實(shí)時熒光定量PCR在B族鏈球菌產(chǎn)前檢查中的可行性分析

宦 宇，蔡徐山，齊結(jié)華，張春利，樂江漫

上海市嘉定區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，上海 201821

B族鏈球菌(GBS)也被稱為無乳鏈球菌，是一種革蘭陽性鏈球菌。孕產(chǎn)婦、新生兒等為高危易感人群，孕婦出現(xiàn)GBS感染往往會使胎兒發(fā)生宮內(nèi)窘迫、早產(chǎn)等，造成不良的妊娠結(jié)局并引發(fā)侵襲性疾病。GBS主要通過羊水或經(jīng)產(chǎn)道分娩傳播給新生兒，引起新生兒感染，導(dǎo)致新生兒發(fā)病甚至死亡[1]。目前，臨床上多采用普通細(xì)菌培養(yǎng)法對孕婦生殖道GBS進(jìn)行檢測，普通細(xì)菌培養(yǎng)是GBS檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但具有耗時長、靈敏度低、影響因素多等缺點(diǎn)；優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，臨床可以根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果采用個性化藥物治療?；诖?，本研究旨在探討實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)在孕晚期GBS感染檢測中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年7月至2020年2月到本院產(chǎn)前檢查，孕周為34～37周，年齡17～44歲的孕晚期孕婦共2 012例的陰道-肛周分泌物標(biāo)本進(jìn)行普通細(xì)菌培養(yǎng)及實(shí)時熒光定量PCR檢測。僅取陰道分泌物或僅取肛周分泌物的孕婦未納入統(tǒng)計。

1.2標(biāo)本采集 由醫(yī)生取材，用無菌拭子在孕婦陰道下1/3處旋轉(zhuǎn)取分泌物；另一根拭子在肛周旋轉(zhuǎn)取分泌物。2份標(biāo)本均需帶有上皮細(xì)胞。室溫保存，2 h內(nèi)送檢。

1.3材料與儀器 上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司的哥倫比亞血瓊脂平板；法國生物梅里埃公司的ATB全自動細(xì)菌分析儀；北京博爾誠公司的B族鏈球菌核酸檢測試劑盒；美國賽默飛公司的ABI 7500 實(shí)時熒光定量PCR儀。

1.4分析方法

1.4.1普通細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn) 1 241例標(biāo)本采用普通細(xì)菌培養(yǎng)檢測，將標(biāo)本接種于哥倫比亞血瓊脂平板，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h后，觀察菌落形態(tài)，挑取可疑菌落在血平板上進(jìn)行純培養(yǎng)，然后涂片、革蘭染色并鏡檢。革蘭陽性鏈球菌且觸酶試驗(yàn)陰性的做 CAMP 試驗(yàn)，同時用生物梅里埃公司ATB全自動細(xì)菌分析儀鑒定細(xì)菌，CAMP 試驗(yàn)和儀器鑒定均符合者判定為GBS。對普通細(xì)菌培養(yǎng)檢出陽性者用生物梅里埃公司的鏈球菌藥敏板條進(jìn)行GBS藥敏試驗(yàn)，操作步驟嚴(yán)格參照廠家說明書執(zhí)行。

1.4.2實(shí)時熒光定量PCR 828例采用實(shí)時熒光定量PCR檢測，DNA的提取方法和擴(kuò)增條件及分析方法嚴(yán)格參照博爾誠公司GBS核酸檢測試劑盒說明書操作。其中有57例用上述兩種方法同時檢測。陰道或肛周分泌物之一檢測出GBS即判定為GBS感染。

