蒲公英甾醇對AFB1性肝損傷肉雞肝組織氧化應(yīng)激的影響

摘 要： 旨在探討蒲公英甾醇對黃曲霉毒素B1（AFB1）性肝損傷肉雞肝組織氧化應(yīng)激的影響。將120只肉雞隨機(jī)分成6組：空白組，模型組，蒲公英甾醇低、中、高劑量組（25、50、100 mg·kg－1 BW）及陽性組（300 mg·kg－1水飛薊賓）。除空白組飼喂基礎(chǔ)日糧外，其余各組飼喂含有0.5 mg·kg－1 AFB1的日糧，連續(xù)喂養(yǎng)21 d建立肉雞肝損傷模型，且每日在飲水中給予各組對應(yīng)濃度的藥物。試驗期間記錄各組肉雞體重和采食量并計算料重比；通過試劑盒檢測肉雞血清中肝功能指標(biāo)谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase， AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（gamma-glutamyltransferase， GGT）、總膽紅素（total bilirubin， TBIL）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）的含量；通過試劑盒檢測肉雞肝組織中活性氧（reactive oxygen species， ROS）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽（reduced glutathione， GSH）的含量；RT-qPCR法和Western blot法分別檢測肉雞肝中核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid2-related factor 2， Nrf2）、Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein ""Keap1）、血紅素氧合酶1（Heme Oxygenase- "HO-1）、NAD（P）H： 醌氧化還原酶1（NAD（P）H： Quinone oxidoreductase- "NQO1）mRNA及蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，蒲公英甾醇高劑量組在14、21 d可提高AFB1性肝損傷肉雞的體重（Plt;0.05）并降低料重比（Plt;0.05）；試驗21 d后，蒲公英甾醇高劑量組降低AFB1性肝損傷肉雞血清中肝功能指標(biāo)ALT（Plt;0.05）、AST（Plt;0.01）、GGT（Plt;0.01）、TBIL（Plt;0.01）和ALP（Plt;0.01）的活性；蒲公英甾醇高劑量組抑制AFB1性肝損傷肉雞肝中ROS和MDA含量（Plt;0.01），并提高SOD（Plt;0.01）、CAT（Plt;0.05）和GSH（Plt;0.05）活性；蒲公英甾醇高劑量組可上調(diào)AFB1性肝損傷肉雞肝中Nrf2（Plt;0.05）、NQO1（Plt;0.01）和HO-1（Plt;0.05）mRNA及蛋白表達(dá)水平，下調(diào)Keap1 mRNA（Plt;0.05）及蛋白表達(dá)水平。綜上，蒲公英甾醇可通過調(diào)控Nrf2/Keap1信號通路抑制肉雞肝中ROS、MDA的過量產(chǎn)生并提高抗氧化物SOD、CAT、GSH含量，增強(qiáng)肝抗氧化功能，且明顯改善肝功能并提高其生長性能，從而對AFB1誘導(dǎo)所致的氧化損傷具有明顯抑制作用。

關(guān)鍵詞： AFB1；蒲公英甾醇；肉雞；肝損傷；氧化應(yīng)激

中圖分類號：S858.31

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號： 0366-6964（2024）09-4141-12

Effect of Taraxasterol on Oxidative Stress in Liver Tissue of Broilers with AFB1 Induced

Liver Injury

LIU" Xinman "ZHOU" Hongyuan" SANG" Rui "GE" Bingjie3， YAN" Kexin3， WANG" Wei "YU" Minghong "LIU" Xiaotong "QIU" Qian "ZHANG" Xuemei1*

（1.Agricultural College of Yanbian University， Yanji 133002，" China;

2.Jilin Institute of

Vocational

Technology， Longjing 133400，" China;

