煙草磺基轉(zhuǎn)移酶NtSOT17基因的克隆及表達(dá)分析

摘要：磺基轉(zhuǎn)移酶（SOT）是一類在動(dòng)植物和微生物中高度保守的蛋白，能催化磺化反應(yīng)，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和適應(yīng)逆境等方面起著重要作用。為探究煙草中SOT的功能，采用同源克隆方法從煙草K326中克隆到一個(gè)SOT基因，命名為NtSOT17，并對(duì)NtSOT17基因進(jìn)行生物信息學(xué)及表達(dá)模式分析。結(jié)果表明，NtSOT17全長(zhǎng)CDS序列為1 076 bp，編碼342個(gè)氨基酸，分子量為39.58 ku。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，NtSOT17定位于細(xì)胞質(zhì)，利用ProtParam、SignalP 5.0、Protscale等網(wǎng)站進(jìn)行分析，NtSOT17屬于酸性蛋白，具有親水性，無跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽。NtSOT17的啟動(dòng)子區(qū)域存在多種光響應(yīng)元件以及干旱、低溫等參與逆境響應(yīng)的順式作用元件，RT-qPCR結(jié)果顯示，其在脅迫處理后的煙草根、莖、葉中均有表達(dá)，其中在根部的表達(dá)較高，且在處理24 h時(shí)達(dá)到最高。以上結(jié)果表明NtSOT17是一個(gè)具有穩(wěn)定性的酸性親水蛋白，符合胞質(zhì)磺基轉(zhuǎn)移酶特征，能響應(yīng)干旱、高溫、低溫及高鹽等逆境脅迫。

關(guān)鍵詞：煙草；磺基轉(zhuǎn)移酶；生物信息學(xué)分析；基因克??；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S572.01""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）22-0031-07

磺基轉(zhuǎn)移酶（sulfotransferase，SOT或SULT）能催化通用供體PAPS的磺酸基團(tuán)（—SO3H）轉(zhuǎn)移至帶羥基或氨基的底物上，同時(shí)生成腺苷-3′，5′-二磷酸，這一過程通常被稱為磺化^［1］?；腔磻?yīng)幾乎存在于所有的生物體中，并且與各種生物過程有關(guān)，如細(xì)胞間交流、生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)。根據(jù)在植物細(xì)胞中的不同存在形式，可將SOT分為胞質(zhì)類磺基轉(zhuǎn)移酶和膜偶聯(lián)磺基轉(zhuǎn)移酶，迄今為止，大多數(shù)被鑒定的植物SOT是沒有跨膜區(qū)域的細(xì)胞質(zhì)蛋白，胞質(zhì)類SOT主要通過催化小分子內(nèi)源物質(zhì)和外源化合物的磺化，如類固醇、黃酮、硫代葡萄糖苷、激素、生物胺等參與植物生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫響應(yīng)^［2］。

Rivoal等的研究結(jié)果表明，苜?？浦参锿ㄟ^膽堿硫轉(zhuǎn)移酶催化產(chǎn)生滲透保護(hù)劑膽堿-O-硫酸鹽來耐受鹽脅迫^［3］。Cao等在水稻中鑒定了一個(gè)新的脅迫響應(yīng)基因OsSOT9，在經(jīng)過低溫處理后的孕穗期和花期葉片中表達(dá)量上調(diào)，且啟動(dòng)子區(qū)域存在12種與脅迫反應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，進(jìn)一步證明了OsSOT9與水稻響應(yīng)脅迫相關(guān)^［4］。在擬南芥已鑒定的SOT家族成員中，AtSOT12對(duì)黃酮、油菜素內(nèi)酯和水楊酸具有活性^［5］，且參與植物對(duì)鹽脅迫、滲透脅迫和激素處理的響應(yīng)^［6］。AtSOT10和AtSOT12能通過磺化油菜素內(nèi)酯影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。油菜素內(nèi)酯在細(xì)胞伸長(zhǎng)與分裂、維管束分化及葉片形態(tài)發(fā)生過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用^［7］，且可以通過促進(jìn)原形成層細(xì)胞的分裂，調(diào)節(jié)幼芽中維管束的數(shù)量^［8］。另外，小分子化合物的磺化可參與調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素運(yùn)輸從而參與植物生長(zhǎng)發(fā)育^［9］。

