流式病毒檢測(cè)法的應(yīng)用進(jìn)展

摘 要： 流式病毒檢測(cè)法（flow virometry，F(xiàn)VM）是一種利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)單個(gè)病毒顆粒及其特征的前沿技術(shù)。通過(guò)FVM，可以精確測(cè)量樣本中完整病毒顆粒的濃度、表面靶抗原的豐富度以及相對(duì)直徑等關(guān)鍵參數(shù)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)病毒顆粒的高效分析和表征。隨著儀器設(shè)備、熒光染料和標(biāo)記策略的不斷發(fā)展和優(yōu)化，F(xiàn)VM得到了廣泛的應(yīng)用和研究。該方法不僅被用于實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)病毒顆粒的精確分析，還被用于細(xì)胞外泌體和微囊泡的檢測(cè)。本文總結(jié)了FVM的發(fā)展歷程以及病毒等微顆粒的常用標(biāo)記方法和應(yīng)用領(lǐng)域，旨在為FVM在病毒學(xué)、免疫學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考和借鑒。

關(guān)鍵詞： 流式病毒檢測(cè)法；流式細(xì)胞術(shù)；病毒和外泌體標(biāo)記

中圖分類號(hào)：R392-33;S859.797

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）11-4840-12

收稿日期：2023-12-11

基金項(xiàng)目：“十四五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1801105）；國(guó)家自然科學(xué)基金（32373026）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（2662023DKPY004）

作者簡(jiǎn)介：卿 霆（2000-），女，云南大理人，碩士生，主要從事畜禽獲得性免疫研究，E-mail：beining@webmail.hzau.edu.cn

*通信作者：司有輝，主要從事畜禽獲得性免疫研究，E-mail：youhui@mail.hzau.edu.cn；王秀羽，主要從事畜禽獲得性免疫研究，E-mail：Jony_WXYu@webmail.hzau.edu.cn

Application Progress in Flow Virometry

QING" Ting， OUYANG" Hehao， PAN" Qicong， ZHU" Bibo， YE" Jing， CAO" Shengbo， WANG" Xiuyu*， SI" Youhui*

（National Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Huazhong Agricultural University，

Wuhan 430070，" China）

Abstract：" Flow virometry （FVM） represents a cutting-edge technological approach leveraging flow cytometry for the precise detection and analysis of individual virus particles and their unique characteristics. This innovative method offers a novel means of detecting， quantifying， and characterizing individual virus particles. FVM enables the determination of various parameters including the concentration of intact virus particles， the abundance of specific target antigens present on the virus surface， and the relative diameter of the viruses. Within the field of technique， FVM extends beyond virus analysis， allowing for the effective detection and characterization of exosomes and microvesicles originating from cells. With the continuous development and optimization of instruments， fluorescent dyes and labeling strategies， FVM has been widely used and studied. This paper summarizes the development history of FVM， as well as the common labeling methods and application fields of viruses and other microparticles， aiming to provide reference for the further application of FVM in virology， immunology， biomedics and other research fields.

Key words： flow virometry; flow cytometry; virus and exosome labeling

*Corresponding authors：" SI Youhui， E-mail： youhui@mail.hzau.edu.cn; WANG Xiuyu， E-mail： Jony_WXYu@webmail.hzau.edu.cn

流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是基于流式細(xì)胞儀，通過(guò)檢測(cè)散射或偶聯(lián)的熒光信號(hào)從而快速、準(zhǔn)確、客觀、高通量地獲得懸浮微粒的一系列重要生物物理、生物化學(xué)相關(guān)特征性參量的技術(shù)［1］。其用途包括檢測(cè)單細(xì)胞、細(xì)胞群或細(xì)胞上的抗原［2］，通過(guò)使用分辨率更高、精確校正過(guò)的流式細(xì)胞儀，并將微粒進(jìn)行有效標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)領(lǐng)域的最新進(jìn)展已經(jīng)允許表征尺寸在100～1 000 nm的微粒，這些微粒可以是源自細(xì)胞的外泌體和微囊泡，也可以是小細(xì)菌或病毒［3］。因此，衍生出了運(yùn)用于單個(gè)病毒顆粒的定量分析和表征的流式細(xì)胞術(shù)，稱為流式病毒檢測(cè)法（flow virometry， FVM）。該方法于2013年由Arakelyan等［4］學(xué)者首次提出并命名，他們的研究也揭開(kāi)了流式細(xì)胞術(shù)運(yùn)用于病毒表征的序幕。與傳統(tǒng)的流式細(xì)胞染色程序類似，F(xiàn)VM通過(guò)目前可行的方法對(duì)病毒進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其發(fā)出的散射光或者熒光，進(jìn)而對(duì)目標(biāo)病毒進(jìn)行可視化分析，直觀地展示病毒顆粒的特征和表面抗原分布，實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)病毒顆粒的精確分析。

