基于酶促重組酶擴(kuò)增的非洲豬瘟病毒檢測方法

摘 要： 建立基于酶促重組酶擴(kuò)增（enzymatic recombinase amplification， ERA）技術(shù)的非洲豬瘟病毒（African swine fever virus， ASFV）核酸快速檢測方法。針對ASFV B646L基因保守序列，設(shè)計(jì)特異性的ERA探針和引物，經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立等溫條件下檢測ASFV DNA的ERA方法。結(jié)果顯示：建立的ERA檢測ASFV方法特異性強(qiáng)與其它病原無交叉反應(yīng)；CV均小于10%，具有良好的重復(fù)性；對陽性樣品拷貝數(shù)的檢測下限為85 copies·μL-1；與世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）非洲豬瘟qPCR診斷方法對比，Kappa值為0.96 具有高度一致性。本研究建立的基于ERA檢測ASFV方法可以用于ASFV的現(xiàn)場快速檢測。

關(guān)鍵詞： 非洲豬瘟病毒；ERA；核酸檢測；等溫?cái)U(kuò)增

中圖分類號：S852.659.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號： 0366-6964（2024）09-4226-06

A Detection Method of African Swine Fever Virus based on Enzymatic Recombinase

Amplification

FENG" Lu "TIAN" Hong2*， ZHENG" Haixue2*， SHI Zhengwang2， LUO" Juncong2， ZHANG

Xiaoyang2， WEI" Juanjuan2， ZHOU" Jing2， LIAO" Huancheng2， WANG" Wanying1

（1.College of Life Science and Engineering， Northwest Minzu University， Lanzhou 730000，

China;

2.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention/College of

Veterinary Medicine， Lanzhou University/Lanzhou Veterinary Research

Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences，

Lanzhou 730000，" China）

Abstract：" This experiment was conducted to establish a rapid nucleic acid detection method for African swine fever virus （ASFV） based on enzymatic recombinase amplification （ERA）. We designed ERA probes and primers specific for the conserved sequence of ASFV B646L gene， and optimized the reaction conditions in order to establish an ERA method for the detection of ASFV DNA under isothermal conditions. The ERA method for ASFV demonstrated high specificity and no cross-reaction with other pathogens; the CV was less than 10%， indicative of good reproducibility. The lowest detection limit for the ERA method is 85 copies·μL-1; comparison with the World Organization for Animal Health （WOAH） recommended qPCR diagnostic method for African swine fever （ASF） demonstrated a Kappa value of 0.96 "suggestive of high identity with African swine fever qPCR diagnostic method. ERA-based method for the detection of ASFV can be used for the rapid detection of ASFV in the field.

Key words： African swine fever virus; ERA; Nucleic acid detection; Isothermal amplification

*Corresponding authors：" TIAN Hong， E-mail： tianhong@caas.cn; ZHENG Haixue， E-mail： zhenghaixue@caas.cn

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是一種由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的急性、高度傳染性和致命性的傳染病。WOAH將其列為法定報(bào)告的動物疾病，中國將其列為I類動物流行?。?］。ASFV是Asfarviridae家族的唯一成員，也是唯一已知的DNA蟲媒病毒，軟蜱（Ornithodoros soft ticks）是它的中間宿主［2］。ASFV是一種直徑為 200 nm 的二十面體 DNA 病毒，包括包膜、衣殼、內(nèi)囊膜、核心殼和內(nèi)核。病毒基因組是一種線性的170～190 kb長的雙鏈DNA分子，具有共價(jià)閉合的末端，編碼大約200種蛋白［3-4］。2018年8月，我國正式發(fā)布非洲豬瘟疫情通告［5］，隨后迅速傳至全國各地，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。

