高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗過程中肝臟能量代謝特征的研究

摘 要： 本研究旨在通過建立胰島素抵抗全過程的小鼠模型，研究在這個(gè)過程中，肝內(nèi)線粒體功能和能量代謝的變化情況。試驗(yàn)選取60只雄性C57BL6小鼠，隨機(jī)選取30只飼喂普通維持飼料作為對(duì)照組（Con組），另外30只飼喂高脂飼料作為高脂飲食組（HFD組）進(jìn)行造模，分別于飼喂的第4、6、8、10和12周，各組隨機(jī)選取6只小鼠進(jìn)行處理，經(jīng)胰島素抵抗評(píng)估和病理組織學(xué)檢查確認(rèn)成功建立胰島素抵抗全過程的模型。在第8和12周，采集鼠尾血液，進(jìn)行葡萄糖耐受試驗(yàn)（glucose tolerance tests， IGTT）和胰島素耐受試驗(yàn)（insulin tolerance tests，ITTs）。在第4、6、8、10和12周，采集小鼠的血清和肝組織樣品進(jìn)行試驗(yàn)：1）檢測(cè)空腹血糖和血清含量；2）ELISA法檢測(cè)肝組織中的Srebp-1c酶、PFK1 和COX-Ⅰ含量；3）生化檢測(cè)血清中的ALT和AST含量；4）Western blot法檢測(cè)肝組織中的PI3K、Akt、P-Akt、GLUT4、GSK-3β、P-GSK-3β、FOXO1、P-FOXO1、SIRT1、AMPK、P-AMPK、PGC-1α蛋白表達(dá)量；5）采用透射電鏡、HE染色、油紅O染色、PAS染色檢測(cè)肝病理組織和結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明：1）12周的高脂日糧引起小鼠肥胖、HOMA-IR增加，油紅O染色顯示，明顯的脂肪沉積，成功誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗全過程模型；2）胰島素抵抗過程中，小鼠ALT和AST增加，HE結(jié)果顯示，明顯的脂滴空泡、肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂；3）在飼喂高脂日糧的第4周之后，肝胰島素上游信號(hào)開始受到影響；4）與Con-6組相比，HFD-6組小鼠肝內(nèi)的GLUT4蛋白表達(dá)量和P-FOXO1/FOXO1比值、PFK1含量顯著下降（P＜0.01）；與Con-4組相比，HFD-4組小鼠肝內(nèi)的GSK-3β磷酸化、Srebp-1c酶水平逐漸降低（P＜0.05）；PAS結(jié)果顯示從第8周開始，HFD組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)糖原含量減少；5）與Con-4組相比，HFD-4組小鼠肝的AMPK、P-AMPK、SIRT1含量顯著降低（P＜0.01和P＜0.001）；6）HFD組小鼠肝中Mfn2在第10周出現(xiàn)上升，Drp1蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)；7）與HFD-6組相比，HFD-6組小鼠肝中的PINK1和Parkin蛋白明顯下降（P＜0.05）。綜上表明，肝作為代謝的主要器官，在飼喂60%高脂飼料后，會(huì)發(fā)生選擇性胰島素抵抗，在抵抗后整體上能量分解代謝減弱、線粒體損傷增強(qiáng)，而清除損傷線粒體的自噬功能卻減弱，另外在第8、10周時(shí)出現(xiàn)了短暫的線粒體生物發(fā)生與融合增強(qiáng)現(xiàn)象，說明由于肝能量缺乏導(dǎo)致了短暫的代償作用。本研究從發(fā)生全過程的角度闡釋肝胰島素抵抗中的能量代謝特征和規(guī)律，為進(jìn)一步深入研究營(yíng)養(yǎng)過剩影響細(xì)胞能量代謝的機(jī)制提供參考。

關(guān)鍵詞： 高脂飲食（HFD）；胰島素抵抗；肝；線粒體；能量代謝；小鼠

中圖分類號(hào)： S856. 5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)： 0366-6964（2024）09-4172-14

Study on the Characteristics of Liver Energy Metabolism during the Induction of Insulin Resistance by High Fat Diet

WANG" Jingxuan， DAI" Lizhi， WANG" Zhenyu， LIU" Ying， YU" Tong， YAN" Min， WANG" Ruilong， XIAO" Jianhua*

（Key Laboratory for Prevention and Control of Common Animal Diseases in General Higher