3.College of Pharmacy，

Yanbian University， Yanji 133002，" China）

Abstract：" This study aimed to further explore the effect of taraxasterol on liver tissue oxidative stress cauesed by aflatoxin B1 （AFB1） in broiler chickens. One hundred and twenty broilers were randomly divided into six groups： normal group， model group， taraxasterol low-， medium- and high-dose groups （25， 50， 100 mg·kg-1 BW） and positive group （300 mg·kg-1 silibinin）. Except the normal group， which was fed a basal diet， the other groups were fed a diet containing 0.5 mg·kg-1 AFB1 for 21 consecutive days to establish a liver injury model， the corresponding concentrations of medication were administered daily in drinking water during this period to each group. The body weight of broilers in each group were recorded and the feed-to-gain ratios were calculated; Liver function indexes asaspartate aminotransferase （AST）， alanine aminotransferase （ALT）， gamma-glutamyltransferase （GGT）， total bilirubin （TBIL）， alkaline phosphatase （ALP） in broilers were determined by kits. The contents of reactive oxygen species （ROS）， malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT）， and glutathione （GSH） in broiler liver tissues were determined by kits. The expression of nuclear factor erythroid2-related factor 2 （Nrf2）， Kelch-like ECH-associated protein 1 （Keap1） and heme oxygenase-1 （Heme Oxygenase-1）， NAD（P）H： Quinone oxidoreductase-1 （NQO1） mRNA and protein in brolier liver were determined by RT-qPCR and Western blot. The results showed that the body weight was increased （Plt;0.05） and the feed-to-weight ratio was decreased （Plt;0.05） in broilers with AFB1-induced liver injury at 14 and 21 days in the high dose group of taraxasterol. After 21 days， it was shown by the results that the activities of ALT （Plt;0.05）， AST （Plt;0.01）， GGT （Plt;0.01）， TBIL （Plt;0.01）， and ALP （Plt;0.01）， which are indicators of hepatic function， were reduced in the serum of broilers with AFB1-induced liver injury in the high dose group of taraxasterol. ROS and MDA content were inhibited （Plt;0.01）， while SOD （Plt;0.01）， CAT （Plt;0.05） and GSH （Plt;0.05） activities were increased in the liver of broilers with AFB1-induced liver injury in the high dose group of taraxasterol. The mRNA and protein expression levels of Nrf2 （Plt;0.05）， NQO1 （Plt;0.01） and HO-1 （Plt;0.05） were up-regulated. The mRNA （Plt;0.05） and protein expression levels of Keap1 were down-regulated in the livers of broilers with AFB1-induced liver injury in the high dose group of taraxasterol. In conclusion， taraxasterol can inhibit the overproduction of ROS and MDA and increase the content of antioxidants SOD， CAT， and GSH in broiler liver by regulating the Nrf2/Keap1 signaling pathway， enhance the hepatic antioxidant function， and significantly improve the liver function and growth performance， which can have a significant inhibitory effect on the oxidative damage caused by the induction of AFB1.

Key words： AFB1; taraxasterol; broilers; liver injury; oxidative stress

*Corresponding author： ZHANG Xuemei， E-mail：zhangxm@ybu.edu.cn

黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）是黃曲霉和寄生曲霉等菌株產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)類毒素［1］，被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類致癌物［2］。AFT的衍生物約有20種，其中AFB1是糧食及飼料中黃曲霉毒素存在的主要形式，具有極強(qiáng)的致癌性和肝毒性［3-4］。國家質(zhì)檢總局規(guī)定，AFB1是大部分食品和飼料的必檢項目之一，2019年全國各地區(qū)1 202份飼料原料和全價料的檢測結(jié)果顯示，AFB1檢出率超過90%［5］。禽源性產(chǎn)品因其具有高蛋白質(zhì)、營養(yǎng)價值高且價格實惠等優(yōu)勢被眾多消費者喜愛，禽養(yǎng)殖業(yè)也隨之成為農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖中占比最大的行業(yè)之一［6］。研究顯示，家禽對AFB1的易感性較強(qiáng)，可導(dǎo)致肉雞生長遲緩，體重、采食量、飼料轉(zhuǎn)化率降低，蛋雞產(chǎn)蛋率下降等，嚴(yán)重影響雞的生產(chǎn)性能。由于肝是AFB1的主要靶器官和代謝器官，動物經(jīng)口攝入AFB1后不僅可以在肝中蓄積，還會在肝組織微粒體代謝酶的作用下活化形成毒性更強(qiáng)的AFBO，因此表現(xiàn)為強(qiáng)烈的肝毒性，嚴(yán)重制約禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展［7-8］。

