRNA-miRNA-mRNA可能參與間性豬垂體的激素合成與分泌的調(diào)控，為解析間性豬垂體功能紊亂的分子機(jī)制提供了理論參考。

關(guān)鍵詞： 間性豬；垂體；全轉(zhuǎn)錄組；ceRNA；激素

中圖分類號(hào)：S828.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）11-4925-13

收稿日期：2024-04-28

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（32072699）；廣東省粵佛聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2020B1515120057）

作者簡(jiǎn)介：于聰穎（2001-），女，吉林靖宇人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：13415551629@163.com

*通信作者：于 輝，主要從事畜牧生產(chǎn)研究，E-mail： yu71hui@aliyun.com;李 華，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail： okhuali@fosu.edu.cn

Analysis of Whole Transcriptome Characteristics of the Hermaphroditic Pig’s Pituitary

Gland

YU" Congying， WU" Jinhua， ZHONG" Bingzhou， ZHAO" Haiquan， TAN" Shuwen， YU" Hui*， LI" Hua*

（Guangdong Provincial Key Laboratory of Animal Molecular Design and Precision Breeding， Foshan University，

Foshan 528225，" China）

Abstract：" The aim of this study was to explore the expression characteristics of coding and non-coding RNAs in the pituitary gland of hermaphroditic pigs， thereby providing supporting data for the analysis of the molecular mechanisms underlying pituitary dysfunction in these pigs. Three five-month-old normal sows and three hermaphroditic pigs were used for the study. Serum hormone assays and whole transcriptome sequencing of pituitary tissues were carried out to analyze and identify differentially expressed mRNAs， lncRNAs， and miRNAs in the pituitary of hermaphroditic pigs. Additionally， a competing endogenous RNA （ceRNA） network was established to elucidate the regulatory relationships of related genes in the pituitary of hermaphroditic pigs. Disrupted serum hormone secretion and abnormal pituitary function were observed in hermaphroditic pigs. Comparison with normal sows， 1 451 differentially expressed mRNAs， 277 differentially expressed lncRNAs， and 17 differentially expressed miRNAs were identified in the pituitary gland of hermaphroditic pigs， which were enriched in biological pathways， such as the MAPK signaling pathway， the progesterone-mediated oocyte maturation， and the PRL signaling pathway. Through the analysis of the ceRNA network， competitive combinations of TCONS_00175477-novel_265-CCNB3， TCONS_00134726-novel_265-ZNF366 and TCONS_00212783-novel_265-ZNF366 were identified possibly related to abnormal pituitary hormone secretion in hermaphroditic pigs. In summary， the differentially expressed mRNAs， lncRNAs and miRNAs in the pituitary gland of hermaphroditic pigs were revealed， thereby ceRNA networks were constructed， which may be involved in regulating hormone synthesis and secretion in this study. All these were aid to support the elucidation of the molecular mechanisms underlying the dysfunction of the pituitary gland in hermaphroditic pigs.

Key words： hermaphroditic pigs; pituitary; whole transcriptome; ceRNA; hormones

*Corresponding authors：YU Hui， E-mail： yu71hui@aliyun.com;LI Hua， E-mail： okhuali@fosu.edu.cn

