雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片對慢傳輸型便秘大鼠腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響

[摘要]"目的"探討雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片對慢傳輸型便秘（slow"transit"constipation，STC）大鼠的治療作用及相關(guān)機制。方法"SPF級Wistar成年雌性大鼠30只，采用隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片低劑量組（0.270g/kg）、雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片中劑量組（0.540g/kg）、雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片高劑量組（1.080g/kg）、陽性藥（琥珀酸普蘆卡必利片）（0.180mg/kg）組，每組5只。采用鹽酸洛哌丁胺灌胃建立STC大鼠模型。造模成功后，在繼續(xù)造模的基礎(chǔ)上分別給予藥物灌胃，連續(xù)給藥14d。觀察并計算各組大鼠一般體征變化、糞便含水率及腸道推進(jìn)率，采用HE染色觀察結(jié)腸組織病理學(xué)改變。采用免疫組織化學(xué)法檢測大鼠結(jié)腸組織中受體酪氨酸激酶（receptor"tyrosine"kinase，c-Kit），5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT），5-HT3受體（5-hydroxy"tryptamine"3"receptor，5-HT3R）和5-HT4受體（5-hydroxy"tryptamine"4"receptor，5-HT4R）的蛋白表達(dá)。結(jié)果"與對照組比較，模型組大鼠的排便次數(shù)、糞便含水量、腸道推進(jìn)速度等均有所下降，大鼠腸組織中c-Kit、5-HT、5-HT3R、5-HT4R等蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0.05）。與模型組比較，給予雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片干預(yù)后，雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片低、中、高劑量組大鼠排便頻率、糞便含水率、腸道推進(jìn)率、腸組織中c-Kit，5-HT，5-HT3R和5-HT4R的蛋白表達(dá)均明顯升高（Plt;0.05）。結(jié)論"腸道益生菌制劑雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片可有效改善STC的作用，通過促進(jìn)結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞增殖、增加5-HT、5-HT3R、5-HT4R的蛋白表達(dá)，可能是雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片改善STC的重要作用機制之一。

[關(guān)鍵詞]"慢傳輸型便秘；5-羥色胺；Cajal間質(zhì)細(xì)胞

[中圖分類號]"R574.8""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.35.016

Effect"of"live"combined"bifidobacterium"and"lactobacillus"tabletsnbsp;on"intestinal"Cajal"interstitial"cell"proliferation"with"slow"transit"constipation"in"rats

LIU"Liya1，2，"ZHANG"Xinran1，"WU"Yulun1，"LIU"Qihong3，4，"CHEN"Jintuan1，"XIE"Qiurong5，"WEI"Lihui5，"KE"Xiao3，4，"SHEN"Aling1

1.Academy"of"Integrative"Medicine，"Fujian"University"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Fuzhou"350122，"Fujian，"China;""""""""2.Affiliated"Sanming"Integrated"Medicine"Hospital"of"Fujian"University"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Sanming"353001，"Fujian，"China;"3.Department"of"Spleen"and"Stomach，"the"Second"People’s"Hospital，"Fujian"University"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Fuzhou"350003，"Fujian，"China;"4.Fujian"Traditional"Chinese"Medicine"Spleen"and"Stomach"Clinical"Medical"Research"Center，"Fuzhou"350003，"Fujian，"China;"5.Innovation"and"Transformation"Center，"Fujian"University"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Fuzhou"350122，"Fujian，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"therapeutic"effect"and"mechanisms"of"live"combined"bifidobacterium"and"lactobacillus"tablets"on"slow"transit"constipation"（STC）"rats."Methods"A"total"of"30"SPF"grade"Wistar"adult"female"rats"were"blinded"and"divided"into"control"group，"model"group，"live"combined"bifidobacterium"and"lactobacillus"tablets"low-dose"（0.270g/kg），"live"combined"bifidobacterium"and"lactobacillus"tablets"medium"dose"group"（0.540g/kg），"live"combined"bifidobacterium"and"lactobacillus"tablets"high-dose"group"（1.080g/kg），"and"positive"drug"group"（prucalopride"succinate"tablet）"（0.180mg/kg），"with"5"rats"in"each"group."A"rat"model"of"STC"was"established"by"gavage"of"loperamide"hydrochloride."After"successful"modeling，"medication"wasnbsp;administered"by"gavage"for"14"consecutive"days"on"the"basis"of"continued"modeling."Observe"the"changes"in"general"physical"signs，"fecal"water"content，"and"calculate"intestinal"motility"in"each"group"of"rats."Using"HE"staining"to"observe"pathological"changes"in"colon"tissue，"immunohistochemical"methods"were"used"to"detect"the"protein"expression"of"receptor"tyrosine"kinase"（c-Kit），"5-hydroxytryptamine"（5-HT），"5-hydroxytryptamine"3"receptor"（5-HT3R），"and"5-hydroxytryptamine"4"receptor"（5-HT4R）"in"rat"colon"tissue."Results"Compared"with"control"group，"frequency"of"defecation，"fecal"water"content"and"intestinal"propulsion"speed"of"STC"model"rats"were"significantly"decreased."The"expression"levels"of"proteins"such"as"c-Kit，"5-HT，"5-HT3R，"and"5-HT4R"in"intestinal"tissues"were"significantly"reduced"in"STC"model"rats."Compared"with"STC"model"group，"rats"treated"with"low，"medium"and"high"doses"of"live"combined"bifidobacterium"and"lactobacillus"tablets"and"positive"drug"groups"showed"a"significant"increase"in"bowel"frequency，"fecal"water"content，"and"intestinal"motility"after"intervention."Compared"with"STC"model"group，"frequency"of"defecation，"fecal"water"content，"intestinal"propulsion"rate"and"protein"expression"of"c-Kit，"5-HT，"5-HT3R"and"5-HT4R"in"rat"intestinal"tissues"were"significantly"increased"after"intervention"of"live"combined"bifidobacterium"and"lactobacillus"tablets"low，"medium"and"high"dose"groups."Conclusion"This"study"confirms"that"probiotic"preparation"live"combined"bifidobacterium"and"lactobacillus"tablets"effectively"improves"slow"transit"constipation"by"promoting"the"proliferation"of"Cajal"interstitial"cells"in"the"colon，"increasing"the"expression"of"5-HT，"5-HT3R，"and"5-HT4R，"enhancing"intestinal"peristalsis，"and"achieving"the"therapeutic"effect"on"STC"rats.