Education Institutions of Heilongjiang Province， College of Veterinary Medicine，

Northeast Agricultural University， Harbin 150030，" China）

Abstract：" The purpose of this study is to investigate the changes in mitochondrial function and energy metabolism in the liver during the entire process of insulin resistance by establishing a mouse model. A total of 60 male C57BL6 mice were randomly selected and divided into three groups： a control group （Con group） fed with normal maintenance feed; a high-fat diet group （HFD group） fed with high-fat feed. The model was established by randomly selecting six mice from each group at weeks 4， 6， 8， 10， and 12 of feeding. The successful establishment of the whole-process model of insulin resistance was confirmed by insulin resistance assessment and histopathological examination. At the 8th and 12th weeks of the experiment， blood was collected from the tail of the mice for IGTT and ITTs. At weeks 4， 6， 8， 10， and 12 of the experiment， serum and liver tissue samples were collected from the mice for testing： 1） fasting blood glucose and serum content were measured; 2） The contents of Srebp-1c enzyme， PFK "and COX-I in liver tissues were detected by ELISA. 3） Biochemical detection of ALT and AST levels in serum; 4） Western blot was used to detect expression level of PI3K， Akt， P-Akt， GLUT4， GSK-3β， P-GSK-3 β， FOXO "P-FOXO "SIRT "AMPK， P-AMPK， and PGC-1 α protein in liver tissue; 5） Transmission electron microscopy， HE staining， oil red O staining， and PAS staining were used to detect changes in the pathological organization and structure of the liver. The results showed that： 1） 12 weeks of high-fat diet caused obesity and increased HOMA-IR in mice， and oil red O staining showed significant fat deposition， successfully inducing a model of insulin resistance in the entire mouse. During insulin resistance， the levels of ALT and AST in mice increased， and HE results showed significant lipid droplet vacuoles and structural disorder of liver cells. 3） After the fourth week of feeding a high-fat diet， the upstream signaling of insulin in the liver began to be affected; Compared with the Con-6 group， the expression of GLUT4 protein and the ratio of P-FOXO1/FOXO1 as well as the content of PFK1 in the liver of HFD-6 group mice significantly decreased （Plt;0.01）; Compared with the Con-4 group， the GSK-3β expression in the liver of the HFD-4 group mice Phosphorylation and Srebp-1c enzyme levels gradually decreased （Plt;0.05）; The PAS results showed that from the 8th week， the glycogen content in the liver cells of HFD mice decreased; Compared with the Con-4 group， the AMPK， P-AMPK， and SIRT1 contents in the liver of the HFD-4 group significantly decreased （Plt;0.01 and Plt;0.001）; 6） In the HFD group， the expression of Mfn2 in the liver increased at week 10， while the expression of Drp1 protein showed a trend of decrease first and then increase. Compared with the HFD-6 group， the PINK1 and Parkin proteins in the liver of the HFD-6 group mice decreased significantly （Plt;0.05）. In summary， the liver， as the main organ of metabolism， undergoes selective insulin resistance after feeding 60% high-fat feed. After resistance， overall energy catabolism decreases， mitochondrial damage increases， and autophagy， which clears damaged mitochondria， weakens. In addition， there is a brief increase in mitochondrial biogenesis and fusion at weeks 8 and 10， indicating a temporary compensatory effect due to energy deficiency in the liver. This study explains the characteristics and regularities of energy metabolism in hepatic insulin resistance from the perspective of the entire process， providing a reference for further studying the mechanism of excess nutrients affecting cellular energy metabolism.

Key words： high fat diet （HFD）; insulin resistance; liver; mitochondria; energy metabolism; mice

*Corresponding author： XIAO Jianhua，E-mail：Xiaojianhua@neau.edu.cn

現(xiàn)如今，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，寵物的生活方式和飲食結(jié)構(gòu)也發(fā)生了重大變化［1］。高脂肪高糖飲食加上運(yùn)動(dòng)的減少，使得動(dòng)物糖尿病病例逐年增多，引起了廣泛的關(guān)注［2］。

胰島素抵抗是組織細(xì)胞對(duì)胰島素的反應(yīng)性和敏感性降低，使胰島素不能有效促進(jìn)組織細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收和利用［3］。隨著病程的延長(zhǎng)，最終發(fā)展為糖尿?。?］。近年來，這類疾病的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響動(dòng)物的健康和生活質(zhì)量，同時(shí)也給動(dòng)物主人造成了很大的精神困擾和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［4］。有調(diào)查表明，在我國(guó)6月齡至6歲的家養(yǎng)貓中，肥胖率超過了10%［5］。我國(guó)寵物犬的肥胖率高達(dá)約45%［6］。因此，由于攝入過多的能量所導(dǎo)致的動(dòng)物患能量代謝性疾病，越來越受到研究人員的關(guān)注，研究犬、貓等動(dòng)物胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制顯得尤為重要。