1.4.3不同菌液濃度對實(shí)時熒光定量PCR檢測的判定 取普通細(xì)菌培養(yǎng)GBS陽性0.5麥?zhǔn)蠁挝痪?約為1.5×108cfu/mL)，10倍梯度稀釋，直到103cfu/mL，取107、106、105、104、103cfu/mL 5種濃度梯度，同批次進(jìn)行檢測，每種濃度梯度4個重復(fù)，Ct值≤38，且有明顯S型擴(kuò)增曲線即判為陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩種檢測方法結(jié)果比較 1 241例普通細(xì)菌培養(yǎng)檢測標(biāo)本中陽性45例，檢出率為3.6%，828例實(shí)時熒光定量PCR檢測標(biāo)本中陽性79例，檢出率為9.5%，兩種方法陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=30.841,P<0.05)。既用普通細(xì)菌培養(yǎng)又用實(shí)時熒光定量PCR檢測的57例標(biāo)本中，3例實(shí)時熒光定量PCR陽性，而這3例中，有1例普通細(xì)菌培養(yǎng)陰性，即普通細(xì)菌培養(yǎng)只檢出2例陽性。

2.2藥敏試驗(yàn) 對普通細(xì)菌培養(yǎng)檢出陽性的45例標(biāo)本進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，GBS對青霉素、萬古霉素、頭孢噻肟、利奈唑胺均100%敏感，對喹奴普汀/達(dá)福普汀、氯霉素、左氧氟沙星、克林霉素、紅霉素、四環(huán)素的敏感率依次降低。見表1。

表1 45株GBS的藥敏試驗(yàn)結(jié)果(%)

2.3采樣部位對實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果的影響 對實(shí)時熒光定量PCR檢出陽性的79例標(biāo)本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，有26例陰道-肛周分泌物均檢出GBS，剩余53例僅檢出一種分泌物陽性的孕婦中，12例為陰道分泌物陽性，41例為肛周分泌物陽性。也就是說陰道分泌物陽性檢出率為4.6%(38/828)，占總陽性人數(shù)的48.1%(38/79)；肛周分泌物陽性檢出率為8.1%(67/828)，占總陽性人數(shù)的87.3%(69/79)；肛周分泌物陽性檢出率明顯高于陰道分泌物，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而陰道和肛周分泌物聯(lián)合檢測的陽性檢出率為9.5%(79/828)，占總陽性人數(shù)的100.0%(79/79)?？梢婈幍篮透刂芊置谖锿瑫r采樣可大大提高GBS的檢出率，陰道、肛周及陰道和肛周檢出率之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.647,P<0.05)。

2.4GBS濃度對實(shí)時熒光定量PCR檢測的影響 對0.5麥?zhǔn)蠁挝籊BS菌落梯度稀釋后檢測發(fā)現(xiàn)，除103cfu/mL菌液的實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果的Ct值>38外，其他濃度的Ct值均小于38，見圖1。也就是說，實(shí)時熒光定量PCR檢測GBS的Ct值隨菌液濃度降低而升高，可以檢測到菌液濃度最低是104cfu/mL。

圖1 不同濃度菌懸液PCR檢測的Ct值比較

3 討 論

GBS是條件致病菌，可正常寄居于人體的消化道與泌尿生殖道內(nèi)。2010年版美國疾控中心《圍產(chǎn)期GBS疾病預(yù)防指南》規(guī)定：在妊娠第35～37周取孕婦直腸陰道分泌物進(jìn)行GBS檢測，并對陽性和高危孕婦采用分娩期預(yù)防性抗菌藥物進(jìn)行干預(yù)。而在我國，中華醫(yī)學(xué)會起草的2011 版、2018 版《孕前和孕期保健指南》規(guī)定：均將GBS收納為備查項目。