迄今為止，在擬南芥、水稻、馬鈴薯等作物中的功能研究顯示，SOT主要通過磺化反應(yīng)參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)外界脅迫的響應(yīng)^［10-11］，而在煙草上的研究未見報(bào)道。煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，以收獲葉片為主。在煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過程中，外界逆境脅迫會(huì)對(duì)其產(chǎn)生不同影響，如高溫導(dǎo)致葉片受損、枯萎，低溫抑制光合作用和葉片生長(zhǎng)，干旱導(dǎo)致葉片失水萎縮，產(chǎn)量品質(zhì)明顯降低。前期，筆者所在課題組在研究煙葉含梗率基因定位時(shí)，在定位區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)了磺基轉(zhuǎn)移酶基因，推測(cè)可能與葉脈發(fā)育相關(guān)。為此，本研究擬從煙草品種K326中克隆NtSOT17基因，采用生物信息學(xué)方法分析其理化性質(zhì)，對(duì)親/疏水性、保守結(jié)構(gòu)域及蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和啟動(dòng)子順式作用元件分析，采用RT-qPCR技術(shù)對(duì)NtSOT17在干旱、高鹽及高溫、低溫脅迫下的表達(dá)進(jìn)行了分析，以期為深入研究和利用該基因改良煙草抗逆性提供依據(jù)。

1"材料與方法

1.1"材料與試劑

試驗(yàn)于2023年在貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，供試植物為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的煙草品種K326。RNAprep純植物試劑盒（TIANGEN，DP432）、FastKing gDNA分離RT SuperMix試劑盒（TIANGEN，KR118）購于天根生化科技（北京）有限公司，DNA凝膠回收試劑盒、pClone007 Versatile Simple Vector Kit克隆試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞 DH5ɑ購于北京擎科生物科技股份有限公司，2×Sq qPCR Mix購于重慶葆光生物技術(shù)有限公司，高保真酶購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2"NtSOT17全長(zhǎng)CDS序列的克隆

1.2.1"總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成

利用RNAprep純植物試劑盒（TIANGEN，DP432）提取K326葉片RNA，F(xiàn)astKing gDNA分離RT SuperMix試劑盒（TIANGEN，KR118）反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用于擴(kuò)增基因全長(zhǎng)CDS序列；同樣的方法分別提取脅迫后K326的根、莖、葉總RNA并反轉(zhuǎn)錄，用于qPCR分析。

1.2.2"全長(zhǎng)CDS序列的克隆

在NCBI網(wǎng)站下載獲取NtSOT17的參考序列（NCBI登錄號(hào)107778316），利用在線網(wǎng)站Primer 3（https：//www.primer3plus.com/）設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物（引物信息見表1），引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。以K326 cDNA為模板，利用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得NtSOT17全長(zhǎng)序列。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 1 μL，正反向引物各1 μL，mix 25 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，68 ℃ 12 s，35個(gè)循環(huán)，68 ℃延伸5 min，最后4 ℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確后進(jìn)行膠回收，將得到的純化產(chǎn)物連接到中間載體并采用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5ɑ。經(jīng) 37 ℃ 培養(yǎng)過夜，于37 ℃條件下培養(yǎng)12 h后進(jìn)行菌斑PCR鑒定，挑選位置、大小正確的陽性菌株送北京擎科生物科技股份有限公司測(cè)序。

1.3"生物信息學(xué)分析

利用在線網(wǎng)站Expasy-ProtParam計(jì)算蛋白長(zhǎng)度、分子量和等電點(diǎn)，Expasy-Protscale預(yù)測(cè)其親、疏水性，NetPhos-3.1網(wǎng)站進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，Psort網(wǎng)站進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位，SignalP 5.0預(yù)測(cè)信號(hào)肽，DTU/DeepTMHMM 預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)，GOR網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，Phyre2網(wǎng)站獲取蛋白質(zhì)三維模型結(jié)構(gòu)，SMART網(wǎng)站預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域（表2）。在NCBI獲取NtSOT17基因的CDS上游2 000 bp，提交到PlantCare網(wǎng)站進(jìn)行啟動(dòng)子的順式作用元件預(yù)測(cè)。將NtSOT17的氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行BlastP比對(duì)，選擇相似度較高的物種并下載其氨基酸序列，運(yùn)用MEGA 11軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.4"NtSOT17的表達(dá)模式分析

以貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的煙草K326品種為試驗(yàn)材料，播種于煙草育苗專用基質(zhì)上，采用漂浮育苗方式進(jìn)行育苗，生長(zhǎng)條件為相對(duì)濕度75%， 白天（16 h）溫度28 ℃， 晚上（8 h）溫度20 ℃。待幼苗第6葉出現(xiàn)時(shí)對(duì)其進(jìn)行脅迫處理，具體措施為鹽脅迫（5%氯化鈉）、干旱脅迫（15% PEG6000）、高溫脅迫（38 ℃）及低溫脅迫（4 ℃），每個(gè)脅迫均重復(fù)3次，分別在處理0、2、12、24 h采集根、莖、葉，并立即放入-80 ℃的超低溫冰箱中保存。

利用Primer 3.0網(wǎng)站設(shè)計(jì)NtSOT17及內(nèi)參基因L25的引物并合成，以干旱、高鹽、高溫和低溫及對(duì)照的根、莖、葉組織RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用2×Sq qPCR Mix進(jìn)行qRT-PCR分析，每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3個(gè)生物重復(fù)和技術(shù)重復(fù)。qPCR體系：cDNA 1 μL，前后引物各0.5 μL，Mix 5 μL，ddH2O 3 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性20 s；94 ℃ 10 s，53.4 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)；最后65～95 ℃制備熔解曲線。反應(yīng)結(jié)束后采用2^-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，并利用DPS軟件進(jìn)行顯著性分析。

2"結(jié)果與分析

2.1"NtSOT17基因的克隆

以煙草K326的cDNA為模板擴(kuò)增NtSOT17的全長(zhǎng)CDS序列，獲得1條符合預(yù)期大小的目的條帶（圖1）。對(duì)北京擎科生物科技股份有限公司反饋的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，擴(kuò)增的目的條帶與NCBI獲得的參考序列一致，NtSOT17的CDS序列全長(zhǎng)為1 026 bp，編碼342個(gè)氨基酸。

2.2"NtSOT17的生物信息學(xué)分析

2.2.1"NtSOT17蛋白的理化性質(zhì)分析

Protparam分析結(jié)果顯示（表3），NtSOT17蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為39.58 ku，理論等電點(diǎn)為5.54，不穩(wěn)定系數(shù)為37.63（Ⅱ），屬于穩(wěn)定性蛋白。氨基酸共342個(gè)，其中絲氨酸占比最多，占比9.1%，負(fù)電荷及正電荷殘基分別為47個(gè)和40個(gè)，總平均親水性系數(shù)為 -0.370。采用ProtScale在線工具進(jìn)一步分析NtSOT17蛋白質(zhì)的親/疏水性，結(jié)果表明，NtSOT17蛋白質(zhì)的親水性上下限為1.644和-2.178，親水區(qū)域多于疏水區(qū)域（圖2），表明NtSOT17是一種親水性蛋白質(zhì)。因此，NtSOT17是一個(gè)具有親水性的酸性穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.2.2"NtSOT17蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明（圖3-A），NtSOT17蛋白質(zhì)共有43個(gè)磷酸位點(diǎn)，其中絲氨酸28個(gè)，蘇氨酸9個(gè)，酪氨酸6個(gè)，主要被絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸蛋白激酶磷酸化從而參與各種生理生化過程。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（圖3-B），NtSOT17蛋白有α螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲3種二級(jí)結(jié)構(gòu)，主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)是無規(guī)則卷曲，參與的氨基酸殘基占52.34%，參與α螺旋的氨基酸殘基占33.92%，參與延伸鏈的氨基酸殘基占13.74%，通過Phyre2網(wǎng)站對(duì)NtSOT17蛋白質(zhì)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，與其他磺基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相似（圖3-C）。