肝是胰島素作用的敏感組織，它負(fù)責(zé)調(diào)解機(jī)體能量平衡，控制能量的生成、儲(chǔ)存和消耗，在調(diào)節(jié)糖、脂及能量代謝、維持血糖血脂濃度方面發(fā)揮著重要的作用［7］。王侃侃［8］的研究表明，長(zhǎng)期飼喂高脂日糧會(huì)影響肝的能量代謝。但目前，尚無研究表明在動(dòng)物胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展的過程中，肝的能量代謝是怎樣變化的。所以，本試驗(yàn)通過飼喂高脂飼料建立C57BL6小鼠胰島素抵抗模型，對(duì)整個(gè)胰島素抵抗發(fā)生過程中相關(guān)信號(hào)通路和線粒體指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而分析評(píng)價(jià)能量代謝的特征與變化趨勢(shì)，為研究肝胰島素抵抗發(fā)生過程、線粒體功能與能量代謝變化趨勢(shì)等提供一定的理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物

60只4周齡的C57BL6雄性小鼠購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（遼）2020-0001。購(gòu)買當(dāng)天即將全部小鼠進(jìn)行分籠飼養(yǎng)，每籠一只（小鼠籠規(guī)格：290 mm×178 mm×160mm），飼養(yǎng)于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)臨床獸醫(yī)系動(dòng)物飼養(yǎng)房［溫度（23±3）℃］。動(dòng)物飼養(yǎng)及處理均遵循東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物福利與倫理規(guī)范的要求。

1.1.2 主要試劑與器材

小鼠維持飼料購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，60%高脂飼料（D12492）購(gòu)自常州鼠一鼠二生物科技有限公司。葡萄糖注射液購(gòu)自辰欣藥業(yè)股份有限公司。小鼠胰島素ELISA試劑盒、小鼠SREBP-1c酶ELISA試劑盒、小鼠SREBP-1c酶ELISA試劑盒、小鼠PFK1酶ELISA試劑盒購(gòu)自江蘇晶美生物科技有限公司。小鼠ATP含量測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。PI3K、Akt、GLUT4、GSK-3β、FOXO1、Drp1抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。P-Akt、P-AMPK、SIRT1、P-GSK-3β、P-FOXO1、PINK1、Parkin購(gòu)自萬類生物技術(shù)公司。AMPK、PGC-1α、Mfn2購(gòu)自Abcam貿(mào)易有限公司。

全自動(dòng)WB化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon5200）購(gòu)自上海天能科技有限公司。全自動(dòng)生化分析儀（BS-280）購(gòu)自南京貝登醫(yī)療股份有限公司。低溫高速離心機(jī)（H1-16KR）購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。病理顯微鏡（Eclipse Ts2R）購(gòu)自尼康映像儀器銷售有限公司。4、-20℃冰箱購(gòu)自青島海爾集團(tuán)。紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將小鼠隨機(jī)分為2組：對(duì)照組（Con，n=30，飼喂4%脂肪含量的飼料）和高脂飲食組（HFD，n=30，飼喂60%脂肪含量的飼料）。參照韋雪梅等［9］的造模方法，各組均自由采食、自由飲水。每組均設(shè)置4、6、8、10、12周5個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。在5個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的上午9：00，記錄體重（精確到0.1 g）。在第8和12周對(duì)2組小鼠進(jìn)行葡萄糖耐受試驗(yàn)（glucose tolerance tests， IGTTs），在IGTTs的3 d后，進(jìn)行胰島素耐量試驗(yàn)（insulin tolerance tests，ITTs），根據(jù)結(jié)果確認(rèn)胰島素抵抗模型的成功建立。試驗(yàn)周期為12周。

1.2.2 樣品采集

在飼喂的4、6、8、10和12周，應(yīng)用眼球摘除法迅速采集小鼠血液，靜置30 min后3 000 r·min-1離心25 min，取上層血清于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。小鼠安樂死后，迅速采集肝組織，生理鹽水沖凈后濾紙吸干，稱取重量（g），將一部分肝組織放入-80℃保存，另一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定。

1.3 IGTTs和ITTs

飼喂8和12周后，對(duì)2組小鼠進(jìn)行IGTTs。均禁食12 h，腹腔注射50%葡萄糖（1g·kg-1）。鼠尾采血法獲取全血，分別于注射后0、15、30、60和120 min對(duì)各組小鼠的血糖值用血糖儀進(jìn)行測(cè)定并記錄。0 min時(shí)即小鼠空腹血糖值（FBG， mmol·L-1）。

IGTTs后，小鼠恢復(fù)1 d。禁食12 h后，腹腔注射魚精蛋白生物合成胰島素注射液（0.5 U·kg-1），分別于注射后0、30、60、90、120 min測(cè)定并記錄血糖值，繪制ITTs曲線。