[Key"words]"Slow"Transit"constipation;"5-Hydroxytryptamine;"Cajal"interstitial"cells

便秘是一種常見的胃腸道疾病，慢傳輸型便秘（slow"transit"constipation，STC）發(fā)病機制復(fù)雜，常發(fā)生在大腸功能障礙，傳輸時間延長，結(jié)果導(dǎo)致患者排便困難、大便硬結(jié)、便意減少等臨床表現(xiàn)[1-2]。長期STC可增加大腸癌患病風(fēng)險，誘發(fā)心腦血管性疾病[3-4]。目前對STC的治療一般使用瀉藥、促腸動力藥等對癥治療，短期內(nèi)效果顯著。長期服用效果欠佳[5]。

雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片是常用人體腸道正?；罹幬镏唬＜永麃喨闂U菌、長型雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌，是一種腸道益生菌制劑，臨床常用于腸道菌群調(diào)節(jié)，改善患者腸道菌群紊亂的臨床癥狀。既往研究表明，口服益生菌聯(lián)合不同藥物通過改善腸道蠕動和腸道菌群分布等作用改善功能性便秘，可能與Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitial"cells"of"cajal，ICC）損傷、腸道微生物失調(diào)、腸神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙等多種機制的改變相關(guān)[6-8]。因此，本研究擬采用鹽酸洛哌丁胺混懸液灌胃給藥構(gòu)建STC模型大鼠，檢測各組大鼠排便情況、胃腸動力改變、ICC損傷等指標(biāo)，探討雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片對STC大鼠結(jié)腸運動功能的影響及其機制研究，為雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片臨床治療STC提供相關(guān)依據(jù)。

1""材料與方法

1.1""實驗動物

30只雌性無特定病原體（specific"pathogen"free，SPF）級Wistar成年實驗大鼠[北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2019-0008]，體質(zhì)量（150±20g）。所有動物均飼養(yǎng)在福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級中，恒溫溫度20～22℃，相對濕度控制在40%～60%，室內(nèi)保持12h晝夜交替，所有實驗動物自由飲食飲水。30只Wistar大鼠采用隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片低劑量組、雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片中劑量組、雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片高劑量組、陽性藥（琥珀酸普蘆卡必利片）組，每組5只。除對照組大鼠不進(jìn)行造模處理外，其余各組大鼠均用鹽酸洛哌丁胺3mg/kg混懸液大鼠灌胃7d進(jìn)行造模處理。觀察到造模后大鼠排便次數(shù)和排便量減少為造模成功。造模成功后，給予雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片低（0.27g/kg）、中（0.54g/kg）、高劑量（1.08g/kg）灌胃干預(yù)，陽性藥組使用琥珀酸普蘆卡必利片（0.18mg/kg）配制混懸液灌胃給藥，對照組和模型組給予同等劑量生理鹽水灌胃處理，所有干預(yù)措施均連續(xù)給藥14d。本研究經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（動物實驗倫理批準(zhǔn)號：FJTCM"IACUC2022018）。