1 FVM的簡(jiǎn)介

FCM能快速、準(zhǔn)確、客觀、高通量地獲得懸浮微粒的一系列重要特征性參量，如數(shù)量、大小、表面抗原組成等［5］，其主要原理是激光束擊中在定向流體中移動(dòng)的懸浮顆粒，流式細(xì)胞儀會(huì)發(fā)出光散射和熒光信號(hào)，以這兩種光學(xué)信號(hào)分析出顆粒的一系列參數(shù)［6］。這一技術(shù)的產(chǎn)生和應(yīng)用，極大地促進(jìn)了微生物學(xué)、免疫學(xué)等的發(fā)展。當(dāng)單個(gè)顆粒被流式細(xì)胞儀的激光源照射時(shí)，設(shè)備可以采集到三種光信號(hào)，前向散射光（FSC）、側(cè)向散射光（SSC）和熒光信號(hào)。前向散射光與顆粒大小成比例，側(cè)向散射光與顆粒的形狀以及顆粒內(nèi)部的復(fù)雜性相關(guān)，熒光信號(hào)來(lái)源包括：1）顆粒中固有的熒光蛋白或熒光分子（如核黃素、細(xì)胞色素等）；2）通過(guò)基因工程構(gòu)建的熒光蛋白［7-8］；3）與微粒表面抗原特異連接的熒光抗體［5］；4）對(duì)顆粒成分進(jìn)行染色的熒光染料［9-13］。早期的流式細(xì)胞儀對(duì)檢測(cè)樣品的大小和類型有嚴(yán)格的要求，由于病毒顆粒大小通常在設(shè)備檢測(cè)閾值之下，且設(shè)備分辨率低、精度不高、背景噪聲干擾強(qiáng)、染料特異性和效果差等原因，無(wú)法檢測(cè)到病毒顆粒的相關(guān)特征參數(shù)。隨著FCM研究的深入，高分辨率流式細(xì)胞儀的開(kāi)發(fā)［14］、高效染色技術(shù)以及染料的研發(fā)、磁性納米顆粒和中等微球等支架的應(yīng)用［4，15］，使得FCM應(yīng)用于病毒表征成為可能，并在表征病毒的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)對(duì)外泌體、微囊泡等的檢測(cè)。

2 FVM的應(yīng)用領(lǐng)域

2.1 FVM應(yīng)用于病毒顆粒檢測(cè)

1979年Hercher等［14］設(shè)計(jì)了特制的流式細(xì)胞儀，能夠根據(jù)光的散射譜從背景噪聲或呼腸孤病毒（60～80 nm）種群中清晰地檢測(cè)到T2噬菌體（60 nm頭部和120 nm尾部）。1998年，Marie等［10］使用新型核酸染料SYBR Green-I標(biāo)記海洋噬菌體并運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析。隨著各項(xiàng)技術(shù)的進(jìn)步，流式細(xì)胞儀檢測(cè)病毒的范圍從較大的DNA病毒進(jìn)一步擴(kuò)展到桿狀病毒科、皰疹病毒科、藻狀病毒科、小核糖病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科和虹吸病毒科等不同科屬病毒［16］。2013年，Arakelyan等［4］首次命名了流式病毒檢測(cè)法，他們使用該技術(shù)對(duì)培養(yǎng)的HIV-1病毒顆粒上兩種抗原分布情況進(jìn)行了研究，實(shí)現(xiàn)病毒種群中顆粒異質(zhì)性水平的檢測(cè)。2014年Martínez等［17］基于FVM的原理，通過(guò)熒光激活分選和全基因組擴(kuò)展，集群了水樣中離散的病毒顆粒從而生成了富含dsDNA的病毒組。隨著FVM的改進(jìn)，越來(lái)越多研究人員使用該方法對(duì)各類病毒進(jìn)行分選、集群［4，12，15，18-19］，并將其運(yùn)用到臨床實(shí)踐中（第3節(jié)詳述）。2017年Arakelyan等［18］使用 15 nm 的磁性納米顆粒 （MNP）與識(shí)別革登病毒表面抗原的抗體偶聯(lián)對(duì)革登病毒進(jìn)行免疫捕獲，并將捕獲的病毒粒子與熒光抗體一起孵育，然后使用常規(guī)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，該研究提供了使用FVM來(lái)研究單個(gè)登革病毒粒子（DENV）的成熟示范。2017年Khalil等［20］使用流式細(xì)胞儀對(duì)培養(yǎng)的變形蟲(chóng)上清液進(jìn)行高通量分選，成功分離出具有活性的巨型病毒。小鼠白血病病毒 （MLV）作為逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究模型，對(duì)人類研究HIV具有重要意義，但人類對(duì)MLV的一些生物學(xué)信息仍然知之甚少，主要原因是樣品中存在可溶性病毒蛋白、有缺陷的病毒和細(xì)胞外囊泡的干擾，導(dǎo)致試驗(yàn)中研究人員難以對(duì)樣本中的完整MLV顆粒總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。2020年，Renner等［21］以病毒包膜糖蛋白（Env）和單分散光的散射特性作為完整病毒顆粒的鑒別參數(shù)，通過(guò)FVM分析了Moloney MLV（M-MLV）顆粒含有的病毒RNA基因組對(duì)，從而計(jì)算出完整病毒顆粒的感染率，該研究為廣泛研究的原型逆轉(zhuǎn)錄病毒（MLV）的特征提供了新的見(jiàn)解。2019年COVID-19爆發(fā)后，為了快速對(duì)群體進(jìn)行篩查，科學(xué)家們紛紛嘗試使用FVM對(duì)臨床樣品進(jìn)行高通量、快速分選。2020年Soni等［22］將采集的鼻拭子和咽拭子與特定的一抗孵育再用二抗與之作用從而使用FVM實(shí)現(xiàn)了對(duì)SARS-CoV-2的定性檢測(cè)。2022年，Hussain等［23］開(kāi)發(fā)出小型流式病毒檢測(cè)設(shè)備，能夠從患者唾液中直接快速且靈敏地檢測(cè)SARS-CoV-2。2022年，Abraham和Wood［24］利用FMV的優(yōu)勢(shì)，使用重組寨卡包膜（E）蛋白開(kāi)發(fā)了一種檢測(cè)寨卡病毒的方法，基于E蛋白的FVM能夠檢測(cè)來(lái)自寨卡病毒感染患者、寨卡病毒感染小鼠和重組寨卡E蛋白免疫小鼠的抗寨卡E蛋白的抗體。這是第一個(gè)可用于寨卡病毒檢測(cè)的基于FVM的診斷方法，其快速的檢測(cè)時(shí)間和較高的精確度可用于提高寨卡病毒檢測(cè)的準(zhǔn)確性，彌補(bǔ)了ELISA和RT-PCR不能滿足高通量篩選、不適合在病毒爆發(fā)期間對(duì)大量樣本進(jìn)行緊急篩選的缺點(diǎn)。2023年，在FVM的基礎(chǔ)上，Samman等［25］開(kāi)發(fā)了一種新型的磁性納米顆粒——MICaFVi，該納米顆粒能夠高通量且特異性地捕獲SARS-CoV-2。經(jīng)過(guò)數(shù)十年的發(fā)展，F(xiàn)VM已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多種病毒顆粒的特異性、高通量分選和表面抗原分析，極大地促進(jìn)了病毒學(xué)研究。