1.4 胰島素抵抗指數(shù)的評(píng)估

用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠空腹血清胰島素（FINs， μIU·mL-1）含量。

計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）評(píng)估胰島素抵抗的程度：

胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=［空腹血糖（FBG） （mmol·L-1）×空腹血清胰島素（FINs） （μIU·mL-1）/22.5］

1.5 血清中ALT、AST含量的檢測(cè)

取出血清樣本，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)2組小鼠血清ALT和AST的水平變化。

1.6 肝的病理組織學(xué)檢測(cè)

在飼喂的4、6、8、10和12周后，隨機(jī)選擇Con組和HFD組小鼠各6只，每只小鼠的肝組織取部分固定于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，另一部分于-80 ℃冷凍，石蠟切片和冰凍切片送東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大型儀器設(shè)備共享服務(wù)平臺(tái)進(jìn)行制作。光學(xué)顯微鏡觀察肝組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.7 肝中ATP、線粒體呼吸鏈復(fù)合物（COX-Ⅰ）、Srebp1c和 PFK1含量的檢測(cè)

測(cè)定肝中ATP、線粒體呼吸鏈復(fù)合物（COX-Ⅰ）、Srebp1c和 PFK1的含量，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.8 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

稱取0.1 g肝組織，加入1 mL裂解液（RIPA∶PMSF=99∶1）裂解組織，4 ℃12 000 r·min-1離心15 min，取上清，即為總蛋白。BCA方法測(cè)量組織蛋白濃度，規(guī)定蛋白濃度為3 μg·μL-1。蛋白上樣量為5 μL，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印于NC膜上，取出NC膜置于5%脫脂奶粉中封閉2h，加入一抗，4℃過夜（PI3K、Akt、GLUT4、GSK-3β、FOXO1、Drp1、AMPK、PGC-1α、Mfn2=1∶5 000稀釋；P-Akt、P-AMPK、SIRT1、P-GSK-3β、P-FOXO1、PINK1、Parkin=1∶200稀釋）。第2天洗膜后加入相應(yīng)的山羊抗兔IgG二抗（1∶8 000）和山羊抗鼠IgG二抗（1∶8 000）室溫孵育2h。滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，在全自動(dòng)發(fā)光成像系統(tǒng)上曝光顯影，用Image J軟件進(jìn)行條帶的灰度值分析，以β-tubulin為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)分析作圖，數(shù)值應(yīng)用“±s”表示。以單因素方差分析法分析差異性，*.Plt;0.05表示明顯差異，**.Plt;0.01表示顯著差異，***.Plt;0.001表示極顯著差異，ns.Pgt;0.05表示無顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 胰島素抵抗模型的建立

各周Con組小鼠體型適中且穩(wěn)步增長(zhǎng)，HFD組小鼠體重大幅增加（圖1A）。在飼喂60%高脂飼料的第4周，HFD組小鼠的空腹血糖水平就顯著高于Con組小鼠（P＜0.01），并且HFD組的小鼠的空腹血糖水平隨著體重的增加而逐漸升高（圖1B）。與Con-4組相比，HFD-4組小鼠的空腹胰島素水平（FINs）明顯升高（Plt;0.05），并且在6、8、10和12周時(shí)，HFD組小鼠的FINs顯著高于各周的Con組小鼠（Plt;0.01）（圖1C）。將各組小鼠的FBG和FINs代入計(jì)算其HOMA-IR的公式中，結(jié)果顯示，從第4周開始，HFD組小鼠的HOMA-IR就極顯著高于Con組（Plt;0.001）（圖1D）。隨著高脂飼料飼喂的時(shí)間的延長(zhǎng)，HFD組小鼠的HOMA-IR呈時(shí)間依賴性增加。IGTTs和ITTs的結(jié)果顯示，在注射葡萄糖（圖1E）和胰島素（圖1F）120 min后，飼喂高脂肪飲食12周的HFD組小鼠的血糖濃度仍高于喂食高脂肪食物8周的HFD組小鼠。

以上結(jié)果提示，飼喂12周高脂飼料引起小鼠肥胖、空腹血糖值和空腹胰島素含量居高不下、葡萄糖不耐受以及胰島素敏感性下降，說明成功誘導(dǎo)了穩(wěn)定的小鼠胰島素抵抗模型。