2.2.3"NtSOT17蛋白的亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果（圖4）表明， NtSOT17蛋白有1個(gè)Sulfotransfer_1結(jié)構(gòu)域位于74～333位氨基酸之間，屬于磺基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白。通過線上工具Psort對(duì)NtSOT17蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果（表4）表明，該蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的可能性最大，均為34.8%，其次是線粒體，可能性為26.1%。信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，NtSOT17蛋白質(zhì)存在信號(hào)肽的可能性僅為 0.002 2，不存在跨膜區(qū)域，說明NtSOT17蛋白不存在信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，不產(chǎn)生轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和膜蛋白，符合胞質(zhì)磺基轉(zhuǎn)移酶的特點(diǎn)。

2.2.4"NtSOT17的啟動(dòng)子順式作用元件分析

對(duì)NtSOT17基因的上游2 000 bp進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件鑒定，結(jié)果（表5）表明，在煙草NtSOT17基因的啟動(dòng)子中，除常見的CAAT框和TATA框外，還存在6種參與光響應(yīng)的元件（BOX-4、G-box、 Gap-box、I-box、TCT-motif、Sp1），以及參與脫落酸響應(yīng)的元件（ABRE）、茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）、低溫響應(yīng)元件（LTR）、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控的元件（02-site）和干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)（MBS）。由此可知，煙草NtSOT17基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育中參與了光響應(yīng)、脫落酸和茉莉酸甲酯響應(yīng)以及低溫、干旱等外界脅迫響應(yīng)。

2.2.5"NtSOT17的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將煙草NtSOT17的氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行Blastp比對(duì)，選擇辣椒（Capsicum annuum）、番茄（Solanum lycopersicum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza "sativa）并下載其氨基酸序列，利用MEGA 11進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)NtSOT17與辣椒磺基轉(zhuǎn)移酶蛋白聚為同一分支（圖6）。

2.3"NtSOT17的表達(dá)模式分析

本研究通過qPCR技術(shù)檢測(cè)了NtSOT17在干旱、鹽脅迫和高溫、低溫下不同組織中的表達(dá)量，以了解NtSOT17的響應(yīng)情況。結(jié)果（圖7）表明，在4種脅迫處理下，NtSOT17基因在根、莖、葉中均有不同程度的響應(yīng)，在莖和葉中的表達(dá)量均低于根中的表達(dá)量，且干旱、鹽和低溫處理下，NtSOT17在根中表達(dá)量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而上升，于24 h達(dá)到最高值，不同處理時(shí)間的表達(dá)量差異均達(dá)到顯著水平。

干旱脅迫下，NtSOT17在根部的表達(dá)量于0～2 h 與2～12 h內(nèi)漲幅不大，而在12～24 h 內(nèi)漲幅較大。在莖中，NtSOT17的表達(dá)量在4個(gè)處理時(shí)間內(nèi)差異顯著，處理2 h后表達(dá)量顯著上升達(dá)到最高，隨后下降，12 h時(shí)最低，最高表達(dá)量約為最低表達(dá)量的6倍。在葉中的表達(dá)量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)先下降后上升再下降，12 h時(shí)高于對(duì)照，且達(dá)到最高值，2 h和24 h時(shí)最低且低于對(duì)照。

高溫處理下，NtSOT17在根中表達(dá)量先上升后下降再上升，24 h達(dá)到最高，且表達(dá)量上升及下降幅度均較大，2 h和24 h時(shí)表達(dá)量分別為12 h時(shí)的3倍左右。在莖中，NtSOT17于處理2 h和12 h時(shí)的表達(dá)量顯著低于對(duì)照，12h時(shí)最低，24 h時(shí)上升，與對(duì)照差異不顯著。在葉片中的表達(dá)量同樣于處理 2 h 和12 h時(shí)顯著低于對(duì)照，24 h時(shí)上升但仍低于對(duì)照。

低溫下，NtSOT17在根部表達(dá)量于處理12～24 h 內(nèi)大幅上升，且24 h時(shí)表達(dá)量為4種脅迫處理下最高，說明NtSOT17對(duì)低溫響應(yīng)較高溫、干旱和鹽脅迫更為強(qiáng)烈。在莖中NtSOT17表達(dá)量于處理2、12 h顯著低于對(duì)照，12 h有上升，24 h最高，與對(duì)照差異不顯著。在葉中表達(dá)量于2 h和24 h顯著低于對(duì)照，24 h達(dá)到最低，12 h時(shí)高于對(duì)照，且不同處理時(shí)間內(nèi)差異顯著。