性別發(fā)育異常（disorders of sex development，DSD）是一組先天性疾病，其呈現(xiàn)出染色體、性腺或解剖的性別不典型［1］。間性豬又稱為38，XX-DSD（SRY-），擁有正常雌性染色體結(jié)構(gòu)，不含有雄性性別決定基因（sex determining region Y，SRY）［2］。間性豬生殖器官發(fā)育畸形，繁殖力低，死亡率高，限制了優(yōu)質(zhì)種豬的培育，給畜牧業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［3］。內(nèi)分泌系統(tǒng)下丘腦-垂體-性腺軸在哺乳動(dòng)物的生殖發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［4］，其合成分泌的各種生殖激素介導(dǎo)生殖器官的分化和成熟，其中垂體是該軸中承上啟下的內(nèi)分泌腺體，其分泌的催乳素（prolactin，PRL）、促卵泡素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）和促黃體素（luteinizing hormone，LH）在生殖發(fā)育中發(fā)揮著不可缺少的作用［5-6］。激素水平是診斷DSD的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樗ǔＥc激素分泌紊亂有關(guān)。間性豬的孕酮（progesterone，P）水平顯著高于正常母豬，達(dá)到5～90倍［7］，睪酮（testosterone，TE）和雌二醇（estradiol，E2）水平均介于正常公、母豬之間，同時(shí)間性豬睪丸或卵泡中產(chǎn)生的雄烯酮可影響肉質(zhì)［8］。課題組前期通過(guò)透射電鏡觀察到5月齡間性豬垂體中促性腺激素細(xì)胞和催乳素細(xì)胞分泌顆粒增多，分泌顆粒電子密度大［9］，揭示間性豬垂體的結(jié)構(gòu)功能異常，但具體分子機(jī)制尚不明確。

非編碼RNA（ncRNAs）可以影響調(diào)節(jié)性別決定和性腺發(fā)育基因的表達(dá)和功能［10］，如非編碼RNA PISRT1（PIS regulated transcript number1）是一種抗睪丸因子，可抑制睪丸分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子SOX9［11］，也有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SM2可作為ceRNA，通過(guò)靶向Oar-miR-16b/TGF-β/SMAD2信號(hào)通路從而在湖羊垂體前葉調(diào)控促性腺激素的分泌［12］；在卵巢分化過(guò)程中miR-124抑制XX性腺SOX9基因的表達(dá)［13］，He等［14］研究發(fā)現(xiàn)miR-7通過(guò)與靶基因RAF1作用，介導(dǎo)GnRH和雌激素對(duì)促性腺激素的調(diào)節(jié)作用。此外，不同的蛋白質(zhì)編碼RNA（mRNA）和ncRNAs之間的相互作用也在各個(gè)生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如癌癥進(jìn)展［15］、卵巢功能［16］和下丘腦-垂體-性腺軸功能［17］。

因此，本研究通過(guò)對(duì)間性豬和正常母豬的垂體進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鑒定垂體中差異表達(dá)的mRNAs、lncRNAs和miRNAs，進(jìn)一步分析差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能并構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)，為揭示間性豬垂體功能異常的分子調(diào)控機(jī)制提供重要基礎(chǔ)，為動(dòng)物DSD等相關(guān)疾病研究提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集

本試驗(yàn)選取廣東某豬場(chǎng)5月齡約克夏豬的正常母豬3頭（Female，F(xiàn)M1、FM2、FM3）和38， XX-DSD（SRY-）的間性豬3頭（XX-DSD1、XX-DSD2、XX-DSD3）為試驗(yàn)動(dòng)物。外生殖器檢查后，通過(guò)引物（SRY-F：TGAAAGCGGACGATTACAGC， SRY-R：GGCTTTCTGTTCCTGAGCAC）進(jìn)行SRY檢測(cè)（500 bp）和核型分析。屠宰后采集垂體組織樣品，裝入無(wú)RNA酶凍存管中并迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 激素檢測(cè)

取正常母豬以及間性豬血樣并分離血清，利用放射免疫法檢測(cè)TE、E2、LH、FSH、P和PRL。

1.3 RNA提取、cDNA文庫(kù)構(gòu)建和Illumina測(cè)序

使用TRIzol試劑（Invitrogen，USA）分別提取6個(gè)樣品RNA，經(jīng)測(cè)定的RNA提取質(zhì)量合格，分別用于RNA文庫(kù)構(gòu)建。使用the epicenter Ribo-zero TM rRNA Removal Kit （Epicenter， USA）從每個(gè)樣品中去除核糖體RNA（Ribosomal， rRNA）。根據(jù)制造商的推薦，使用the NEBNext UltraTM Directional RNA Library Prep Kit for Illumina （NEB， USA）制備cDNA文庫(kù)。對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)在Illumina HiSeq2500平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序，得到raw reads。

