高毒力肺炎克雷伯菌的血清莢膜分型菌株特點及耐藥性分析

雷亞利，潘俊均，修寧寧，鄧沛汶，張碧瑜，隋 洪

東莞康華醫(yī)院檢驗科，廣東東莞 523000

肺炎克雷伯菌隸屬于腸桿菌科克雷伯菌屬，是一種無動力、無芽孢、有莢膜、能夠發(fā)酵乳糖的粗短革蘭陰性桿菌，是繼大腸埃希菌之后臨床分離率最高的致病菌。肺炎克雷伯菌是一種條件致病菌，寄居于人體呼吸道和腸道，通常情況下對人體不會致病，當人體免疫力下降時，通過呼吸道侵入肺部引起肺炎甚至肺膿腫，且出現(xiàn)胸腔積液等并發(fā)癥，或者長期使用抗菌藥物導致菌群失調時才會致病。肺炎克雷伯菌對外界環(huán)境具有較強的抵抗力，對多數(shù)抗菌藥物易產生耐藥性。1958年在我國臺灣地區(qū)出現(xiàn)了引起多個部位膿腫，尤其是肝膿腫的高毒力肺炎克雷伯菌(HvKP)，之后在亞洲地區(qū)也常有報道[1]。HvKP在平板上經培養(yǎng)后常常出現(xiàn)黏液型菌落，故又稱為高黏液型肺炎克雷伯菌。HvKP和普通肺炎克雷伯菌(cKP)的不同之處在于前者不僅引起免疫力低下人群的感染，甚至還會引起健康人全身多個部位的感染，從感染部位蔓延到非感染部位，即形成“遠處轉移”，一旦HvKP形成耐藥，后果不堪設想。因此，鑒別肺炎克雷伯菌是否具有高毒力，不僅有助于臨床經驗性選擇抗菌藥物，便于個體化治療，而且對預防和控制HvKP引起的感染性暴發(fā)流行和院內感染有重要意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年1月至2019年1月本院各種臨床標本中分離出的592株肺炎克雷伯菌。同一患者的標本應來源于不同的感染部位，同一患者的同一部位反復感染標本認定為同一個標本。

1.2試劑與儀器

1.2.1儀器 VITEK 2 compact 全自動細菌鑒定儀、Viia 7型PCR擴增儀、DYY-6D型電泳儀、電泳槽和凝膠成像系統(tǒng)、HR003型DNA提取儀。

1.2.2試劑 GN鑒定卡、AST-GN13和AST-GN334藥敏卡及配套生長培養(yǎng)基、dNTP、TaqDNA聚合酶、1.0×PCR緩沖液、DNA標準帶、引物。

1.3方法和步驟

1.3.1菌株的分離培養(yǎng) 取材接種于血平板，經37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，觀察血平板上菌落的生長情況，當有足夠單個純菌落時，下一步進行高黏液型菌株的初步篩選；當菌落密集無法觀察到單個菌落時，挑取少量菌再接種于血平板37 ℃培養(yǎng)18～24 h再次觀察；當單個菌落過少無法檢測時，盡可能挑取多的菌在血平板上增菌，37 ℃培養(yǎng)18～24 h再次觀察。

1.3.2高黏液型肺炎克雷伯菌的初步篩選 菌株分離培養(yǎng)后，用接種環(huán)輕輕觸及肺炎克雷伯菌菌落并往上提拉，重復2次，若觀察到黏液絲形成并且長度大于5 mm，即可初步判斷為高黏液型表型陽性，初步篩選該菌株為高黏液型菌株，凍存于-80 ℃冰箱。

1.3.3PCR檢測血清莢膜分型 將初步篩選的HvKP送往深圳華大基因有限公司檢測，采用多重PCR技術擴增HvKP的莢膜血清型基因型(主要是K1、K57、K54、K20、K2和K5型)，根據參考文獻[2]設計引物，引物由上海生工生物有限公司合成，各引物相關信息見表1。