多項研究表明，AFB1通過誘導(dǎo)肝中ROS的過度產(chǎn)生，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂類降解，從而引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致動物發(fā)生肝壞死、肝硬化、肝癌甚至死亡［9-10］。目前，AFB1的脫毒方法主要包括：物理方法（如浸泡、清洗、分揀、挑選、脫皮、碾磨、吸附以及萃取等）、化學(xué)方法（如有機(jī)酸處理、堿處理、氧化劑處理等）以及生物法（如微生物或酶制劑等），但尚無針對AFB1的特效防治藥物［11］。因此，亟需AFB1性肝損傷防治藥物的開發(fā)和應(yīng)用。蒲公英是一種多年生的藥食同源植物，富含礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分以及多糖、多酚、黃酮、萜類等生物活性物質(zhì)，其中蒲公英甾醇是蒲公英主要活性成分之一，是一種五環(huán)三萜類化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英甾醇在體內(nèi)外均表現(xiàn)出顯著的抗炎、抗氧化等藥理作用［12-13］。且本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英甾醇對藥物性肝損傷、免疫性肝損傷以及酒精性肝損傷均具有明顯的保護(hù)作用［14-15］，但其是否可以控制或緩解AFB1所致的肝損傷尚不清楚。因此，本試驗通過AFB1誘導(dǎo)建立肉雞肝損傷模型，探討蒲公英甾醇對AFB1性肝損傷肉雞肝組織氧化應(yīng)激的影響及其機(jī)制，為其作為AFB1性肝損傷防治藥物的研發(fā)及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

1日齡愛拔益加（AA）肉雞，購自吉林省吉牧源生物科技有限公司。雛雞入舍溫度在33～35℃，1周后可逐漸脫溫至25～28℃，相對濕度保持40%～60%，每日光照隨日齡逐漸減少直至12 h，保持空氣流通，自由采食、飲水的環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.1.2 試驗藥物

AFB1（純度gt;99%）購自青島普瑞邦生物工程有限公司；蒲公英甾醇（純度gt;97%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；水飛薊賓購自天津天士力圣特制藥有限公司。

1.1.3 主要試劑及儀器

甲醇、甲醛、無水乙醇、脫脂乳均購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購于Sigma公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）測定試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測定試劑盒、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）測試盒（微板法）、總膽紅素（T-BIL）試劑盒、堿性磷酸酶（ALP）測定試劑盒、活性氧（ROS）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測定試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；實時熒光定量PCR試劑盒、彩虹預(yù)染蛋白Maker、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液均購自TaKaRa公司；蛋白酶抑制劑（PMSF）、RIPA裂解液、漿蛋白與核蛋白的提取試劑盒、BCA法蛋白濃度檢測試劑盒、ECL發(fā)光顯色液均購自上海碧云天生物科技有限公司；Rabbit Anti-Nrf2 antibody、Rabbit Anti-KEAP1 antibody、Rabbit Anti-HO-1 antibody、Rabbit Anti-NQO1 antibody抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；β-actin抗體購自Abcam公司；酶標(biāo)儀、電泳儀、PCR儀均購自Bio-Rad公司；37℃恒溫箱購自Thermo公司；恒溫水浴鍋購自上海勝衛(wèi)電子科技有限公司。

1.2 AFB1污染飼料及藥物的制備

將AFB1溶解在甲醛溶液中配制成母液，再按適當(dāng)比例加入蒸餾水稀釋后噴灑于肉雞基礎(chǔ)日糧中，攪拌均勻，置于烘干箱中烘干，制成含有0.5 mg·kg－1 AFB1的日糧；蒲公英甾醇和水飛薊賓按照試驗所需濃度懸于0.25%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液配制成混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 AFB1性肝損傷肉雞模型的建立及給藥