1.4 垂體組織差異mRNAs、lncRNAs、miRNAs篩選

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制后得到clean reads，使用HTSeq（v0.6.0）、DESeq2軟件對(duì)正常母豬（FM）垂體與間性豬（XX-DSD）垂體的表達(dá)基因進(jìn)行兩兩比較，進(jìn)行l(wèi)ncRNAs、mRNAs表達(dá)定量和差異表達(dá)篩選（log2FoldChange（FC）≥1且 P＜0.05）。miRDeeP2量化器模塊用于量化已知和新型miRNA的表達(dá)和檢索計(jì)數(shù)。miRNA的表達(dá)水平通過(guò)百萬(wàn)轉(zhuǎn)錄物（TPM）進(jìn)行表達(dá)量歸一處理后，對(duì)各樣本進(jìn)行TPM密度分布統(tǒng)計(jì)，使用DESeq2軟件對(duì)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行篩選（log2FoldChange（FC）≥1且 P＜0.05）。

1.5 差異mRNAs的功能分析

為更好了解XX-DSD垂體中mRNAs的功能，本研究將兩個(gè)比較組 （FM vs. XX-DSD）的差異mRNAs分別做了GO（Gene Ontology）、KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）分析，GO與KEGG分析均采用clusterProfiler R包完成，篩選顯著富集結(jié)果（P＜0.05）。GO富集分為生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能3個(gè)部分；KEGG富集選取最顯著的20個(gè)KEGG通路繪制柱狀圖進(jìn)行分析。

1.6 ceRNA互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖的繪制

lncRNA不僅可以通過(guò)直接與靶基因結(jié)合或者共表達(dá)調(diào)控靶基因，也可以作為ceRNA與miRNA結(jié)合，參與靶基因的表達(dá)調(diào)控。因此，運(yùn)用miRanda預(yù)測(cè)lncRNA和mRNA上的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)COR篩選出miRNA-lncRNA和miRNA-mRNA對(duì)（COR＜-0.5， P＜0.05），而共表達(dá)的lncRNA-mRNA對(duì)則以COR＞0.99、P＜0.05標(biāo)準(zhǔn)篩選。通過(guò)分別整合miRNA-lncRNA、miRNA-mRNA和lncRNA-mRNA，獲得的miRNA-mRNA-lncRNA作為一個(gè)共競(jìng)爭(zhēng)表達(dá)三聯(lián)體（co-expression competing triplet）。運(yùn)用Cytoscape 3.7.1繪制miRNA-mRNA-lncRNA的網(wǎng)絡(luò)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果

為了進(jìn)一步保證測(cè)序結(jié)果的可靠性，對(duì)隨機(jī)挑選的4個(gè)mRNAs、4個(gè)lncRNAs和4個(gè)miRNAs進(jìn)行qRT-PCR分析。樣品RNA提取與“1.2”相同，采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）試劑盒去除基因組DNA并合成cDNA，按照TB Green Premix Ex TaqTM II試劑盒指示在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)集。相對(duì)表達(dá)量結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算得到。mRNAs和lncRNAs定量檢測(cè)以GAPDH為內(nèi)參，miRNAs定量檢測(cè)以U6作為內(nèi)參（表1）。

2 結(jié) 果

2.1 間性豬SRY基因的檢測(cè)

正常公豬（male）DNA能檢測(cè)出SRY基因，而母豬（FM）和間性豬（DSD）未檢測(cè)到SRY基因，表明間性豬不含SRY基因（圖1）。

2.2 間性豬性激素水平檢測(cè)

由圖2可見(jiàn)，XX-DSD血清中的TE含量處于正常公豬與正常母豬之間，而XX-DSD血清中的E2含量則與TE相反；XX-DSD血清中LH、FSH、PRL和P含量均高于正常豬。

2.3 間性豬和母豬垂體組織全轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析

DESeq2分析結(jié)果顯示，以正常母豬垂體為對(duì)照，間性豬垂體差異表達(dá)mRNAs有1 451個(gè)，其中528個(gè)上調(diào)，923個(gè)下調(diào)（圖3A）；差異表達(dá)lncRNAs有277個(gè)，其中117個(gè)上調(diào)，160個(gè)下調(diào)（圖3B）；差異表達(dá)miRNAs有17個(gè)，其中4個(gè)上調(diào)，13個(gè)下調(diào)（圖3C）。