2.2 FVM應(yīng)用于外泌體和微囊泡檢測(cè)

外泌體和微囊泡是源自細(xì)胞的含有多種細(xì)胞成分的脂質(zhì)膜性囊泡［26］。研究表明，外泌體和囊泡廣泛參與機(jī)體諸多病理過(guò)程，如炎癥和腫瘤，參與許多病毒的復(fù)制和感染過(guò)程，如：HIV、HBV、HCV、SARS-CoV-2等［27］，同時(shí)還能影響機(jī)體的免疫應(yīng)答。

2011年，Nolte-‘T Hoen等［28］運(yùn)用流式細(xì)胞儀定量分析了源自細(xì)胞的微囊泡，并實(shí)現(xiàn)囊泡表面特異性蛋白的定性以及由不同方式激活的樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）產(chǎn)生的囊泡的分群。2012年van der Vlist 等［29］基于FVM原理，從混合樣本中識(shí)別出不同的囊泡亞群并分析了囊泡亞群的動(dòng)態(tài)變化。接下來(lái)，科研工作者們運(yùn)用更精密的流式細(xì)胞儀和更優(yōu)越的標(biāo)記方法實(shí)現(xiàn)了從血液、尿液等樣品中檢測(cè)納米級(jí)囊泡［30-31］。2017年，Arakelyan等［18］用FVM檢測(cè)登革病毒顆粒及釋放到血液中的囊泡，嘗試從病毒外泌體和微囊泡中分離病毒顆粒。新冠疫情爆發(fā)后，科研工作者發(fā)現(xiàn)外泌體疫苗在啟動(dòng)機(jī)體產(chǎn)生抵抗SARS-CoV-2的免疫保護(hù)發(fā)揮良好效應(yīng)［27］，但由于外泌體和微囊泡的直徑與病毒顆粒相當(dāng)［32］，而且多分離自血漿、組織液、腦脊液、細(xì)胞液等含有復(fù)雜成分的液體中，所以想要特異性地分離外泌體和微囊泡還需要排除這些液體中原有成分的干擾，分離難度巨大。目前，科研工作者正在探索參考FVM的標(biāo)準(zhǔn)以期實(shí)現(xiàn)外泌體等微顆粒的快速、高通量的分選。

2.3 FVM應(yīng)用于其他檢測(cè)

2019年Szczotka等［33］將PNA/FITC端粒探針與牛淋巴細(xì)胞和 1301 細(xì)胞系雜交，然后通過(guò)FVM進(jìn)行檢測(cè)，該研究表明，牛白血病病毒（BLV）感染牛的端粒熒光強(qiáng)度顯著低于健康牛，BLV陽(yáng)性牛細(xì)胞的相對(duì)端粒長(zhǎng)度（RTL）值（31.63±12.62）低于對(duì)照組的38.43±4.03，該研究展示了FVM可以通過(guò)測(cè)量端粒長(zhǎng)度來(lái)間接檢測(cè)牛的BLV感染。2020年Burnie等［34］通過(guò)流式細(xì)胞儀的光散射和熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)了對(duì)HIV-1假病毒顆粒的檢測(cè)和表面抗原的表征，定量了假病毒囊膜中的三種細(xì)胞蛋白（整合素α4β7、CD14和CD162/PSGL-1），表明除了α81β4、CD7和CD14/PSGL-162之外，還可以在HIV假病毒粒子的表面同時(shí)檢測(cè)到其他兩種抗原。研究人員還將FVM應(yīng)用在了疫苗質(zhì)量的監(jiān)測(cè)中［35-36］。2021年，為探究活疫苗生產(chǎn)和使用過(guò)程中病毒顆粒的畸形率，Ricci等［37］運(yùn)用FVM快速且高通量地監(jiān)測(cè)了默沙東埃博拉病毒疫苗（ERVEBO）中病毒粒子的畸形率，并得出疫苗效力與病毒畸形率的相關(guān)性，為活病毒疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量監(jiān)控提供了新方法。2022年，Prout等［38］應(yīng)用FVM來(lái)監(jiān)控由表達(dá)SARS-CoV-2 S蛋白的重組病毒載體生產(chǎn)的COVID-19候選疫苗。2023年Safford等［39］使用優(yōu)化的FVM檢測(cè)水樣品中的T4噬菌體和其他病毒以增強(qiáng)水質(zhì)監(jiān)測(cè)。隨著研究的深入，流式病毒檢測(cè)法應(yīng)用在了越來(lái)越多的領(lǐng)域，展示了其廣泛的應(yīng)用范圍和獨(dú)特的發(fā)展前景。