鹽脅迫下，NtSOT17在根部的表達(dá)量于2～12 h顯著上升，在莖中表達(dá)量均低于對(duì)照，于2 h和24 h達(dá)到最低，12 h時(shí)有上升但仍低于對(duì)照，在葉中表達(dá)量也是如此。

由此可知，煙草中NtSOT17可響應(yīng)干旱、高鹽、高溫和低溫脅迫，其中在根部表達(dá)量隨處理的時(shí)間不同有大幅度升高的現(xiàn)象，而在莖和葉中的表達(dá)較低。

3"討論與結(jié)論

目前，在哺乳動(dòng)物和植物中都發(fā)現(xiàn)了不同數(shù)量的SOT。在動(dòng)物中，細(xì)胞SOT可磺化外源物質(zhì)，增加其水溶性或降低生物活性，從而利于代謝、解毒。植物中SOT已知的功能包括參與蛋白質(zhì)及輔助因子的合成、抵御生物和非生物脅迫、調(diào)節(jié)氧化還原平衡、參與種子的發(fā)育等^［12］。本研究從普通煙草K326中克隆到一個(gè)磺基轉(zhuǎn)移酶基因，命名為NtSOT17。通過生物信息學(xué)分析，NtSOT17蛋白具有Sulfotransfer_1結(jié)構(gòu)域，屬于磺基轉(zhuǎn)移酶家族成員，且為胞質(zhì)類磺基轉(zhuǎn)移酶，進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示NtSOT17與辣椒磺基轉(zhuǎn)移酶親緣關(guān)系最近。蛋白質(zhì)磷酸化可以介導(dǎo)多種生物過程，如植物的發(fā)育和對(duì)外界脅迫的響應(yīng)，NtSOT17蛋白中含有多種絲氨酸以及一些蘇氨酸和酪氨酸殘基位點(diǎn)的磷酸化，表明該蛋白通過磷酸化在煙草生長(zhǎng)和逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果，NtSOT17蛋白結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲，無規(guī)則卷曲可提高對(duì)不利情況的耐受性^［13］。植物通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)來控制對(duì)各種外界脅迫或刺激的響應(yīng)，而轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)可以通過基因啟動(dòng)子區(qū)域中存在的順式作用元件來調(diào)節(jié)^［14］。本研究在NtSOT17上游啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了不同種類的植物激素和環(huán)境脅迫響應(yīng)的順式作用元件，表明該基因可在煙草的生長(zhǎng)和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用，還發(fā)現(xiàn)了多種光響應(yīng)元件，其中G-Box元件的存在表明光信號(hào)可以調(diào)節(jié)NtSOT17的轉(zhuǎn)錄，并最終參與煙草防御調(diào)節(jié)，如類黃酮生物合成途徑^［15］。

正常情況下，SOT在植物體內(nèi)的表達(dá)水平很低或幾乎不表達(dá)，逆境脅迫會(huì)誘導(dǎo)SOT的表達(dá)。歐洲油菜、野甘藍(lán) 、白花甘藍(lán)SOT的表達(dá)水平在水楊酸、乙醇或茉莉酸的誘導(dǎo)下均顯著增強(qiáng)^［16-18］，表明了SOT在逆境響應(yīng)中的潛在功能。本研究中NtSOT17經(jīng)過不同脅迫處理，在根中表達(dá)量大幅升高，表明SOT在煙草適應(yīng)逆境中發(fā)揮功能。目前，34個(gè)水稻SOT家族成員中已鑒定功能的有4個(gè)，主要參與調(diào)節(jié)水稻響應(yīng)非生物脅迫、抗病防御等過程，有17個(gè)在根中高表達(dá)^［19-20］。 Chen等通過MPSS數(shù)據(jù)庫查找分析水稻SOT的表達(dá)特性發(fā)現(xiàn)，OsSOT1在根、莖及花粉等組織中有高表達(dá)，基因表達(dá)微陣列數(shù)據(jù)分析表明，OsSOT1在子房中表達(dá)最高，其次為柱頭和根，而在干旱、低溫及鹽脅迫下表達(dá)量顯著下降^［21］。分析其原因，根中一般含有較多的油菜素類固醇中間體和較少的活性油菜素內(nèi)酯^［22］，推測(cè)OsSOT1在根中高表達(dá)可能與催化24-表油菜素甾酮，調(diào)控活性油菜素內(nèi)酯的合成有關(guān)。雷雨婷等將油菜素內(nèi)酯合成的關(guān)鍵基因DET2轉(zhuǎn)入煙草中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)PtDET2基因植株在模擬干旱及鹽脅迫條件下具有更強(qiáng)的活性氧清除能力，通過保護(hù)性酶活性的提高減少了細(xì)胞的破壞，提高了抗逆能力^［23］，該研究表明油菜素內(nèi)酯在植物響應(yīng)逆境中具有重要作用。因此在不同脅迫下OsSOT1的表達(dá)下降可能導(dǎo)致油菜素內(nèi)酯合成前體物的硫酸化減少，增加了活性油菜素內(nèi)酯含量，進(jìn)而提高了植物抗逆性。