表1 莢膜血清型基因引物序列表

1.3.4藥敏試驗 采用VITEK 2 compact全自動細菌鑒定儀進行藥敏試驗，抗菌藥物有阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、頭孢西丁、亞胺培南、厄他培南、妥布霉素、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復方磺胺甲噁唑、替加環(huán)素。對產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)的菌株，采用雙紙片擴散法進行確證試驗(試劑為Oxoid公司贈品)，判定標準按美國臨床和實驗室標準協(xié)會2016版要求進行。質控菌株大腸埃希菌ATCC 25922(陰性對照)，肺炎克雷伯菌ATCC 700603(陽性對照)。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據分析處理。耐藥監(jiān)測數(shù)據由WHONET5.6導出統(tǒng)計。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，采用χ2檢驗進行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1菌株來源 從臨床標本中分離出的592株肺炎克雷伯菌菌株來源見表2。

表2 592株肺炎克雷伯菌菌株標本構成比[n(%)]

2.2HvKP菌株的莢膜血清型 從臨床分離的78株HvKP中經多重PCR鑒定的血清莢膜分型主要以K1、K2型為主，分別為36株(46.2%)和22株(28.2%)，有11株(14.1%)菌株未鑒定出分型，其他莢膜分型分別為K57型4株(5.1%)、K20型3株(3.8%)、K5型1株(1.3%)、K54型1株(1.3%)。

2.3藥敏試驗 藥敏試驗結果顯示，592株肺炎克雷伯菌有127株產ESBLs，具有多重耐藥性，具體的HvKP和cKP對不同抗菌藥物的耐藥率見表3。592株肺炎克雷伯菌檢測出127株多重耐藥菌株，其中78株HvKP中檢出多重耐藥菌株9株，占11.5%(9/78)；而514株cKP中檢出多重耐藥菌株118株，占23.0%(118/514)。HvKP對多數(shù)抗菌藥物的耐藥率明顯低于cKP。碳青霉烯類藥物亞胺培南和厄他培南對肺炎克雷伯菌有明顯的抑菌效果，HvKP和cKP對替加環(huán)素非常敏感，對其他抗菌藥物則表現(xiàn)出不同程度的耐藥。總的來說，HvKP對抗菌藥物的敏感性要比cKP好，K1、K2血清型肺炎克雷伯菌的黏液表型與黏液表型調節(jié)基因A(rmpA)密切相關，K1、K2血清型菌株多與rmpA共存。K1、K2血清型菌株是血流感染和肝膿腫的重要致病菌，在其他膿腫、尿路感染、菌血癥中比較常見，K1型菌株多見于肝膿腫，K1和K2型比率在其他感染中相近，黏液型菌株產ESBLs率及對多數(shù)抗菌藥的耐藥率低于非黏液型肺炎克雷伯菌。但值得注意的是，HvKP已出現(xiàn)多重耐藥菌株，并且耐藥趨勢有所上升。

表3 HvKP和cKP對臨床常用抗菌藥物的耐藥率比較(%)

3 討 論

細菌的致病性不僅取決于其毒力的強弱，還與入侵部位、機體的免疫力強弱及侵入機體的細菌數(shù)量多少密切相關。細菌的毒力主要表現(xiàn)在2個方面：一是病原體突破宿主屏障侵入機體的能力，稱為侵襲力；二是病原菌產生的毒素。侵襲力包括黏附素、侵襲性物質和莢膜等。肺炎克雷伯菌的致病性主要是其本身的莢膜結構所造成的。因為莢膜具有抵抗吞噬細胞吞噬能力和抵抗有害物質的損傷作用，并且分泌一層黏性物質附著于菌體形成保護作用，使細菌彼此間粘連，也可黏附于組織或細胞表面引起感染，有利于發(fā)揮致病作用。莢膜的成分因不同菌種而異，主要是葡萄糖與葡萄糖醛酸組成的聚合物，也可含多肽與脂質。肺炎克雷伯菌的莢膜結構成分主要是多糖，包括莢膜多糖(K抗原)和脂多糖(O抗原)等。根據K抗原至少可將其分成82個血清型[3]。而在血清莢膜分型中，造成人和動物嚴重侵襲性感染最為密切相關的血清莢膜分型主要是K1、K2和K5血清型[4]。