2.2 高脂飲食會(huì)導(dǎo)致小鼠肝損傷

檢測(cè)各組小鼠肝功能指標(biāo)ALT和AST的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，HFD組小鼠的ALT含量從第6周開始明顯增加（Plt;0.05），并呈持續(xù)顯著增加趨勢(shì)（Plt;0.01和Plt;0.001）（圖1G）。各組小鼠肝組織中AST含量也顯示出相似的結(jié)果。在飼喂高脂飼料的第6周，與Con組相比，HFD組小鼠肝中的AST含量開始顯著增加（Plt;0.05），隨后增加趨勢(shì)更顯著（Plt;0.01和Plt;0.001）（圖1H）。

HE染色結(jié)果顯示，與Con組相比，在HFD-8、HFD-10和HFD-12組小鼠肝中，中央靜脈周圍的細(xì)胞內(nèi)存在許多大小不等的脂滴空泡（圖2A紅色箭頭），肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細(xì)胞排列松散不規(guī)則（圖2A）。

以上結(jié)果提示，對(duì)小鼠飼喂6周的60%高脂飼料就會(huì)開始引起肝出現(xiàn)異常，在12周時(shí)已出現(xiàn)穩(wěn)定的肝損傷狀態(tài)。再次印證了12周60%高脂飼料的飼喂，可以造成穩(wěn)定的胰島素抵抗肝損傷模型。

2.3 高脂飲食影響小鼠肝胰島素途徑的上游信號(hào)傳導(dǎo)

與Con組相比，在飼喂高脂飼料的第4周，HFD組小鼠肝組織中PI3K的蛋白表達(dá)量就明顯降低（P＜0.05）。隨后，隨著高脂日糧飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)，PI3K表達(dá)量呈下降趨勢(shì)（圖3A）。HFD組小鼠肝組織中Akt的磷酸化水平在飼喂4周后開始有明顯變化，且逐漸降低。與HFD-4組相比，HFD-12組肝中的P-Akt/Akt比值極顯著下降（P＜0.001）（圖3B）。

2.4 高脂飲食影響小鼠肝胰島素途徑的下游葡萄糖代謝

GLUT4蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示，從第6周開始，與Con組相比，HFD組小鼠肝中GLUT4含量開始顯著下降（P＜0.01）。與HFD-4組相比，HFD-6組小鼠肝中的GLUT4蛋白表達(dá)量顯著下降（Plt;0.01）。在飼喂高脂飼料的第12周，肝中的GLUT4含量達(dá)到最低水平，但與HFD-10組相比沒有顯著差異（Pgt;0.05）（圖3C）。

HFD組小鼠肝內(nèi)GSK-3β磷酸化蛋白表達(dá)量，在飼喂高脂飼料的4周開始有明顯變化，GSK-3β磷酸化水平逐漸降低（P＜0.05）。在飼喂高脂飼料的12周中，HFD組小鼠肝中的P-GSK-3β/GSK-3β比率呈逐漸下降的趨勢(shì)（圖3D）。

PAS結(jié)果顯示，Con組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)紫色較深，糖原含量較多。HFD-8、HFD-10、HFD-12組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)紫色染色變淺，糖原含量較少（圖2C）。

FOXO1蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，在飼喂高脂飼料的第6周，HFD組小鼠肝中的P-FOXO1/FOXO1比值開始下降，且與第4周相比顯著下降（P＜0.01），并且在第10周比值下降到最低水平，第12與10周在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異（P＞0.05）（圖3E）。

HFD組小鼠肝中的PFK1含量在第6周，與Con-6組相比顯著下降（Plt;0.01），隨后出現(xiàn)時(shí)間依賴性下降（圖4B）。

以上結(jié)果提示，在胰島素抵抗發(fā)生的過程中，小鼠肝在不同時(shí)間上影響了糖代謝的各個(gè)方面。在第4周，糖原合成能力受到影響；在第6周，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖異生、糖酵解功能開始受到影響。說明長(zhǎng)期的高脂飲食對(duì)肝糖代謝功能的影響不是同時(shí)發(fā)生的。

2.5 高脂飲食影響小鼠肝胰島素途徑的下游脂質(zhì)代謝

在飼喂高脂飼料的第4周，與Con組相比，HFD組小鼠肝中Srebp-1c酶的含量明顯升高（Plt;0.05）。在第10周，HFD組小鼠肝Srebp-1c酶的含量達(dá)到最高，且與12周無顯著差異（P＞0.05）（圖4A）。

油紅O染色結(jié)果顯示，HFD組小鼠肝內(nèi)脂肪堆積逐漸密集、嚴(yán)重，紅染面積范圍不斷擴(kuò)大加深。鏡下可見，HFD-10和HFD-12組的小鼠肝內(nèi)有大量的紅色脂肪滴，并伴有嚴(yán)重的脂質(zhì)沉積，顯示出嚴(yán)重的脂肪肝（圖2D）。