3 流式病毒檢測(cè)中的標(biāo)記方法及具體應(yīng)用

熒光標(biāo)記物可直接偶聯(lián)或通過(guò)化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒等微粒的熒光標(biāo)記，直接偶聯(lián)主要是親生物組分（核酸、脂類、蛋白）的染料或量子點(diǎn)（QDs）通過(guò)吸附的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的熒光標(biāo)記［9-14，40-42］，化學(xué)反應(yīng)需要熒光標(biāo)記物與病毒等微粒表面抗原蛋白的-NH2或-COOH發(fā)生化學(xué)反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)標(biāo)記［43-44］。近年來(lái)，生物正交反應(yīng)在病毒等微粒組分的功能化修飾中發(fā)揮巨大作用，進(jìn)而推動(dòng)了病毒熒光標(biāo)記的發(fā)展。Hao等［42］使用攜帶環(huán)炔的量子點(diǎn)偶聯(lián)疊氮分子修飾過(guò)的痘病毒，該研究以生物正交反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了病毒的熒光標(biāo)記。

由于病毒等微粒結(jié)構(gòu)的特殊性，直接標(biāo)記法無(wú)法標(biāo)記病毒的內(nèi)部組分，而且熒光標(biāo)記物對(duì)病毒的化學(xué)修飾會(huì)對(duì)其感染力造成一定影響，因此，為進(jìn)一步研究病毒的感染力，近年來(lái)基于生物代謝過(guò)程的標(biāo)記方法開(kāi)始展現(xiàn)其在病毒標(biāo)記方面的優(yōu)勢(shì)［45-50］。

3.1 傳統(tǒng)的熒光染料染色

DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）是第一種應(yīng)用于病毒顆粒染色的特異性熒光染料［40］，與DNA具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。1998年，Marie等［10］使用新型SYBR Green-I核酸染料標(biāo)記海洋噬菌體并運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明SYBR Green-I核酸染料具有良好的染色特性，運(yùn)用流式細(xì)胞儀能直接對(duì)天然海水樣品進(jìn)行快速檢測(cè)，且結(jié)果較落射熒光顯微鏡（Epi-Fluorescent Microscope，EFM）略高。隨著研究的深入，流式細(xì)胞儀分辨率的提高和新一代熒光染色劑的出現(xiàn)顯著提高了FVM的檢測(cè)范圍和靈敏度。2000年，Chen等［11］證明用流式細(xì)胞儀對(duì)海洋病毒進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，使用SYBR Gold核酸熒光染料發(fā)出的熒光強(qiáng)度比SYBR Green-I高兩倍，且穩(wěn)定性更好。2012年，Loret等［12］應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)核酸熒光染料Syto-13標(biāo)記單純皰疹病毒Ⅰ型的基因組，然后在病毒復(fù)制過(guò)程中對(duì)核衣殼的中間產(chǎn)物進(jìn)行分類。這是流式細(xì)胞術(shù)用于純化細(xì)胞內(nèi)病毒的成熟中間體的首次報(bào)道，為研究病毒的衣殼組裝、成熟和排出開(kāi)辟了新的途徑。

除了核酸染料（Syto-11、Hoechst 33342［12］、YOYO-1［9］等）外，還有蛋白質(zhì)熒光染料，如異硫氰酸熒光素（FITC）［51］等，親脂性膜熒光染料，如：Dil［52］、DiD［53］、DiO［54］等。越來(lái)越多熒光染料的出現(xiàn)，顯著提高了FVM的適用性。但直接使用熒光染料標(biāo)記病毒等微粒存在諸多問(wèn)題［55-56］：1）很多熒光染料不穩(wěn)定會(huì)在短時(shí)間內(nèi)淬滅，不利于耗時(shí)長(zhǎng)的試驗(yàn)程序；2）熒光染料標(biāo)記效率不定，部分染料標(biāo)記效果差；3）熒光染料染色后，可能會(huì)使結(jié)果的背景噪聲強(qiáng)；4）大部分熒光染料有毒性，不利于后續(xù)病毒顆粒傳染性的研究；5）大部分熒光染料致癌，對(duì)人體健康有害。

3.2 通過(guò)偶聯(lián)支架的標(biāo)記

直接使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)病毒顆粒受到諸多物理因素的限制［14］，特別是一些直徑小于100 nm的RNA病毒，它們遠(yuǎn)超出商用流式細(xì)胞儀的光散射檢測(cè)范圍，而且由于基因組過(guò)小，使用熒光染料染色效果也不理想［16］，所以可以通過(guò)在病毒上偶聯(lián)微球等磁性納米顆粒支架來(lái)克服這一困難。借助微球等磁性納米顆粒上的特異光學(xué)信號(hào)（如散射光或者熒光信號(hào)）來(lái)實(shí)現(xiàn)病毒顆粒的分類。2005年，Yan等［15］使用與抗體偶聯(lián)的微球捕獲并通過(guò)流式細(xì)胞儀區(qū)分甲型流感病毒和乙型流感病毒。2013年Arakelyan等［4］在流式病毒檢測(cè)法中利用磁性納米顆粒來(lái)捕獲HIV-1。2015年Arakelyan等［18］又用該方法捕獲了登革病毒。這種偶聯(lián)支架的方式不僅可以應(yīng)用于病毒的定量，還可以對(duì)病毒表面的組分進(jìn)行檢測(cè)。隨著研究的深入，越來(lái)越多的熒光染料偶聯(lián)納米材料應(yīng)用于細(xì)胞或病毒成像［57］、抗原分析。2020年Sanjaya等［19］使用磁性和熒光納米顆粒成功測(cè)定登革熱病毒抗原NS1的濃度，該研究以?shī)A心免疫測(cè)定形式將抗體與磁性和熒光納米顆粒偶聯(lián)，當(dāng)NS1存在于樣品中時(shí)，這些納米顆粒形成簇，并且簇的形成與抗原的濃度成正比以此來(lái)確定NS1的濃度。