將120只1日齡雛雞隨機(jī)平均分為6組，分別為空白組，模型組，蒲公英甾醇低、中、高劑量組和陽性對照組?？瞻捉M飼喂基礎(chǔ)日糧，其余各組飼喂含有0.5 mg·kg－1 AFB1的日糧，連續(xù)飼喂21 d。期間蒲公英甾醇低、中、高組在飲水中分別加入25、50、100 mg ·kg－1（BW）的蒲公英甾醇，陽性對照組加入300 mg·kg－1（BW）的水飛薊賓，連續(xù)給藥21 d，每次給藥前斷水2 h。

1.4 樣本采集與處理

末次給藥后進(jìn)行樣品采集（采樣前禁食12 h，自由飲水）。翅下靜脈采血，分離血清，置于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)分析血清肝功能指標(biāo)。采血后解剖肉雞，取肝組織保存于-80℃冰箱用于后續(xù)試驗。

1.5 肉雞生長性能

在給藥期間，分別記錄1～7 d、8～14 d、15～21 d各組肉雞的體重和采食量情況，計算各階段肉雞的料重比。料重比=總采食量（kg）/同期增重（kg）；

1.6 肉雞血清肝功能指標(biāo)的檢測

取血清，分別按照對應(yīng)檢測試劑盒中說明書方法檢測各組肉雞血清中的AST、ALT、GGT、TBIL、ALP的含量，操作方法按照AST、ALT、GGT、TBIL、ALP檢測試劑盒中的說明書進(jìn)行。

1.7 肉雞肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)及抗氧化物的檢測

通過試劑盒檢測肉雞肝組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS的含量：取肉雞肝組織制備單細(xì)胞懸液，向細(xì)胞沉淀中加入稀釋好的DCFH-DA探針，重懸細(xì)胞后，培養(yǎng)箱孵育1 h，離心，去上清，洗滌，重懸細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡下觀察。取肝組織制備勻漿，并按比例稀釋成10%的組織勻漿，離心后收集上清液。BCA法檢測肝組織中勻漿蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值和濃度得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各試驗組樣品的蛋白濃度。取肉雞肝組織勻漿，分別檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA及抗氧化物CAT、SOD、GSH含量，操作方法按照MDA、CAT、SOD、GSH檢測試劑盒中的說明書進(jìn)行。

1.8 RT-qPCR法檢測Nrf2/Keap1信號通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)

TRIzol法提取肉雞肝組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄說明書配制反應(yīng)液，將提取的總RNA作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank上公布的雞Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1和β-actin的序列，應(yīng)用軟件Primer 6.0設(shè)計引物，由上海生工生物工程公司合成，引物信息見表1。反應(yīng)體系（20 μL）：cDNA 2 μL，2×SYBGREEN 10 μL，Sense primer（2 μmol·L－1）、Antisense primer（2 μmol·L－1）各1 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算各個基因的相對表達(dá)量。

1.9 Western Blot法檢測Nrf2/Keap1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取肝組織，提取總蛋白、核蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。將總蛋白或核蛋白加入樣品緩沖液混勻，在沸水中煮，使蛋白質(zhì)變性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，截取目的條帶，裁剪PVDF膜并用甲醇激活，置于冰盒上轉(zhuǎn)膜；TBST洗膜3次，封閉液（5%脫脂乳）封閉1 h，TBST再洗膜3次；Rabbit Anti-Nrf2、Anti-KEAP1、Anti-HO-1、Anti-NQO1抗體用TBST按照說明書建議比例稀釋，將PVDF膜放入其中，4℃孵育過夜；一抗孵育后，洗膜3次；將PVDF膜放入稀釋的Goat Anti-Rabbit IgG Hamp;L/HRP抗體中，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次；按1∶1比例將ECL顯色液A液與B液混勻，加入到裝有PVDF膜的自封袋中，放入顯影儀中拍照，顯影后使用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.10 數(shù)據(jù)分析

試驗所得結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素ANOVA方差分析，LSD法多重比較，Plt;0.01表示有極顯著差異、Plt;0.05表示有顯著差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蒲公英甾醇對AFB1性肝損傷肉雞生長性能的影響