2.4 DSD差異mRNAs功能富集分析

2.4.1 差異mRNAs的富集分析

對(duì)差異mRNAs進(jìn)行GO（圖4A）和KEGG（圖4B）富集分析。GO結(jié)果顯示，基因顯著富集于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、生物調(diào)控等264個(gè)通路上（P＜0.05）。KEGG結(jié)果顯示，差異mRNAs富集到68個(gè)KEGG通路中，并篩選出富集于MAPK信號(hào)通路、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、PRL信號(hào)通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂通路中的DEMs共49個(gè)，其中MAPK12為4個(gè)通路共同表達(dá)的基因。

2.4.2 差異mRNAs的PPI分析

整合GO和KEGG結(jié)果，以候選mRNAs制作蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（protein-protein interaction，PPI），如圖4C所示，同時(shí)篩選出3個(gè)與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的關(guān)鍵候選基因，分別為絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、上皮生長(zhǎng)因子基因（epidermal growth factor，EGF）、腫瘤壞死因子基因（tumour necrosis factor，TNF）（表2）。

2.5 ceRNA互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

本研究首先篩選出垂體277個(gè)lncRNAs上下游100 kb的差異表達(dá)基因。lncRNAs可與miRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，解除miRNA對(duì)靶基因的抑制。選擇共表達(dá)且符合篩選條件的miRNAs-mRNAs（圖5A）、miRNAs-lncRNAs（圖5B）和miRNAs-lncRNAs（圖5C）。首先，構(gòu)建了差異mRNAs和lncRNAs的互作網(wǎng)絡(luò)圖如圖6A所示，垂體篩選出11對(duì)mRNAs-lncRNAs，包含了mRNAs和lncRNAs各11個(gè)，僅TCONS_00042157-MPP7表現(xiàn)為負(fù)調(diào)控，其余均為正調(diào)。值得注意的是，STAT1參與垂體PRL信號(hào)通路，TCONS_00128067-STAT1能參與間性豬垂體PRL的合成與分泌。同時(shí)對(duì)lncRNAs（圖6B）和miRNAs（圖6C）預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行KEGG分析，發(fā)現(xiàn)在cAMP信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和雌激素信號(hào)通路等與垂體合成或分泌直接有關(guān)的信號(hào)通路。進(jìn)一步地，整合上述數(shù)據(jù)，篩選競(jìng)爭(zhēng)性共表達(dá)triplets，并以之建立ceRNA網(wǎng)絡(luò)。在FM和XX-DSD組中只篩選出26個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性共表達(dá)triplets。

如圖6D所示，構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)僅包含1個(gè)miRNA、21個(gè)mRNAs和11個(gè)lncRNAs。GO分析發(fā)現(xiàn)，CCNB3和ZNF366與激素結(jié)合、減數(shù)分裂調(diào)節(jié)相關(guān)。

2.6 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的qRT-PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)FM和XX-DSD垂體全轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)譜中隨機(jī)選擇的4個(gè)mRNAs（圖7A）、4個(gè)miRNAs（圖7B）和4個(gè)lncRNAs（圖7C）進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，所選擇的編碼RNA的qRT-PCR結(jié)果與全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相近，表明本研究的測(cè)序數(shù)據(jù)具較高準(zhǔn)確性。

3 討 論

性腺發(fā)育是實(shí)現(xiàn)生殖能力的關(guān)鍵步驟，多個(gè)基因參與其過(guò)程。性別發(fā)育異常（DSD）是一種先天性疾?。?8］，導(dǎo)致生殖器官發(fā)育畸形，影響了生殖功能。研究表明在WT1的ZF4域發(fā)現(xiàn)的突變是46，XX-DSD （SRY-）的發(fā)病原因之一［19］。在46，XX中，腎上腺類固醇生成障礙是生殖器異常的常見(jiàn)原因［20］。激素紊亂是DSD中主要的臨床癥狀之一。