本科室前期采用普通細(xì)菌培養(yǎng)檢測發(fā)現(xiàn)，GBS是本院檢出的僅次于糞腸球菌的第2大革蘭陽性致病菌[2]。世界各地區(qū)妊娠期婦女GBS檢出率不盡相同，澳大利亞檢出率約為12.0%[3]；西班牙當(dāng)?shù)厝焉锲趮D女為10.5%，而移民到西班牙的外國妊娠期婦女的檢出率為18.9%[4]；國內(nèi)文獻(xiàn)報道，南京地區(qū)的檢出率為3.65%[5]，北京地區(qū)為8.0%[6]，成都地區(qū)為7.6%[7]，廣西地區(qū)為10.7%[8]，貴州地區(qū)為12.6%[9]。本研究采用實(shí)時熒光定量PCR檢測GBS的檢出率為9.5%，這種差異可能與種族、飲食生活習(xí)慣、地區(qū)及檢測手段有關(guān)。

普通細(xì)菌培養(yǎng)是檢測GBS的金標(biāo)準(zhǔn)，其成本低，易開展，因此是國內(nèi)外大多數(shù)醫(yī)院采用的首選檢測方法，但普通細(xì)菌培養(yǎng)的缺點(diǎn)是培養(yǎng)周期長，靈敏度略低，且易受比如標(biāo)本的及時轉(zhuǎn)運(yùn)接種、陰道或肛門周圍雜菌、檢測人員的經(jīng)驗(yàn)等外界條件的影響，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，普通細(xì)菌培養(yǎng)GBS的檢出率為3.6%，而實(shí)時熒光定量PCR的檢出率為9.5%，后者檢出率明顯高于前者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)時熒光定量PCR是對GBS的特定DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增檢測，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，靈敏度和特異度高，受外界條件影響小，檢測時間短，且可以全程觀測擴(kuò)增過程；缺點(diǎn)是不能進(jìn)行藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)臨床個性化用藥。本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，GBS 對青霉素、萬古霉素、頭孢噻肟、利奈唑胺100%敏感，與大部分研究結(jié)果一致[10-13]。實(shí)時熒光定量PCR盡管有不能進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的弊端，但因GBS對青霉素和頭孢噻肟100%敏感，故可對實(shí)時熒光定量PCR檢出陽性的孕婦使用青霉素治療，對青霉素過敏者，可用頭孢噻肟治療，對青霉素和頭孢噻肟均過敏者建議補(bǔ)充普通細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)，給予個性化藥物治療。

GBS寄居在人體多個部位，本研究發(fā)現(xiàn)，僅陰道分泌物標(biāo)本GBS陽性檢出率為4.6%，僅肛周分泌物標(biāo)本的陽性檢出率為8.1%，而陰道-肛周分泌物標(biāo)本聯(lián)合檢測的檢出率為9.5%。這一結(jié)果提示，針對GBS的檢測，建議送檢陰道-肛周雙部位分泌物以提高檢出率。

常規(guī)拭子標(biāo)本送檢，從采樣、送檢到上機(jī)，這個過程可能要經(jīng)過1～2 d，有時為了能集中檢測，標(biāo)本等待上機(jī)的時間可能會更長。這些過程中由于細(xì)菌的死亡降解，GBS-DNA必然會損失，造成檢測假陰性發(fā)生。本研究對菌液濃度稀釋后的檢測結(jié)果提示，當(dāng)菌液濃度為103cfu/mL時，檢測結(jié)果為陰性，根據(jù)菌液濃度和檢測結(jié)果的趨勢規(guī)律，有理由判斷：當(dāng)菌液濃度低于103cfu/mL時，檢測結(jié)果均為陰性。張靜華等[14]研究發(fā)現(xiàn)，增菌培養(yǎng)可以提高GBS的檢出率。所以，引入增菌步驟是下一步研究的方向。

楊春年等[15]通過6種GBS檢測方法的經(jīng)濟(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，從成本-效果分析的角度看，實(shí)時熒光定量PCR的性價比最高。

綜上所述，采用實(shí)時熒光定量PCR檢測可以提高GBS的陽性檢出率，縮短檢測時間，該方法在GBS產(chǎn)前檢查中具有可行性，但應(yīng)注意多部位采樣并保證有足夠的采集量，以減少假陰性發(fā)生。