如表2所示，與空白組相比，模型組肉雞體重在7、14 d時均顯著降低（Plt;0.05），在21 d時極顯著降低（Plt;0.01）；與模型組相比，蒲公英甾醇中劑量組肉雞體重在21 d時顯著增加（Plt;0.05），蒲公英甾醇高劑量組肉雞體重在14、21 d時顯著增加（Plt;0.05）。肉雞采食量結(jié)果如表3所示，與空白組相比，模型組肉雞采食量在7、14、21 d時均顯著下降（Plt;0.05）；與模型組相比，蒲公英甾醇中劑量組肉雞采食量在21 d時顯著增加（Plt;0.05），蒲公英甾醇高劑量組肉雞采食量在14、21 d時顯著增加（Plt;0.05）。肉雞體重料重比結(jié)果如表4所示，與空白組相比，模型組料重比在14、21 d均顯著升高（Plt;0.05）；與模型組相比，蒲公英甾醇高劑量組料重比在14、21 d顯著降低（Plt;0.05）。結(jié)果表明，AFB1可導(dǎo)致肉雞生長性能降低，而蒲公英甾醇中、高劑量組可明顯提高其生長性能。

2.2 蒲公英甾醇對AFB1性肝損傷肉雞血清肝功能指標(biāo)的影響

通過相應(yīng)試劑盒檢測血清中ALT、AST、GGT、TBIL和ALP的含量。結(jié)果如表5所示，與空白組相比，模型組肉雞血清中AST、GGT、TBIL和ALP活性均極顯著升高（Plt;0.01），ALT活性顯著升高（Plt;0.05）；與模型組相比，蒲公英甾醇低劑量組GGT活性極顯著降低（Plt;0.01），AST活性顯著降低（Plt;0.05），蒲公英甾醇中劑量組GGT活性極顯著降低（Plt;0.01），ALT、AST、TBIL和ALP活性均顯著降低（Plt;0.05），蒲公英甾醇高劑量組GGT、AST、TBIL和ALP活性均極顯著降低（Plt;0.01），ALT活性顯著降低（Plt;0.05）。結(jié)果表明蒲公英甾醇可明顯改善AFB1所致肉雞血清中肝功能指標(biāo)水平。

2.3 蒲公英甾醇對AFB1性肝損傷肉雞肝中氧化應(yīng)激指標(biāo)及抗氧化物的影響

通過試劑盒檢測肉雞肝組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、MDA及抗氧化物CAT、SOD、GSH的含量。ROS檢測結(jié)果如圖1和圖2所示，與空白組相比，模型組平均熒光強(qiáng)度極顯著升高（Plt;0.01）；與模型組相比，蒲公英甾醇低劑量組ROS平均熒光強(qiáng)度顯著降低（Plt;0.05），蒲公英甾醇中、高劑量組ROS平均熒光強(qiáng)度極顯著降低（Plt;0.01）。MDA、CAT、SOD、GSH檢測結(jié)果如表6所示，與空白組相比，模型組CAT、SOD、GSH活性均極顯著降低（Plt;0.01），MDA活性顯著升高（Plt;0.05）；與模型組相比，蒲公英甾醇中劑量組CAT、SOD、GSH活性均顯著升高（Plt;0.05），蒲公英甾醇高劑量組CAT、SOD活性極顯著升高（Plt;0.01），MDA含量顯著降低（Plt;0.05），GSH活性顯著升高（Plt;0.05）。結(jié)果表明，蒲公英甾醇可降低AFB1性肝損傷肉雞肝組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的含量并提高抗氧化物的含量，增強(qiáng)肝抗氧化能力。

2.4 蒲公英甾醇對AFB1性肝損傷肉雞肝Nrf2/Keap1通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

提取各試驗組肝組織總RNA，通過RT-qPCR法測定Nrf2、Keap1、NQO1和HO-1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如圖3所示，與空白組相比，模型組Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA表達(dá)量均極顯著降低（Plt;0.01），Keap1 mRNA表達(dá)量顯著升高（Plt;0.05）；與模型組相比，蒲公英甾醇中劑量組Keap1 mRNA表達(dá)量顯著降低（Plt;0.05），NQO1、HO-1 mRNA表達(dá)量顯著升高（Plt;0.05），蒲公英甾醇高劑量組NQO1 mRNA表達(dá)量極顯著升高（Plt;0.01），Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)量顯著升高（Plt;0.05），Keap1 mRNA表達(dá)量顯著降低（Plt;0.05）。結(jié)果表明，蒲公英甾醇可調(diào)控AFB1所致肉雞肝Nrf2/Keap1通路關(guān)鍵基因mRNA的表達(dá)量。