目前，尚無商品化疫苗來預(yù)防和控制ASF，因此需要通過有效的檢測方法進(jìn)行防控。ASFV常見的診斷靶點(diǎn)有p30、p54和p72蛋白等［6］。ASFV抗原主要的檢測方法包括病毒分離（virus isolation， VI）結(jié)合紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)（hemadsorption， HAD）檢測、ELISA、PCR和等溫?cái)U(kuò)增（isothermal amplification， IA）等。IA一般借助恒溫反應(yīng)模式以及多個反應(yīng)酶的相互作用來引導(dǎo)核酸擴(kuò)增，IA在裝置簡單性、檢測快速性、操作便捷性及成本低廉性等方面，具有若干顯著優(yōu)勢，尤其適合于現(xiàn)場即時(shí)核酸檢測［7］。IA技術(shù)現(xiàn)已發(fā)展出很多分支，如基于核酸序列的擴(kuò)增（nuclear acid sequence-based amplification， NASBA）、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）、鏈置換擴(kuò)增（strand displacement amplification， SDA）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification， RPA）、滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification， RCA）［8］和酶促重組等溫?cái)U(kuò)增（enzymatic recombinase amplification， ERA）等。ERA是國內(nèi)自主研發(fā)的一種新型IA技術(shù)，該技術(shù)與RPA具有相似之處，不同點(diǎn)在于其反應(yīng)所依賴的重組酶來源于低溫噬菌體，進(jìn)行了工程化改造對特定位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行替換，讓反應(yīng)變得更快，具有良好的擴(kuò)增速度和特異性［9］。p72蛋白是ASFV主要的核衣殼蛋白，產(chǎn)生在病毒感染后的晚期，其免疫原性好、保守性較強(qiáng)，具有高度抗原性和免疫原性，常常用于診斷和疫苗研制［10］。因此本研究基于編碼ASFV p72蛋白的B646L基因建立了用于快速檢測ASFV的ERA方法，適用于ASFV現(xiàn)場便攜式檢測。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

熒光型核酸擴(kuò)增試劑盒（ERA法）購自蘇州先達(dá)基因科技有限公司，貨號KS103；DNA提取試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek公司（美國），貨號D3892-02；RNA提取試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek公司（美國），貨號R6874-02；2× Pro Taq HS Probe Premix購自艾科瑞生物工程有限公司（中國 長沙），貨號A3A0766。

1.2 臨床樣品

豬瘟病毒（CSFV）、口蹄疫病毒（FMDV）、塞內(nèi)卡病毒（SVA）、Ⅱ型豬圓環(huán)病毒（PCV-2）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和偽狂犬病毒（PRV）的滅活抗原由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。20份ASFV陽性樣品、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒（8.5×107copies·μL-1）和40份ASFV陰性樣品由非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒?yàn)室（蘭州）提供。

1.3 引物和探針

根據(jù)GenBank公布的ASFV-SY18（MH766894）基因序列和ERA試劑盒提供的參考意見設(shè)計(jì)引物和探針，再通過BLAST比對設(shè)計(jì)的引物和探針的特異性，送寶生物工程（大連）有限公司合成標(biāo)記。經(jīng)Oligo7軟件評分及BLAST篩選設(shè)計(jì)引物和探針：pK205R-Probe： CCTTCGGCGAGCGCTTTATCAC-CATAAAGCT（FAM-dT）（THF）CA（BHQ1-dT）CGCAAAAGGAT-C3-spacer；pK205R-R： CATGGT-TTAAAGCGTATATTGCGTCTACTGG；pK205R-F1： CGTGAACCTTGCTATTCCCTCAGTATCCAT；pK205R-F2： CTTGCTATTCCCTCAGTATCCA-TTCCCTTC；pK205R-F3： CTTGCTATTCCCTC-AGTATCCATTCCCTTCG。

1.4 ERA方法篩選引物

通過ERA方法進(jìn)行引物篩選，以得到效果更好的引物對。ERA的反應(yīng)體系為50.0 μL：溶解劑20.0 μL，正/反向引物（10 μmol·L-1）各2.1μL，熒光探針（10 μmol·L-1）0.6 μL，DNA模板3.0 μL，ddH2O 21.2 μL，激活劑2.0 μL。反應(yīng)條件為40 ℃ 20 min，30 s收集一次FAM信號。

1.5 ERA方法優(yōu)化反應(yīng)溫度

按照ERA試劑盒說明書推薦的37～42 ℃的反應(yīng)溫度區(qū)間逐級進(jìn)行優(yōu)化，篩選最佳反應(yīng)溫度。

1.6 ERA方法特異性試驗(yàn)

核酸提?。菏褂肈NA提取試劑盒提取ASFV、PCV-2、PRV核酸；RNA提取試劑盒提取CSFV、SVA、FMDV、PEDV、PRRSV核酸。

使用ERA方法檢測CSFV、SVA、FMDV、PCV-2、PEDV、PRRSV、PRV和ASFV陽性核酸樣品和ASFV陰性核酸樣品，試劑盒內(nèi)陽性標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對照，ddH2O為空白對照，評價(jià)該方法特異性。