3.3 基于免疫學(xué)原理的抗原抗體特異性標(biāo)記

運(yùn)用抗原抗體特異性結(jié)合的能力，可以顯著提高病毒等顆粒的標(biāo)記效果并對(duì)病毒進(jìn)行免疫表型分析?？贵w具有特異性標(biāo)記單個(gè)蛋白或蛋白修飾的能力，可以作為標(biāo)記目標(biāo)顆粒上蛋白分子的一種工具。2014年Landowsik等［58］首次使用抗體直接標(biāo)記尼帕病毒的糖蛋白，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量檢測(cè)。還有科研人員使用單克隆抗體、非中和抗體標(biāo)記病毒［9］。相較于其他標(biāo)記方法，將熒光團(tuán)等偶聯(lián)到抗體上形成的熒光抗體［59］具有特異性強(qiáng)、操作方便、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，成為FVM中最常用的標(biāo)記病毒方法。此外，科研工作者還使用熒光抗體和羥基化的中等微球共標(biāo)記病毒［15］，或使用熒光抗體和磁性納米顆粒共標(biāo)記病毒［4］。

3.4 熒光團(tuán)偶聯(lián)化合物的熒光探針或特殊分子偶聯(lián)化合物的分子探針標(biāo)記

將熒光團(tuán)或特殊分子與適當(dāng)化合物偶聯(lián)，可形成用于標(biāo)記病毒的熒光探針或分子探針，這種標(biāo)記方法具有靈敏度高、時(shí)空分辨率高、樣品制劑損傷小等優(yōu)點(diǎn)。常見(jiàn)的熒光團(tuán)有PE、APC、PercP、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、SiR、量子點(diǎn)（QDs）等，不同的熒光團(tuán)有不同的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，可以根據(jù)檢測(cè)需求對(duì)發(fā)射光源進(jìn)行調(diào)整。常見(jiàn)的特殊分子有疊氮基、生物素（將在“3.6”、“3.8”中詳述）、標(biāo)簽［50，60-64］等，常見(jiàn)用于偶聯(lián)的化合物有抗體、納米材料四聚乙二醇（PEG4）［41-42］和聚馬來(lái)酸十六醇酯（PMAH）［41］、二氟環(huán)辛（DIFO）、二苯并環(huán)辛炔（DBCO）［42，65］等。當(dāng)靶向病毒組分的熒光探針或分子探針成功標(biāo)記病毒后，可以通過(guò)流式細(xì)胞儀的熒光通道或者光散射通道對(duì)其進(jìn)行分析。

QDs是一種新型半導(dǎo)體納米材料，由化學(xué)周期表中IIB族和VIA族元素組成，磷光性質(zhì)比傳統(tǒng)染料更優(yōu)越，即QDs具有更高的光穩(wěn)定性，更寬且連續(xù)分布的激發(fā)光譜、更窄且對(duì)稱的發(fā)射峰［66］。1998年量子點(diǎn)首次應(yīng)用于生物成像，通過(guò)特殊方法反應(yīng)可以將量子點(diǎn)標(biāo)記到病毒上［41-42，64，67-68］實(shí)現(xiàn)病毒標(biāo)記。借助QDs，科研工作者實(shí)現(xiàn)了水皰性口炎病毒（VSV）表面糖類的標(biāo)記［69］、乙型腦炎病毒的追蹤［70］、人腸病毒71型（EV71）的標(biāo)記及其受體研究［71］。

在研究過(guò)程中，為了提高病毒標(biāo)記的效果，2015年，Lu等［13］將噻唑橙（TO）和苯乙烯化合物（C61）偶聯(lián)發(fā)明了一種新型熒光探針Styryl-TO，成功標(biāo)記了活細(xì)胞中的單鏈DNA和RNA，TO是一種高熒光產(chǎn)量的染料，可以作為一個(gè)平臺(tái)去偶聯(lián)其他分子以開(kāi)發(fā)針對(duì)不同核酸的熒光探針［72-74］，所以在病毒標(biāo)記中這種新型化合物有其廣泛的使用價(jià)值。

3.5 基因工程標(biāo)記

將熒光蛋白（fluorescent protein，F(xiàn)P）的DNA序列構(gòu)建到病毒蛋白的ORF中從而實(shí)現(xiàn)FP對(duì)病毒的熒光標(biāo)記［7-8，75-76］。理論上，這是最有效的熒光標(biāo)記技術(shù)，因?yàn)榭梢栽诓《静煌M分上構(gòu)建不同顏色的熒光蛋白以實(shí)現(xiàn)同步標(biāo)記，而且減少了熒光染料對(duì)病毒結(jié)構(gòu)和感染性的影響。但是基因工程標(biāo)記病毒操作繁瑣、工作量大，而且熒光蛋白尺寸大，限制了該方法的應(yīng)用。此外，該技術(shù)只能用于病毒蛋白標(biāo)記而不適用于其他組分。