1.2""藥物和儀器

鹽酸洛哌丁胺膠囊（批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H10910085，生產(chǎn)單位：西安楊森制藥有限公司，規(guī)格：2mg）；雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片（批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字S19980004，生產(chǎn)單位：內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.5g）；琥珀酸普蘆卡必利片（批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20183482，生產(chǎn)單位：江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，規(guī)格：2mg）；5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）和5-HT4受體（5-"hydroxytryptamine"4"receptor，5-HT4R）購自武漢BIOSS公司，5-HT3受體（5-hydroxy"tryptamine"3"receptor，5-HT3R）購自美國SAB公司，受體酪氨酸激酶（receptor"tyrosine"kinase，c-Kit）抗體購自武漢Proteintech公司。石蠟包埋機和石蠟切片機均購自湖北錦源醫(yī)療科技有限公司，半自動化正立式顯微鏡購自德國徠卡公司。

1.3""檢測指標(biāo)與病理觀察

末次給藥后，集中收集每組大鼠當(dāng)天藥物干預(yù)后6h以內(nèi)的糞便數(shù)量并拍照記錄，電子天平稱重，烘烤后稱重計算糞便含水率（%）＝（濕糞質(zhì)量–干糞質(zhì)量）/濕糞質(zhì)量×100%。實驗結(jié)束前，用10%活性炭配置混懸液灌胃大鼠，每只用量3ml，10min后麻醉大鼠并取材，分離腸系膜并取出全部小腸組織，測量活性炭的距離和小腸全長，計算小腸推進(jìn)率＝活性炭距離/小腸全長×100%。分離并取出全部大腸組織，拍照記錄。蘇木精-伊紅染色觀察組織病理改變。分離大腸遠(yuǎn)端約0.5cm×0.5cm組織，去除糞便固定后包埋切片，脫蠟脫水后進(jìn)行蘇木精核染，分化后伊紅復(fù)染，梯度脫水后封片。100倍鏡下觀察并獲取圖像。將大鼠大腸組織切片脫蠟、脫水后，3%的過氧化氫孵育、正常血清封閉、滴加相應(yīng)的一抗抗體（5-HT、5-HT3R、5-HT4R、c-Kit）溶液，放置4℃環(huán)境中孵育過夜。二抗抗體室溫孵育，加入鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液室溫孵育后，新鮮配置二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色處理，經(jīng)封固后在400倍鏡下觀察獲取圖像并對陽性表達(dá)面積進(jìn)行分析。

1.4""統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS"26.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（"）表示，組間比較采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位間距）[M（Q1，Q3）]表示，組間比較采用秩和檢驗，計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""各組大鼠的基本情況比較

在實驗過程中，對照組大鼠精神活躍，進(jìn)食規(guī)律，毛發(fā)光澤，排便正常。模型組大鼠出現(xiàn)精神煩躁，易怒，毛發(fā)失去光澤，排便次數(shù)和排便量與對照組相比明顯下降，證實造模成功。雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片及陽性藥物治療組大鼠精神狀態(tài)轉(zhuǎn)

好、排便增加。實驗結(jié)束后，觀察各組大鼠結(jié)腸大體觀，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠結(jié)腸遠(yuǎn)端中仍留有多粒糞便，藥物治療后結(jié)腸內(nèi)糞便數(shù)量減少，見圖1。

2.2""各組大鼠的排便次數(shù)、糞便含水率和腸道推進(jìn)率比較

與對照組比較，模型組的排便次數(shù)、糞便含水率和腸道推進(jìn)率均明顯下降（Plt;0.05）；與模型組比較，雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片各劑量組和陽性藥組的排便次數(shù)、糞便含水率和腸道推進(jìn)率均得到改善（Plt;0.05），見表1。

2.3""各組大鼠大腸病理改變情況的比較

對照組大鼠腸組織黏膜層細(xì)胞排列規(guī)則有序，無明顯炎性浸潤。模型組腸組織黏膜出現(xiàn)損傷，炎性浸潤，腺體消失。與模型組比較，雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片各劑量組和陽性藥組可見黏膜層結(jié)構(gòu)較完整，黏膜損傷程度有明顯改善，腺體結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)。見圖2。

2.4""各組大鼠大腸組織中c-Kit蛋白表達(dá)的比較

與對照組比較，模型組大鼠c-Kit蛋白表達(dá)呈明顯降低趨勢（Plt;0.05）。與模型組比較，雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片干預(yù)后除低劑量組外，其余各組大鼠腸組織的c-Kit蛋白表達(dá)均升高（Plt;0.05）。見圖3。

與對照組比較，模型組大鼠5-HT、5-HT3R、5-HT4R蛋白表達(dá)呈降低趨勢（Plt;0.05）。與模型組比較，雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片干預(yù)后除低劑量組外，其余各劑量組大鼠腸組織中5-HT、5-HT3R、5-HT4R表達(dá)均升高（Plt;0.05）。見圖4。