下丘腦-垂體-性腺軸（hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA）是控制性腺發(fā)育和性激素合成的主要內(nèi)分泌系統(tǒng)［21］，在人類和豬中，HPGA的異?？赡軐?dǎo)致性發(fā)育和生殖功能的異常［22］。課題組前期針對(duì)間性豬下丘腦的研究顯示，激素受體基因ESR1、前列腺素F受體（PTGFR）、促甲狀腺激素受體（TSHR）、孕激素受體（PGR）顯著上調(diào)，XX-DSD內(nèi)分泌系統(tǒng)已經(jīng)失常［22］。在本研究中，XX-DSD血清LH和FSH水平均高于正常的雌性和雄性，進(jìn)一步說(shuō)明其性腺功能不全。FSH和LH分別由一個(gè)共有的α-亞基（αGSU）和一個(gè)獨(dú)特的β-亞基（FSHβ或LHβ）組成的糖蛋白二聚體［23］，其中αGSU由CGA基因編碼，β-亞基由FSHβ和LHβ基因編碼［24］。下丘腦通過(guò)控制垂體分泌的激素來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定［25］，下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）在垂體能通過(guò)激活一系列通路，包括cAMP信號(hào)通路、Calcineurin/NFAT（nuclear factor of activated T cells）信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路、CaMK II（calcium/calmodulin-dependent kinase II）信號(hào)等，促進(jìn)垂體CGA、FSHβ、LHβ基因的表達(dá)，從而合成和分泌LH和FSH［24］。此外，對(duì)差異表達(dá)的mRNAs進(jìn)行富集分析，這些mRNAs在細(xì)胞通訊、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等通路上表達(dá)，特別是在MAPK通路中，MAPK1/3、MAPK8/9、MAPK14基因的表達(dá)下調(diào)，可能涉及參與GnRH信號(hào)通路的傳遞［26-27］，參與誘導(dǎo)LHβ和αGSU的合成［28］。通過(guò)XX-DSD垂體中相關(guān)DEMs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出3個(gè)關(guān)鍵候選基因MAPK14、EGF和TNF，其表達(dá)量均下降。但是，Haisenleder等［29］研究指出，抑制MAPK14的表達(dá)對(duì)FSHβ和LHβ的表達(dá)以及促性腺激素的表達(dá)未產(chǎn)生顯著影響，而MAPK8/9則參與LHβ基因的調(diào)控［30］。在本研究中，MAPK9以及MAPK信號(hào)通路的基因多數(shù)為下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，但是LH含量仍然升高，這可能是由于LH和FSH的分泌受多種通路共同參與調(diào)控［31-32］。例如，近年越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，由腺苷酸環(huán)化酶激活肽基因（adenylate cyclase activating polypeptide 1，ADCYAP1）編碼的PACAP可以單獨(dú)或者與GnRH共同調(diào)節(jié)促性腺激素的分泌［33-35］，其在多個(gè)器官中表達(dá)，也可在GnRH和性腺激素的誘導(dǎo)下在促性腺激素細(xì)胞中合成［34，36］。PACAP可以增加促性腺激素亞基的啟動(dòng)子活性［37］，而PACAP受體1（ADCYAP1R1）則可以增強(qiáng)GnRH的調(diào)節(jié)作用［38］。ADCYAP1/ADCYAP1R1表達(dá)上調(diào)可能是造成GNRH誘發(fā)LH、FSH分泌異常升高的主要原因。