3.6 生物正交標(biāo)記

2003年卡羅琳娜·貝爾托西提出生物正交反應(yīng)（Bioorthogonal reaction））的概念，這是指一類可以跟隨細(xì)胞或病毒等微粒代謝（如病毒復(fù)制、出芽）過(guò)程，并且在不干擾原有生化反應(yīng)條件的情況下進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)［77］。首先需要在宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中加入攜帶特定反應(yīng)基團(tuán)（例如：疊氮、炔烴、醛基、烯烴）的物質(zhì)，標(biāo)記宿主細(xì)胞，然后隨著病毒在宿主細(xì)胞中的侵染過(guò)程，完成病毒組分的標(biāo)記，最后加入含有對(duì)應(yīng)基團(tuán)的探針以此實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的熒光標(biāo)記。該反應(yīng)已被廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞、病毒等的生物大分子的功能化修飾［47，50，65，78-81］。所以基于生物正交反應(yīng)，對(duì)病毒組分進(jìn)行疊氮、酮基等標(biāo)記，然后用熒光團(tuán)或量子點(diǎn)等標(biāo)記的磷化氫化合物探針、炔基探針、肼基探針等可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的直接標(biāo)記或代謝標(biāo)記。當(dāng)前研究中，有幾個(gè)生物正交反應(yīng)被證明可以有效標(biāo)記細(xì)胞、病毒等顆粒，如醛酮和酰肼反應(yīng)［46］、Diels-Alder反應(yīng)［81］、Staudinger Ligation［82-83］、CuAAC［47，80］、SPAAC［41-42，48，51，80，84］。

3.6.1 醛酮和酰肼反應(yīng)

醛酮和酰肼的反應(yīng)是最早被研究的生物正交反應(yīng)之一，該反應(yīng)可用于標(biāo)記糖蛋白［45］，將酮基化合物直接或者代謝標(biāo)記到細(xì)胞等顆粒上，然后用熒光標(biāo)記的肼基探針實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的熒光標(biāo)記。Mahal等［46］首次提出利用寡聚糖生物合成途徑標(biāo)記細(xì)胞，N-乙酰-甘露胺可以在細(xì)胞中被轉(zhuǎn)化為唾液酸然后并入細(xì)胞表面成為酮基化的寡聚糖。在生理?xiàng)l件下，這種酮基化的糖蛋白可以被熒光肼基探針標(biāo)記，因此可用酮基標(biāo)記細(xì)胞表面的糖蛋白，然后在囊膜病毒出芽過(guò)程中實(shí)現(xiàn)病毒酮基化，最后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)出熒光肼基探針標(biāo)記過(guò)的病毒。但該反應(yīng)對(duì)pH敏感，并且在生理?xiàng)l件下反應(yīng)速率較慢，所以逐漸被其他生物正交反應(yīng)取代。

3.6.2 Diels-Alder反應(yīng)

1950年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C發(fā)給了狄爾斯-阿爾德反應(yīng)（Diels-Alder cycloaddition，即D-A反應(yīng)），該反應(yīng)是通過(guò)［4+2］環(huán)加成反應(yīng)連接雙烯體物質(zhì)和親雙烯體物質(zhì)。逆電子需求的D-A反應(yīng)（IEDDA）是當(dāng)前研究中發(fā)現(xiàn)的最快的生物正交反應(yīng)［85-86］。Devaraj等［81］使用該反應(yīng)標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白。有學(xué)者以非天然糖代謝為基礎(chǔ)，在宿主細(xì)胞膜的糖蛋白上引入環(huán)丙烯基團(tuán)，然后利用IEDDA反應(yīng)使環(huán)丙烯基團(tuán)與四嗪修飾的熒光探針相互作用，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞表面糖蛋白的特異性標(biāo)記［87］。Huang等［88］利用該反應(yīng)在牛痘病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒代謝過(guò)程中將5-乙烯基-2′-脫氧尿苷（VdU）摻入病毒基因組，然后用Cy5-Tz實(shí)現(xiàn)標(biāo)記。

3.6.3 施陶丁格偶聯(lián)反應(yīng)

1919年，Staudinger提出Staudinger偶聯(lián)反應(yīng)，這是疊氮基團(tuán)和膦基酯發(fā)生的反應(yīng)［89］。2003年Lemieux等［82］發(fā)明了一種含氟香豆素膦染料，并用Staudinger Ligation反應(yīng)與疊氮化物連接，成功實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)標(biāo)記。此后該反應(yīng)被廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)記［89］。還有研究者將哺乳動(dòng)物細(xì)胞與過(guò)乙酰化疊氮甘露胺（Ac4ManNAz）共孵育，使細(xì)胞在其自身的唾液酸合成途徑中利用Ac4ManNAz合成疊氮乙酰唾液酸（SiaNAz），后者取代唾液酸并入細(xì)胞表面，然后使用膦熒光探針實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表面糖蛋白標(biāo)記［83］。2017年Sundhoro等［90］創(chuàng)新性地發(fā)明了多氟苯基疊氮（PFAA），它與芳香膦的反應(yīng)比傳統(tǒng)的Staudinger Ligation反應(yīng)快1 940倍。研究人員將PFAA連接到乙酰化的甘露糖、半乳糖中設(shè)計(jì)成探針，成功實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表面的高效率標(biāo)記。因此可以考慮在病毒出芽過(guò)程中用該方法實(shí)現(xiàn)病毒標(biāo)記。