NtSOT17基因在干旱、高溫、低溫和鹽脅迫處理下均有響應(yīng)，且根部表達(dá)量明顯高于莖和葉，表明磺基轉(zhuǎn)移酶參與了煙草對(duì)外界脅迫的響應(yīng)，且主要在根部表達(dá)。擬南芥SOT家族成員中，AtSOT8主要在根中表達(dá)，且類黃酮參與根中生長(zhǎng)素的極性轉(zhuǎn)運(yùn)，表明AtSOT8可能通過類黃酮苷的硫酸化作用調(diào)控根的生長(zhǎng)發(fā)育^［24-25］，另一個(gè)酪氨酸蛋白質(zhì)硫酸轉(zhuǎn)移酶（TPST）基因在整株植物中均有表達(dá)，但在根尖分生組織、側(cè)根原基和維管組織中特別強(qiáng)^［26］，表明磺基轉(zhuǎn)移酶可參與植物生長(zhǎng)發(fā)育。煙草NtSOT17對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育的作用還需進(jìn)一步通過基因編輯等試驗(yàn)技術(shù)深入探究。

本研究克隆了煙草NtSOT17基因，全長(zhǎng) 1 026 bp，編碼342個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白具有Sulfotransfer-1結(jié)構(gòu)域，相對(duì)分子質(zhì)量為39.58 ku，等電點(diǎn)為5.54，與辣椒SOT親緣關(guān)系最近，屬于胞質(zhì)磺基轉(zhuǎn)移酶，NtSOT17可參與煙草對(duì)鹽、干旱及溫度脅迫的響應(yīng)，但其對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的功能及作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。本研究將為進(jìn)一步采用基因工程技術(shù)深入研究煙草磺基轉(zhuǎn)移酶的生物學(xué)功能及選育高品質(zhì)煙草品種提供理論支撐。

參考文獻(xiàn)：

［1］Hirschmann F，Krause F，Papenbrock J. The multi-protein family of sulfotransferases in plants：composition，occurrence，substrate specificity，and functions［J］. Frontiers in Plant Science，2014（5）：556.

［2］Chapman E，Best M D，Hanson S R，et al. Sulfotransferases：structure，mechanism，biological activity，inhibition，and synthetic utility［J］. Angewandte Chemie，2004，43（27）：3526-3548.

［3］Rivoal J，Hanson A D. Choline-O-sulfate biosynthesis in plants ［Identification and partial characterization of a salinity-inducible choline sulfotransferase from species of Limonium （Plumbaginaceae）］［J］. Plant Physiology，1994，106（3）：1187-1193.

［4］Cao X F，Liao Y R，Rong S H，et al. Identification and characterization of a novel abiotic stress responsive sulphotransferase gene （OsSOT9） from rice［J］. Biotechnology amp; Biotechnological Equipment，2016，30（2）：227-235.

［5］Marsolais F，Boyd J，Paredes Y，et al. Molecular and biochemical characterization of two brassinosteroid sulfotransferases from Arabidopsis，AtST4a（At2g14920） and AtST1（At2g03760）［J］. Planta，2007，225（5）：1233-1244.

［6］Baek D，Pathange P，Chung J S，et al. A stress-inducible sulphotransferase sulphonates salicylic acid and confers pathogen resistance in Arabidopsis［J］. Plant，Cell amp; Environment，2010，33（8）：1383-1392.