1.7 ERA方法重復(fù)性試驗(yàn)

使用ERA方法檢測從20份已經(jīng)通過qPCR檢測過的陽性樣品中挑取的10份包含低中高Ct值的ASFV陽性樣品（Ct值為16.21～35.22），每個樣品檢測3次，計(jì)算其變異系數(shù)（CV）以評價(jià)該方法特異性。

1.8 ERA方法靈敏性試驗(yàn)

ERA分別檢測以104～108倍梯度稀釋的ASFV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒（8.5×107 copies·μL-1），對比其檢測結(jié)果以評價(jià)ERA檢測方法的靈敏性。

1.9 ERA方法對臨床樣本檢測

使用ERA方法和WOAH提供的qPCR檢測方法［11-12］，分別檢測20份ASFV陽性樣品和40份ASFV陰性樣品，將2種方法的結(jié)果進(jìn)行對比分析，計(jì)算Kappa值［13］。

2 結(jié) 果

2.1 引物篩選

當(dāng)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（cycle number）最低，熒光值最大即為效果最好的引物。其中，F(xiàn)1引物熒光值最大達(dá)到1183.47（RFU），遠(yuǎn)高于F2和F3引物的895.31和860.88（RFU）。根據(jù)結(jié)果選擇F1引物。

2.2 反應(yīng)溫度優(yōu)化

以到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)Ct值最低為篩選標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)極差分析后最終選擇38℃為反應(yīng)溫度。

2.3 特異性試驗(yàn)

對CSFV、FMDV、SVA、PCV-2、PEDV、PRRSV、PRV和ASFV的陽性核酸樣品進(jìn)行ERA檢測，ddH2O為空白對照。結(jié)果（圖1）顯示，該方法對其他7種病毒的陽性核酸無特異性擴(kuò)增，表明該方法具有較強(qiáng)的特異性。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

以10份ASFV陽性樣品作為模板，進(jìn)行3次ERA擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果顯示，其CV均lt;10%，重復(fù)性較好（表1），但所構(gòu)建的方法僅適用非洲豬瘟的定性試驗(yàn)。

2.5 靈敏性試驗(yàn)

將拷貝數(shù)為8.5×107的ASFV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒以104～108梯度稀釋，使用ERA方法檢測（圖2），結(jié)果顯示，最多能檢測到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒106稀釋倍數(shù)，計(jì)算得到檢測下限在85 copies·μL-1。

2.6 臨床樣本檢測

用ERA方法和WOAH提供的qPCR方法分別檢測20份陽性樣品和40份陰性樣品。ERA檢測結(jié)果為19份陽性和41份陰性，qPCR檢測結(jié)果為20份陽性和40份陰性，根據(jù)Kappa值計(jì)算公式，本研究建立的檢測方法的檢測結(jié)果與WOAH方法檢測結(jié)果的Kappa值為0.961（表2）。證明所構(gòu)建的方法適合非洲豬瘟的定性試驗(yàn)。

3 討 論

本研究所構(gòu)建的ERA檢測ASFV方法需要注意的有：設(shè)計(jì)引物和探針時(shí)在遵守引物設(shè)計(jì)原則的情況下還有特殊要求，例如引物長度，探針插入的基團(tuán)等，需要參照廠家給出的設(shè)計(jì)意見進(jìn)行設(shè)計(jì)；試劑盒中的激活劑應(yīng)在最后加入反應(yīng)管，并且因?yàn)镋RA方法反應(yīng)十分迅速，在加入激活劑后必須馬上進(jìn)行擴(kuò)增以及采集熒光信號。

本研究基于ASFV p72蛋白的基因序列設(shè)計(jì)并篩選了引物和探針，并參照試劑盒說明書進(jìn)行了溫度優(yōu)化，按優(yōu)化后的條件進(jìn)行特異性、重復(fù)性、靈敏性以及一致性的評估。研究結(jié)果表明，所構(gòu)建的ERA檢測ASFV方法特異性良好，重復(fù)性檢測中CV在10%以下，靈敏性檢測最低能檢測到85 copies·μL- 與WOAH提供的qPCR檢測方法相比，Kappa值為0.961。綜上所述，本研究結(jié)果為ASFV檢測提供一種新方法，操作簡單，設(shè)備要求低，檢測時(shí)間短，適用于現(xiàn)場檢測，為今后ASFV的ERA檢測打下良好技術(shù)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

基于編碼ASFV p72蛋白的B646L基因建立了用于快速檢測ASFV的ERA方法，該方法特異性、重復(fù)性、靈敏性良好，適用于ASFV現(xiàn)場便攜式檢測。

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（編輯 白永平）