結(jié)果表明，在高脂肪攝入導(dǎo)致的胰島素抵抗發(fā)生后，脂肪的合成能力逐漸增強(qiáng)，肝內(nèi)脂肪的含量逐漸升高。

2.6 高脂飲食影響小鼠肝線粒體生物發(fā)生

肝透射電鏡結(jié)果顯示，Con組小鼠鏡下細(xì)胞核形狀較為規(guī)整，處于融合狀態(tài)的線粒體較多（圖2B）。HFD組小鼠肝細(xì)胞的細(xì)胞核形狀不規(guī)整，脂肪滴較多，且10、12周時(shí)肝細(xì)胞內(nèi)線粒體處于分裂狀態(tài)較多（圖2B）。

在飼喂高脂飼料的第6周，HFD組小鼠肝ATP含量開始下降，下降程度與飼喂時(shí)間正相關(guān)（圖4C）。肝內(nèi)COX-Ⅰ的下降趨勢(shì)與ATP相同（圖4D）。飼喂過程中，ATP與COX-Ⅰ的下降存在相關(guān)性，并與60%高脂日糧飼喂時(shí)間正相關(guān)（圖4E）。

在飼喂高脂飼料的過程中，AMPK和P-AMPK蛋白表達(dá)量，總體上呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。在第4周，與Con組相比，HFD組小鼠肝內(nèi)AMPK及其磷酸化水平的表達(dá)量就顯著下降（Plt;0.01）。有趣的是，與第4和8周相比，第6周HFD組小鼠肝的AMPK蛋白表達(dá)量均顯著降低（P＜0.01）；P-AMPK蛋白表達(dá)量也呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)（圖3G、圖3H）。

與Con-4組相比，HFD-4組小鼠肝SIRT1含量極顯著降低（Plt;0.001）。在6～10周，HFD組小鼠肝內(nèi)的SIRT1蛋白表達(dá)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無意義，保持低水平的穩(wěn)態(tài)（P＞0.05）。在第12周，與HFD-10組相比，HFD組小鼠肝內(nèi)的SIRT1蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.01）（圖3F）。PGC-1α的變化趨勢(shì)與SIRT1大體一致。值得注意的是，與HFD-8組相比，HFD-10組小鼠肝中PGC-1α蛋白的表達(dá)顯著增加（Plt;0.01）（圖3I）。

以上結(jié)果提示，在飼喂高脂飼料誘導(dǎo)的胰島素抵抗后，小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的能量相對(duì)缺乏，因此通過反饋調(diào)節(jié)激活A(yù)MPK/PGC-1α信號(hào)通路來促進(jìn)線粒體的生物發(fā)生為機(jī)體供能，但隨著抵抗嚴(yán)重，這一機(jī)制似乎未能彌補(bǔ)胰島素抵抗的狀態(tài)，因此在第12周時(shí)，AMPK/PGC-1α信號(hào)的激活程度降低。

2.7 高脂飲食影響小鼠肝線粒體的融合、分裂和自噬

Mfn2蛋白結(jié)果表明，在飼喂高脂飼料的第4周，與Con組相比，HFD組小鼠肝內(nèi)Mfn2蛋白就顯著下降（P＜0.01）。HFD組小鼠肝內(nèi)的Mfn2蛋白表達(dá)總體看逐漸降低，但有趣的是，在第10周出現(xiàn)上升，且與第8和12周相比均顯著升高（P＜0.01）（圖5A）。

HFD組小鼠肝中Drp1蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)。在飼喂的第4和6周，與Con組相比，HFD組小鼠肝Drp1蛋白含量均下降（Plt;0.01和Plt;0.05）。但第8周時(shí)，Con組與HFD組小鼠肝內(nèi)Drp1的蛋白表達(dá)量無顯著差異（P＞0.05）。與Con組和HFD-8組相比，在第10和12周，HFD組小鼠肝內(nèi)Drp1蛋白表達(dá)量均極顯著增加（P＜0.001）（圖5B）。

在飼喂高脂飼料的第6周，HFD組小鼠肝中PINK1和Parkin蛋白表達(dá)開始下降，與HFD-4組相比有顯著差異（Plt;0.05）。第8、10周，兩蛋白穩(wěn)定低表達(dá)，HFD組間無差異（P＞0.05）。至12周，與HFD-10組相比，PINK1和Parkin蛋白表達(dá)下降（P＜0.01和P＜0.05）（圖5C、5D）。相關(guān)性分析顯示，PINK1和Parkin蛋白的下降程度與高脂飼料飼喂時(shí)間正相關(guān)（圖5E）。