此外，TGFβ與垂體前葉功能的調(diào)節(jié)有關(guān)［39］。TGFβ3參與垂體前葉PRL細(xì)胞和Folliculo-stellate（FS）細(xì)胞之間相互作用［40］。FS細(xì)胞為非分泌細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞縫隙連接影響 PRL細(xì)胞的增殖和性腺釋放因子的釋放［41-42］。而TGFβ3 能通過(guò)促進(jìn)FS細(xì)胞堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor， bFGF）的分泌，增強(qiáng)細(xì)胞縫隙連接通訊［43］。而本研究發(fā)現(xiàn)， TGFβ3 表達(dá)量減少或?qū)⒏蓴_ FS細(xì)胞和 PRL細(xì)胞間的溝通，影響PRL細(xì)胞的增殖。盡管 XX-DSD垂體內(nèi) PRL的含量升高，但是 PRL信號(hào)通路表達(dá)量卻下降。在PRL通路中，酪氨酸蛋白激酶2基因（Janus kinase 2， JAK2）參與PRL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，是細(xì)胞凋亡途徑的起始激酶。當(dāng)JAK2 被抑制時(shí)，內(nèi)源性 PRL誘導(dǎo)的PRLR激活的效應(yīng)未被觀察到［44］。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族（signal transducer and activator of transcription， STAT）是PRL的重要傳感器，包括了STAT1、STAT3和STAT5a/b［45］。在XX-DSD垂體中JAK2、STAT1基因表達(dá)量明顯下降進(jìn)一步說(shuō)明PRL通路受到抑制。結(jié)合課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，XX-DSD垂體 PRL細(xì)胞較FM數(shù)量多，推測(cè)盡管TGFβ3表達(dá)量減少影響 PRL細(xì)胞的增殖，但PRL信號(hào)通路基因降低，使PRL細(xì)胞自噬減少，導(dǎo)致PRL的高分泌［9］。這些發(fā)現(xiàn)將JAK2、STAT1等基因可作為探索XX-DSD垂體功能異常的候選基因。

通過(guò)構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖，僅發(fā)現(xiàn)novel_265參與ceRNA的調(diào)控，TCONS_00175477-novel_265-CCNB3、TCONS_00134726-novel_265-ZNF366和TCONS_00212783-novel_ 265-ZNF366這3個(gè)競(jìng)爭(zhēng)組合與激素、細(xì)胞減數(shù)分裂相關(guān)。CCNB3與卵母細(xì)胞第二次減數(shù)分裂相關(guān)［46］。ZNF366是多種核受體的共調(diào)節(jié)因子［47-50］，可直接與DNA結(jié)合，從而介導(dǎo)參與多種生物過(guò)程的基因轉(zhuǎn)錄，如增殖、分化、代謝、繁殖［51-52］。ZNF366能抑制I類核受體（nuclear receptors，NRs）介導(dǎo)的基因表達(dá)，促進(jìn)II類NRs介導(dǎo)的基因表達(dá)［52］。研究指出，其鋅指區(qū)域能與ERα的鋅指區(qū)域（DNA binding domain，DBD）相互作用，召集抑制雌激素受體（estrogen receptor，ERα）表達(dá)的因子，如c末端結(jié)合蛋白（C-terminal binding protein，CtBP）、RIP140等，抑制ERα的活性，從而抑制雌激素反應(yīng)基因的表達(dá)［50］。在XX-DSD垂體中ZNF366的表達(dá)降低，然而ESR1的表達(dá)量也同樣降低。此外，其他ERα的共同抑制因子，如N-CoR［53］、LCoR［54］、CtBP［55］表達(dá)量同樣有所下降。在COS-1細(xì)胞中添加E2時(shí)，ERα活性提高，但是隨著ZNF366的轉(zhuǎn)染濃度升高，ERα活性100%消失［50］。結(jié)合本研究中的XX-DSD激素水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其E2水平較FM的低，推測(cè)激素水平的低下是造成ERα活性下降的首要因素［56-57］。

4 結(jié) 論

間性豬對(duì)生豬種業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重的影響，全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定出間性豬垂體中有1 451個(gè)mRNAs、17個(gè)miRNAs和277個(gè)lncRNAs，共鑒定了26個(gè)lncRNA-miRNA-mRNA共表達(dá)競(jìng)爭(zhēng)三聯(lián)體。其中TCONS_00175477-novel_265-CCNB3、TCONS_00134726-novel_265-ZNF366和TCONS_00212783-novel_ 265-ZNF366可能參與間性豬垂體的激素合成與分泌的調(diào)控。

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（編輯 郭云雁）