2.5 蒲公英甾醇對AFB1性肝損傷肉雞肝Nrf2/Keap1通路蛋白表達(dá)的影響

提取各試驗組肝組織總蛋白及核蛋白，通過Western blot檢測核蛋白中Nrf2、Keap1以及總蛋白中HO-1、NQO1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖4所示，與空白組相比，模型組Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達(dá)量極顯著降低（Plt;0.01），Keap1蛋白表達(dá)量極顯著升高（Plt;0.01）。與模型組相比，蒲公英甾醇低劑量組Nrf2蛋白表達(dá)量極顯著升高（Plt;0.01）；蒲公英甾醇中劑量組Nrf2、NQO1蛋白表達(dá)量極顯著升高（Plt;0.01），Keap1蛋白表達(dá)量極顯著降低（Plt;0.01），HO-1蛋白表達(dá)量顯著升高（Plt;0.05）；蒲公英甾醇高劑量組Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達(dá)量極顯著升高（Plt;0.01），Keap1蛋白表達(dá)量極顯著降低（Plt;0.01）。結(jié)果表明，蒲公英甾醇通過調(diào)控AFB1所致肉雞肝Nrf2/Keap1信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)肉雞肝的抗氧化能力。

3 討 論

隨著禽養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，家禽產(chǎn)業(yè)也面臨了更多的挑戰(zhàn)及問題。食用AFB1污染的飼料會使家禽營養(yǎng)不良、體重下降等，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［16-17］。因此，除了嚴(yán)格把控飼料質(zhì)量，防止飼料被AFB1污染外，目前的關(guān)鍵問題是尋求安全有效的藥物來應(yīng)對或控制AFB1中毒。本研究通過給肉雞食用AFB1污染的飼料進(jìn)行染毒建模，符合日常飼養(yǎng)過程中肉雞AFB1中毒的方式，以此探究蒲公英甾醇對AFB1性肝損傷肉雞肝組織氧化應(yīng)激的影響及其機(jī)制。

動物的生長性能與畜禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益息息相關(guān)，肉雞生長性能降低主要與營養(yǎng)物質(zhì)的代謝有關(guān)。AFB1損害肉雞生長發(fā)育的主要機(jī)制是抑制蛋白質(zhì)的吸收合成，改變腸道結(jié)構(gòu)、損傷腸道黏膜從而使肉雞的生長受限［18］。王勇等［19］研究表明，與正常組相比飼喂含0.1 mg·kg－1 AFB1日糧的肉雞，平均日增重與平均日采食量均有所降低。Zhao等［20］報道，攝入1 mg·kg－1 AFB1飼糧21 d后肉雞體重增幅顯著降低。本試驗結(jié)果表明，AFB1可明顯降低肉雞的體重，提高料重比，而蒲公英甾醇能夠使AFB1誘導(dǎo)的肉雞體重恢復(fù)正常水平，降低料重比，說明蒲公英甾醇對AFB1性肝損傷肉雞的生長性能具有一定改善作用。

攝入AFB1容易導(dǎo)致動物機(jī)體肝損傷并改變血清中酶類活性［21］。ALT和AST的活性是反映肝實質(zhì)損害最重要的指標(biāo)，與肝損傷程度呈正比。TBIL是反映膽紅素代謝及膽汁淤積的指標(biāo)，也是間接膽紅素與直接膽紅素之和。血清中的GGT主要來源于肝，當(dāng)肝受損、膽汁排出受阻時，血清中的GGT會增高，GGT測定主要用于肝膽疾病的診斷。ALP是膽汁淤積的經(jīng)典標(biāo)志，在毛細(xì)膽管和其他組織中高度富集。AFB1污染肝細(xì)胞后，刺激肝細(xì)胞的代謝，隨著毒素濃度增加，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，肝細(xì)胞的代謝功能逐漸減弱。由此可見，血清中酶活性變化是評估動物損傷程度的可靠性依據(jù)［22］。嚴(yán)文瑞等［23］研究表明，AFB1使雞血清中ALT和AST含量升高。本試驗結(jié)果表明肉雞連續(xù)飼喂AFB1后，血清中ALT、AST、GGT、ALP、TBIL均出現(xiàn)異常變化，而蒲公英甾醇可在一定程度上改善生化指標(biāo)，說明其具有改善肝功能的作用。