結(jié)果提示，在高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗發(fā)生后，線粒體自身可能通過代償作用激活A(yù)MPK/PGC-1α信號(hào)通路，從而促進(jìn)融合蛋白Mfn2的表達(dá)使線粒體供能，但隨著抵抗逐漸嚴(yán)重，這種代償最終失去作用。由于在胰島素抵抗后期，線粒體分裂增加，使得能夠正常發(fā)揮作用的線粒體數(shù)量大大降低，而此時(shí)小鼠肝內(nèi)線粒體自噬逐漸下降，造成受損線粒體無法及時(shí)被清除，這又反過來影響線粒體的自噬活性，最終造成線粒體的代謝紊亂和功能障礙。

3 討 論

3.1 長(zhǎng)期高脂飲食成功誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗模型

肝是胰島素的敏感組織，肝在調(diào)節(jié)糖、脂以及能量代謝，維持血糖血脂濃度方面發(fā)揮著重要的作用［10］。由于持續(xù)的高脂肪攝入，會(huì)導(dǎo)致胰島素的功能逐漸減弱［11］。大量研究表明，持續(xù)的高脂肪攝入會(huì)引起胰島素抵抗，并降低肝對(duì)胰島素的敏感性［12-13］。在本試驗(yàn)中，HFD組小鼠在飼喂高脂飼料的第4、6、8、10和12周，HOMA-IR均高于相應(yīng)的Con組，并且在12周時(shí)達(dá)到最大的穩(wěn)定水平。此外，IGTTs和ITTs的結(jié)果顯示，在第8周時(shí)，葡萄糖就極度不耐受，隨后檢測(cè)了12周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖的耐受情況仍在降低，已經(jīng)達(dá)到了C57BL6小鼠糖尿病前期的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值。這說明飼喂12周60%的高脂飼料成功誘導(dǎo)了穩(wěn)定的胰島素抵抗全階段小鼠模型。

HOMA-IR的增加，反映了胰島素敏感性的降低，這導(dǎo)致糖脂代謝異常。長(zhǎng)時(shí)間高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗后，肝糖原合成能力減弱，能量以脂質(zhì)形式儲(chǔ)存在肝［10，14］。此外，由于胰島素抵抗后肝胰島素信號(hào)通路受損，葡萄糖進(jìn)入肝的能力降低［15-16］。因此肝通過增強(qiáng)糖異生維持細(xì)胞能量［17］。隨著肝內(nèi)脂肪逐漸堆積，肝酶（AST、ALT）的含量逐漸升高［1］。本試驗(yàn)中，HFD組小鼠ALT、AST的含量逐漸升高，這對(duì)肝產(chǎn)生損傷，引發(fā)脂肪肝。本試驗(yàn)通過肝HE、PAS和油紅O染色發(fā)現(xiàn)，HFD組小鼠在胰島素抵抗發(fā)生的過程中，肝內(nèi)糖原含量逐漸減少，脂肪含量逐漸增多，大量脂肪沉積，并發(fā)生嚴(yán)重的脂肪肝現(xiàn)象。綜上，在高脂飲食誘導(dǎo)C57BL6小鼠胰島素抵抗發(fā)生的過程中，小鼠肝酶升高，肝糖原較少、脂肪沉積增多，肝組織內(nèi)分裂和損傷線粒體增多，肝損傷逐漸加重。

3.2 長(zhǎng)期高脂飲食影響小鼠肝內(nèi)胰島素信號(hào)通路及其下游糖、脂代謝能力

在機(jī)體攝入葡萄糖后，葡萄糖刺激β細(xì)胞分泌胰島素，進(jìn)而激活PI3K［18-19］。PI3K磷酸化第二信使Akt，Akt在調(diào)節(jié)代謝、生長(zhǎng)、增殖、存活、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成等多種細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用［20-21］。在本試驗(yàn)中，從PI3K、AKT、P-AKT的蛋白表達(dá)結(jié)果可看出，2組同周時(shí)間點(diǎn)相比：在4周胰島素抵抗前，HFD組的PI3K與P-AKT的表達(dá)水平已經(jīng)開始降低，雖然表達(dá)水平低于Con組，但機(jī)體還未發(fā)生胰島素抵抗，胰島素還能發(fā)揮其作用，在8周抵抗后胰島素作用逐漸減弱。說明長(zhǎng)期能量過剩導(dǎo)致的胰島素抵抗會(huì)降低肝胰島素信號(hào)通路的活性，并且這種抑制作用隨著胰島素抵抗的惡化而變得更加嚴(yán)重。