3.6.4 CuAAC

卡爾·巴里·夏普萊斯發(fā)現(xiàn)的由銅離子催化疊氮基團(tuán)和末端炔烴之間進(jìn)行的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)（Click reaction）被諸多實(shí)驗(yàn)室嘗試用于生物分子的標(biāo)記和研究［91］，這是一種效率更高的生物標(biāo)記方法。該反應(yīng)首次于2003年成功應(yīng)用于豇豆花葉病毒外表面蛋白質(zhì)標(biāo)記［92］。2008年，Jao和 Salic［47］將5′-乙炔基-2′脫氧鳥(niǎo)苷（EdU）和5′-乙基尿苷（EU）利用CuAAC反應(yīng)與熒光疊氮化合物（Alexa594 azide）反應(yīng)成功標(biāo)記細(xì)胞DNA和RNA，該方法有望在病毒復(fù)制時(shí)實(shí)現(xiàn)標(biāo)記。該反應(yīng)雖然速度快、化學(xué)區(qū)域選擇性高，但銅離子對(duì)生物分子的毒性作用也限制了該反應(yīng)在生物標(biāo)記方面的應(yīng)用。近年來(lái)科研工作者們基于CuAAC反應(yīng)開(kāi)展了諸多研究，不斷擴(kuò)大其適用領(lǐng)域［93］。

3.6.5 SPAAC

2004年，Agard等［51］提出了“無(wú)銅點(diǎn)擊化學(xué)（copper free click chemistry）”反應(yīng)，即張力促進(jìn)的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)（SPAAC）。該反應(yīng)標(biāo)記細(xì)胞、病毒等微粒，反應(yīng)特異性強(qiáng)，而且不存在銅離子的生物毒性［80］，科研人員用該方法實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞表面的糖蛋白標(biāo)記［51］和脂類的熒光標(biāo)記［94］。2012年我國(guó)學(xué)者用疊氮化合物azide-PEG4-NHS孵育流感病毒，然后利用SPAAC反應(yīng)成功實(shí)現(xiàn)用DBCO-QDs標(biāo)記流感病毒［42］。Rubino等［79］首次證明，非囊膜病毒可以使用疊氮糖代謝標(biāo)記纖維蛋白，在該研究中，研究者使用疊氮丙氨酸（Aha）或O-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）這兩種含有疊氮官能團(tuán)的化合物孵育腺病毒，然后用含有熒光TAMRA的炔探針成功實(shí)現(xiàn)標(biāo)記。還有學(xué)者先將DBCO-PEG4-NHS引入桿狀病毒表面，將未結(jié)合的DBCO用凝膠過(guò)濾去除后，再加入N3-PMAH-QDs成功實(shí)現(xiàn)標(biāo)記［41］。

2015年，Zhao等［48］通過(guò)蛋白質(zhì)糖基化過(guò)程將疊氮糖Ac4ManNA和Ac4GalNAz結(jié)合到宿主細(xì)胞糖蛋白中，在麻疹病毒出芽過(guò)程中實(shí)現(xiàn)疊氮標(biāo)記，之后通過(guò)SPAAC反應(yīng)實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記，研究還發(fā)現(xiàn)，修飾后的麻疹病毒大小、異質(zhì)性、TCID50基本無(wú)變化。2017年P(guān)an等［65］發(fā)展出一種活體內(nèi)原位標(biāo)記、示蹤流感病毒的新技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)病毒細(xì)胞脂類代謝將膽堿衍生物——疊氮乙酰膽堿（AE-Cho）的疊氮基修飾到病毒囊膜上，然后用DBCO-熒光探針實(shí)現(xiàn)標(biāo)記。在后續(xù)研究中，有資料表明可以用疊氮高丙氨酸標(biāo)記牛痘病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)［88］，用乙烯脫氧尿苷標(biāo)記痘病毒DNA［95］。近年來(lái)新型環(huán)辛炔類似物，例如DIFO、BARAC、BCN的出現(xiàn)，使得SPAAC反應(yīng)的速率和標(biāo)記物與目標(biāo)分子的生物相容性得到不同程度的提升。

3.7 分子光開(kāi)關(guān)標(biāo)記

分子開(kāi)關(guān)泛指結(jié)構(gòu)上組織化了的具有“開(kāi)/關(guān)”功能的化學(xué)體系［96］。非放射性核酸熒光分子開(kāi)關(guān)因其具有方便、快速、靈敏度高和安全等特點(diǎn)而備受關(guān)注。DNA分子光開(kāi)關(guān)釕（Ⅱ）吡啶配合物熱力學(xué)穩(wěn)定，具有獨(dú)特的DNA結(jié)合能力［97］，DNA分子光開(kāi)關(guān)釕（Ⅱ）吡啶配合物特指一類在水溶液中不發(fā)光或微弱發(fā)光，在加入DNA后發(fā)光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)的金屬配合物［98］。該配合物（［Ru（phen）2（dppz）］2+）于1990年由Barton合成，其激發(fā)波長(zhǎng)為400 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為600 nm。2012年Zhou等［76］使用［Ru（phen）2（dppz）］2+成功標(biāo)記桿狀病毒和宿主細(xì)胞基因組，研究結(jié)果還表明，使用該方法標(biāo)記后不影響子代病毒的產(chǎn)生。2013年，Huang等［88］使用［Ru（phen）2（dppz）］2+成功標(biāo)記牛痘病毒基因組。2023年，Wang等［99］合成了一種新的釕（II）多吡啶配合物——［Ru（dmb）2dppz- idzo］2+ （dmb=4，4′ -二甲基-2，2′ -聯(lián)吡啶，dppz-idzo=dppz-咪唑酮），研究發(fā)現(xiàn)該化合物可以作為雙鏈RNA的熒光探針，并顯著提高RNA雙鏈的穩(wěn)定性，所以在雙鏈RNA病毒的研究中可以考慮使用該配合物進(jìn)行標(biāo)記。