3""討論

STC主要以結(jié)腸的傳輸功能障礙、腸內(nèi)容物傳輸緩慢所致的便秘，受精神壓力大、飲食結(jié)構(gòu)改變、環(huán)境改變等多種因素影響，發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重者導(dǎo)致腸道黏膜的損傷，腸道通透性增加，促發(fā)多種疾病[1-2]。

本研究采用國內(nèi)外較為公認(rèn)的洛哌丁胺溶液灌胃方法建立STC"模型大鼠，其機制是作用于腸壁阿片受體，阻止膽堿和前列腺素釋放，從而抑制腸蠕動，延長腸道內(nèi)容物通過時間，促進(jìn)水、電解質(zhì)等吸收，導(dǎo)致動物腸轉(zhuǎn)運時間延長，糞便數(shù)量和含水量減少，出現(xiàn)便秘癥狀[9-10]。本實驗給予鹽酸洛哌丁胺發(fā)現(xiàn)大鼠排便次數(shù)明顯減少、大便干燥、小腸推進(jìn)減緩，均符合STC的主要病理特點[11-12]。研究證實口服益生菌改善腸道微生態(tài)平衡、調(diào)節(jié)腸道正常蠕動，改變大便性狀，有利排出。雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片，三種活菌含量較高，可使科酵解寡糖產(chǎn)生乙酸和乳酸，調(diào)節(jié)腸道菌群分布，可產(chǎn)生多種有機酸促進(jìn)水分分泌，緩解便秘的產(chǎn)生[6，13]。琥珀酸普蘆卡必利是一種常見胃腸促動藥，是5-HT4R激動劑，常用于STC研究中作為陽性對照藥物，對腸道神經(jīng)系統(tǒng)有較強的特異性，對整個腸胃道的刺激相對較小，在保證治療效果的同時大幅降低不良反應(yīng)的發(fā)生[14]。本研究雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片不同劑量組和琥珀酸普蘆卡必利片陽性藥物組給予模型大鼠灌胃干預(yù)后，大鼠排便數(shù)量和糞便含水率均有所增加，促進(jìn)小腸蠕動，提示雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片能有效促進(jìn)STC大鼠排便，改善便秘情況，與陽性藥組效果接近。

研究表明，ICC細(xì)胞損傷是STC的發(fā)病機制之一，ICC是與胃腸運動密切相關(guān)一種特殊間質(zhì)細(xì)胞。ICC的減少和功能障礙可導(dǎo)致結(jié)腸活動減少，阻斷腸神經(jīng)系統(tǒng)和平滑肌細(xì)胞間信息傳遞，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞收縮力降低，造成結(jié)腸運動障礙和腸內(nèi)容物傳輸延遲[15-17]。c-Kit是ICC的特異性標(biāo)志物，在胃腸道中主要由肥大細(xì)胞和ICC表達(dá)[18]。本研究中，與對照組比較，STC模型大鼠腸組織中c-Kit的表達(dá)下降，而不同劑量雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片組干預(yù)后表達(dá)升高，說明雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片干預(yù)后ICC細(xì)胞數(shù)量增加，可能是緩解便秘的原因之一。5-HT是一種單胺型神經(jīng)遞質(zhì)，主要位于腸胃道的嗜鉻細(xì)胞中，參與腸蠕動的調(diào)節(jié)。與胃腸道關(guān)系較為密切的5-HT相關(guān)受體主要是5-HT3R、5-HT4R，分布于腸神經(jīng)元上，介導(dǎo)黏膜下的內(nèi)在感覺神經(jīng)元激活，釋放乙酞膽堿或鈣蛋白基因相關(guān)肽等，使第二信使神經(jīng)元產(chǎn)生慢興奮突觸后電位，最終激發(fā)腸壁的蠕動反射，引起胃腸道平滑肌收縮，促進(jìn)腸道蠕動，引起排便[12]。本研究模型組大鼠腸組織中5-HT、5-HT3R、5-HT4R的表達(dá)均明顯低于對照組，而不同劑量雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片組干預(yù)后表達(dá)升高，說明雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片可通過5-HT與5-HT3R、5-HT4R特異性結(jié)合，參與腸蠕動調(diào)節(jié)，發(fā)揮治療便秘的作用。但雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片干預(yù)后通過增加c-Kit及5-HT、5-HT3R、5-HT4R蛋白表達(dá)發(fā)揮治療作用的深入機制有待進(jìn)一步實驗探討。

本研究證實腸道益生菌制劑雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片可有效改善STC，可能的機制是通過促進(jìn)STC大鼠結(jié)腸組織ICC的增殖、增加5-HT及5-HT3R、5-HT4R的表達(dá)，增強腸道蠕動，最終達(dá)到治療的效果。為雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片治療便秘提供實驗室依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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