當(dāng)攝入有毒物質(zhì)或受刺激時體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，會產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)危害機(jī)體健康。AFB1中毒后ROS產(chǎn)量增加可能是由于AFB1生物轉(zhuǎn)化為高活性代謝物AFBO和自由基而導(dǎo)致氧化損傷［24］。脂質(zhì)過氧化是氧化損傷的一種常見表現(xiàn)，被認(rèn)為是氧化應(yīng)激引起細(xì)胞損傷的標(biāo)志，ROS會使脂質(zhì)發(fā)生過氧化并生成MDA，是脂質(zhì)過氧化的檢測標(biāo)準(zhǔn)。SOD是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化酶，除了能有效清除體內(nèi)的自由基，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用，在肝損傷的研究中具有極大的作用。CAT在肝中以高濃度存在，具有清除生物內(nèi)體自由基等作用，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一［25］。GSH是細(xì)胞內(nèi)最主要的抗氧化物質(zhì)，能幫助保持正常的免疫系統(tǒng)功能，并具有抗氧化作用、整合解毒作用，可以保護(hù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。因此，ROS、MDA以及抗氧化物SOD、CAT、GSH的含量在確定AFB1中毒的嚴(yán)重程度方面非常重要，本試驗中肉雞食用AFB1污染飼料后，肝組織中ROS和MDA含量顯著升高，SOD、CAT、GSH含量降低，而蒲公英甾醇能夠抑制ROS、MDA的過量產(chǎn)生，提高SOD、CAT、GSH含量。說明蒲公英甾醇能夠抑制肉雞肝中自由基的產(chǎn)生，提高抗氧化物的含量，從而抑制AFB1誘導(dǎo)所致的肝氧化應(yīng)激反應(yīng)。

AFB1可導(dǎo)致肝中ROS大量生成，從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。Nrf2/HO-1是體內(nèi)最重要的抗氧化防御系統(tǒng)和生存通路之一，其中Nrf2在該通路中起核心作用。在生理條件下，Nrf2通過與其負(fù)調(diào)控因子Keap1結(jié)合而定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到ROS等氧化還原信號刺激，Keap1與ROS發(fā)生反應(yīng)，使Keap1與Nrf2解離。Nrf2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，在細(xì)胞核中依次與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，并誘導(dǎo)Nrf2磷酸化，觸發(fā)抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶及應(yīng)急蛋白等基因的表達(dá)，維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)。竇彩霞等［26］研究表明，具有抗氧化活性的飼料添加劑通過激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路可啟動下游多種靶蛋白的表達(dá)，從而提高畜禽的抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激。本試驗結(jié)果表明，蒲公英甾醇可上調(diào)Nrf2及其相關(guān)靶基因HO-1、NQO1 mRNA和蛋白的表達(dá)，下調(diào)相關(guān)靶基因Keap1 mRNA和蛋白的表達(dá)，說明蒲公英甾醇可通過調(diào)控Nrf2/Keap1信號通路提高AFB1性肝損傷肉雞肝的抗氧化功能。

4 結(jié) 論

蒲公英甾醇可通過調(diào)控Nrf2/Keap1信號通路抑制ROS、MDA在肉雞肝組織中過量產(chǎn)生、提高抗氧化物SOD、CAT、GSH含量而增強(qiáng)肝抗氧化功能，且顯著改善肉雞的肝功能并提高其生長性能，對AFB1誘導(dǎo)所致的氧化損傷具有明顯抑制作用，為蒲公英甾醇作為AFB1性肝損傷防治藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)，促進(jìn)禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

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（編輯 范子娟）