［7］鄭"潔，王"磊. 油菜素內(nèi)酯在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2014，16（1）：52-58.

［8］Ibaes M，F(xiàn)àbregas N，Chory J，et al. Brassinosteroid signaling and auxin transport are required to establish the periodic pattern of Arabidopsis shoot vascular bundles［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106（32）：13630-13635.

［9］Faulkner I J，Rubery P H. Flavonoids and flavonoid sulphates as probes of auxin-transport regulation in Cucurbita pepo hypocotyl segments and vesicles［J］. Planta，1992，186（4）：618-625.

［10］Klein M，Papenbrock J. The multi-protein family of Arabidopsis sulphotransferases and their relatives in other plant species［J］. Journal of Experimental Botany，2004，55（404）：1809-1820.

［11］He F Y，Duan S G，Jian Y Q，et al. Genome-wide identification and gene expression analysis of the 14-3-3 gene family in potato （Solanum tuberosum L.）［J］. BMC Genomics，2022，23（1）：811.

［12］周宏飛. 水稻硫酸轉(zhuǎn)移酶（OsSOT1）的原核表達(dá)、純化與酶活測(cè)定［D］. 金華：浙江師范大學(xué)，2019：11-15.

［13］Braun P，Aubourg S，van Leene J，et al. Plant protein interactomes［J］. Annual Review of Plant Biology，2013，64：161-187.

［14］Sheshadri S A，Nishanth M J，Simon B. Stress-mediated cis-element transcription factor interactions interconnecting primary and specialized metabolism in planta［J］. Frontiers in Plant Science，2016，7：1725.

［15］Bias R，Szafran K，Hnatuszko-Konka K，et al. Cis-regulatory elements used to control gene expression in plants［J］. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2016，127（2）：269-287.

［16］Guo L P，Yang R Q，Gu Z X. Cloning of genes related to aliphatic glucosinolate metabolism and the mechanism of sulforaphane accumulation in broccoli sprouts under jasmonic acid treatment［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture，2016，96（13）：4329-4336.

［17］Rouleau M，Marsolais F，Richard M，et al. Inactivation of brassinosteroid biological activity by a salicylate-inducible steroid sulfotransferase from Brassica napus［J］. Journal of Biological Chemistry，1999，274（30）：20925-20930.

［18］Wu Q Y，Wang J W，Mao S X，et al. Comparative transcriptome analyses of genes involved in sulforaphane metabolism at different treatment in Chinese kale using full-length transcriptome sequencing［J］. BMC Genomics，2019，20（1）：377.

［19］Guretzki S，Papenbrock J. Characterization of the sulfurtransferase family from Oryza sativa L.［J］. Plant Physiology and Biochemistry，2011，49（9）：1064-1070.

［20］Wang Q，Liu Y Q，He J，et al. STV11 encodes a sulphotransferase and confers durable resistance to rice stripe virus［J］. Nature Communications，2014，5：4768.

［21］Chen R J，Jiang Y Y，Dong J L，et al. Genome-wide analysis and environmental response profiling of SOT family genes in rice （Oryza sativa）［J］. Genes amp; Genomics，2012，34（5）：549-560.

［22］Shimada Y，Goda H，Nakamura A，et al. Organ-specific expression of brassinosteroid-biosynthetic genes and distribution of endogenous brassinosteroids in Arabidopsis［J］. Plant Physiology，2003，131（1）：287-297.

［23］雷雨婷，姚新轉(zhuǎn)，呂立堂，等. 毛白楊PtDET2基因的克隆及其在煙草中的抗旱與耐鹽功能分析［J］. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2017，36（5）：6-13.

［24］Hashiguchi T，Sakakibara Y，Shimohira T，et al. Identification of a novel flavonoid glycoside sulfotransferase in Arabidopsis thaliana［J］. Journal of Biochemistry，2014，155（2）：91-97.

［25］Lewis D R，Ramirez M V，Miller N D，et al. Auxin and ethylene induce flavonol accumulation through distinct transcriptional networks［J］. Plant Physiology，2011，156（1）：144-164.

［26］Komori R，Amano Y，Ogawa-Ohnishi M，et al. Identification of tyrosylprotein sulfotransferase in Arabidopsis［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106（35）：15067-15072.