78株HvKP經多重PCR測定分型后得出K1和K2型分別為36株(46.2%)和22株(28.2%)，有11例未鑒定出分型，未能鑒定出分型的可能原因是目前的引物未能完全匹配或可能存在新的分型，這與殷紅蓮等[5]的報道較一致。有研究顯示，K1、K2是HvKP主要的血清莢膜分型，rmpA是位于180～220 kb大小的毒力質粒上控制生成胞外莢膜多糖的毒力基因之一，而K1和K2血清型菌株上大部分存在rmpA[6]。由于莢膜多糖(K抗原)是肺炎克雷伯菌最主要的毒力因子之一，具有抗吞噬、抗干燥及抵抗有害物質損傷的作用，因此，K1、K2血清莢膜型的HvKP比其他類型菌株毒力更強。由于目前多重PCR鑒別毒力血清莢膜型需要較長時間和較多成本，未來需要有更好的方法鑒別HvKP以縮短鑒定時間，獲得更好的治療效果。

本研究選用的18種抗菌藥物中，HvKP對多數(shù)抗菌藥的耐藥率均低于cKP，HvKP僅對磺胺類藥物復方磺胺甲噁唑的耐藥率達到20.6%，與cKP對復方磺胺甲噁唑的耐藥率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。HvKP對其他抗菌藥物的耐藥率均在20.0%以下，可見HvKP目前對大多數(shù)抗菌藥物的敏感性還是較好的，容易造成藥物敏感株易治療的假象，但是由于其具有的高毒力性質，常導致宿主病情進展惡化等。HvKP常見的臨床表現(xiàn)有：(1)易感人群及易感因素，與cKP比較，HvKP可感染既往健康且年輕的社區(qū)居民，故HvKP血流感染和肝膿腫多見于醫(yī)院門診就診者，男性多于女性。(2)轉移并發(fā)癥，HvKP具有侵襲性，容易轉移至其他部位引起新的感染。轉移可造成各種嚴重的肝外膿腫，骨、關節(jié)、肌肉、筋膜、皮膚軟組織、胸膜、前列腺、腎臟及脾臟均可受累，眼、腦膜、中樞神經系統(tǒng)和肺是最常見的轉移部位。(3)輔助診斷特點，實驗室病原學診斷方法可篩查出相應的病原體并進行相關分型，同時超聲和CT檢查用于臨床診斷HvKP肝膿腫效果較明顯。

本院目前累積的病例顯示，在血流感染和肝膿腫等疾病分離出HvKP的患者病情惡化迅速、兇險，嚴重影響臨床治療和預后判斷。HvKP產ESBLs率低于cKP，造成這種差異的原因仍然不明確，有可能是因為耐藥基因在轉變?yōu)楦叨玖陼r丟失或者HvKP菌株不能獲得藥物耐藥質粒[7],這種推論尚需進一步研究證實。同時，HvKP對碳青霉烯類藥物，如亞胺培南和厄他培南及四環(huán)素類藥物替加環(huán)素全部敏感，對β-內酰胺酶抑制藥物頭孢哌酮/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸和哌拉西林/他唑巴坦的敏感性較好，臨床用藥可以優(yōu)先考慮。但由于近年來抗菌藥物的濫用，造成耐藥率不斷上升，盡管目前HvKP對抗菌藥物的耐藥率還比較低，但因其具有的高毒力性，在臨床治療上還是不容樂觀[8-15]。雖然有些藥敏試驗結果顯示肺炎克雷伯菌對所有抗菌藥物全都敏感，但未考慮其可能具有的高毒力性，可能會誤導臨床上進行單種敏感藥物治療而影響治療效果和病情的預后及轉歸。

目前對已鑒定為HvKP的菌株一般給予三聯(lián)用藥或者考慮選擇新藥頭孢他啶/阿維巴坦，有較好的治療效果。因此，精確鑒別HvKP菌株，對臨床選擇合適的抗菌藥物治療有重要意義。