3.8 生物素和鏈霉親和素系統(tǒng)標(biāo)記

生物素-親和素系統(tǒng)（Biotin-Avidin-System， BAS）是70年代發(fā)展起來(lái)的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)，該方法已經(jīng)成為定位觀察、抗體定性等研究的新技術(shù)［100］。鏈霉親和素較親和素更容易與細(xì)胞表面的多糖、脂質(zhì)等發(fā)生非特異性親和反應(yīng)。2008年Joo等［64］先使用15-氨基酸生物素受體肽（AP）連接囊膜病毒，然后加入生物素連接酶、生物素和ATP特異地修飾了AP標(biāo)簽，將生物素引入病毒表面，之后利用生物素和鏈霉親和素之間的高反應(yīng)性，將鏈霉親和素-QDs標(biāo)記到病毒上并用共聚焦顯微鏡進(jìn)行分析。Huang等［50］將生物素修飾的磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）引入細(xì)胞，借助病毒囊膜的形成需要從宿主細(xì)胞膜獲取磷脂成分的生物學(xué)特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了病毒囊膜的生物素化及熒光標(biāo)記。2016年Wen等［101］使用該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)桿狀病毒囊膜標(biāo)記，同年又實(shí)現(xiàn)甲型流感病毒囊膜標(biāo)記［102］，2018年Huang等［54］用該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)天壇株牛痘病毒（VACV-TT）囊膜標(biāo)記。在研究過(guò)程中也有研究人員用基因工程將生物素受體肽與病衣殼蛋白結(jié)合，然后用生物素與鏈霉親和素相互作用直接實(shí)現(xiàn)標(biāo)記［86-87］。上述研究表明，BAS幾乎可以與研究成功的各種標(biāo)記物結(jié)合，基于BAS的微顆粒標(biāo)記方法具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

4 總結(jié)與展望

在人類與病毒斗爭(zhēng)的中，病毒遺傳進(jìn)化的快速演變給人類的防治工作帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的ELISA、Western blot、PCR等方法無(wú)法在單個(gè)病毒顆粒水平上展開(kāi)分析，也無(wú)法評(píng)估病毒顆粒之間的異質(zhì)性。FVM作為一種快速、靈敏且高通量的技術(shù)，為科研人員提供了樣本中病毒顆粒、外泌體、微囊泡等的物理性質(zhì)信息［103］，此外，熒光強(qiáng)度還為人們提供了靶抗原的豐富度。近年來(lái)，得益于更加靈敏的分析設(shè)備、更具特異性的試劑以及數(shù)據(jù)和方法的標(biāo)準(zhǔn)化［104-105］，F(xiàn)VM在表征病毒、外泌體等的種類、分辨率、特異性、高效性上取得了顯著的進(jìn)步。然而，F(xiàn)VM仍然存在一些弊端和挑戰(zhàn)，如病毒、外泌體、微囊泡等的體積大多數(shù)情況下處于商業(yè)流式細(xì)胞儀檢測(cè)的極限或閾值之下［106］，而且由于它們的表面積較細(xì)胞小約1 000到10 000倍，所以表面弱表達(dá)的抗原可能難以被儀器所檢測(cè)［107］。目前還沒(méi)有絕對(duì)的流式設(shè)備、標(biāo)記方法和分選策略可以做到高效地、特異性地分離所有微顆粒。因此，在進(jìn)行研究時(shí)，需要認(rèn)真考慮試驗(yàn)設(shè)置、病毒標(biāo)記方法、數(shù)據(jù)處理和分析方法等因素，選擇最合適的試驗(yàn)方法和技術(shù)以最大限度地提高效率和特異性。

在病毒標(biāo)記方法的探索中，傳統(tǒng)的染色劑標(biāo)記核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等的方法存在染色劑有毒性、熒光不穩(wěn)定、需要純化病毒樣品等問(wèn)題［11］。借助免疫學(xué)原理運(yùn)用熒光偶聯(lián)抗體標(biāo)記病毒的方法具有特異性強(qiáng)、效率高以及對(duì)病毒損傷小的優(yōu)點(diǎn)，是流式病毒檢測(cè)中最常見(jiàn)的標(biāo)記病毒方法之一［4，9］。在過(guò)去的十年里，生物正交方法在病毒標(biāo)記上表現(xiàn)出了顯著的優(yōu)越性。借助學(xué)科交叉，生物正交的各種化學(xué)試劑被開(kāi)發(fā)，并被用來(lái)活體病毒示蹤以揭示病毒感染機(jī)制［65］。生物正交方法已成為目前標(biāo)記研究微顆粒的優(yōu)秀方法之一。研究人員可以利用生物正交反應(yīng)實(shí)現(xiàn)病毒等微顆粒的標(biāo)記，并根據(jù)試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，借助熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀等設(shè)備實(shí)現(xiàn)定量和表征。此外，生物素和鏈霉親和素這一生物反應(yīng)放大系統(tǒng)因其靈敏度高、特異性和穩(wěn)定性好、普適性強(qiáng)也成為很多研究人員標(biāo)記病毒等微粒的選擇。除了以上方法，還有很多標(biāo)記細(xì)胞等微粒的方法同樣可以被嘗試用來(lái)標(biāo)記病毒等微粒。相信在未來(lái)，隨著流式細(xì)胞儀的持續(xù)改進(jìn)以及病毒標(biāo)記技術(shù)的不斷提高，F(xiàn)VM將會(huì)在病毒等微粒的定量和表征上展示其巨大的潛力。

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（編輯 范子娟）