肝是重要的胰島素靶向器官［22］。在進(jìn)食后，肝內(nèi)胰島素信號(hào)會(huì)調(diào)控葡萄糖和脂肪利用［23-24］。這些機(jī)制主要由Akt激活后作用的多種效應(yīng)底物控制［20］?；罨腁kt：1）激活肝內(nèi)GLUT4蛋白以促進(jìn)肝內(nèi)葡萄糖攝取［25］。2）磷酸化糖原合成酶激酶-3（GSK-3）并抑制其活性從而促進(jìn)肝糖原的合成［26］。3）促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)FOXO1磷酸化，從而抑制糖異生［27］。4）促進(jìn)Srebp-1c的表達(dá)和肝內(nèi)脂肪合成［28］。5）通過AMPK信號(hào)通路抑制Srebp-1c的活化［29］。6）促進(jìn)糖酵解的重要酶PFK1的表達(dá)，使葡萄糖被分解利用［30］。在本研究中，GLUT4和P-GSK3β的結(jié)果表明，在高脂飲食誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗的發(fā)展過程中，細(xì)胞外長(zhǎng)期的能量過剩，會(huì)損害肝對(duì)葡萄糖的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)能力、肝內(nèi)糖原的合成能力，這導(dǎo)致葡萄糖在血液內(nèi)進(jìn)入肝的能力減弱。因此，機(jī)體此時(shí)會(huì)促進(jìn)糖異生能力以滿足肝細(xì)胞的能量需求。本研究P-FOXO1和FOXO1的檢測(cè)結(jié)果支持了這一觀點(diǎn)。小鼠肝中PFK1的含量在第6周開始下降，表明此時(shí)肝糖酵解能力開始下降。在12周時(shí)達(dá)到最低水平，表明在肝胰島素抵抗的發(fā)展過程中，肝糖酵解能力在逐漸下降，隨著抵抗的嚴(yán)重會(huì)加劇這種損害。在飼喂高脂飼料的過程中，小鼠肝中Srebp-1c酶的含量逐漸升高，說明在胰島素抵抗的發(fā)生過程中，肝內(nèi)脂肪的生成能力逐漸增強(qiáng)，肝內(nèi)脂肪含量逐漸升高，提示在抵抗發(fā)生后，脂肪的生成能力并不受到抑制，這種“選擇性”的抵抗值得進(jìn)一步探究。

綜上所述，當(dāng)機(jī)體持續(xù)攝入過多能量時(shí)，這些多余的能量就會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到肝等組織中存儲(chǔ)。在正常的機(jī)體內(nèi)，能量的存儲(chǔ)與利用之間有一個(gè)相對(duì)的穩(wěn)定平衡狀態(tài)，一旦長(zhǎng)時(shí)間處于能量過剩條件下時(shí)，這種平衡會(huì)被打破。在胰島素抵抗發(fā)生過程中，肝能量存儲(chǔ)與利用的平衡就會(huì)被打破，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至肝的能力可能逐漸減弱，肝內(nèi)糖原合成能力可能逐漸減弱，含量減少，肝糖異生能力可能逐漸增強(qiáng)，肝內(nèi)糖酵解的能力可能逐漸減弱，而此時(shí)能量大多以脂肪的形式沉積于肝內(nèi)，那么肝內(nèi)能量調(diào)控具體如何變化仍有待進(jìn)一步研究，這時(shí)需要將重點(diǎn)放在細(xì)胞的“能量感受器”線粒體上。

3.3 長(zhǎng)期高脂飲食導(dǎo)致小鼠肝內(nèi)的線粒體能量代謝失衡

大量研究證明，線粒體功能損傷是誘發(fā)胰島素抵抗的主要機(jī)制之一［31］。線粒體呼吸鏈的作用代表著線粒體最基本的功能［32］。其中，線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ（COX-Ⅰ）具有一系列氧化還原中心的作用，可以將電子從NADH傳遞至 CoQ，驅(qū)動(dòng)ATP的合成［33］。當(dāng)機(jī)體缺乏能量時(shí)，線粒體呼吸鏈的作用會(huì)增強(qiáng)，驅(qū)動(dòng)更多的ATP的合成為機(jī)體供能。當(dāng)胞內(nèi)能量缺乏時(shí)，ATP含量降低，造成AMP/ATP比值的變化，這一變化會(huì)直接調(diào)控AMPK的表達(dá)。AMPK的激活在線粒體的能量生成中具有核心地位，它可以激活SIRT 使下游的參與能量代謝的PGC1-α激活，從而促進(jìn)線粒體的生物發(fā)生，為機(jī)體提供能量［34］。SIRT1也可使 AMPK上游激酶LKB去乙?；せ預(yù)MPK，這合理地解釋了AMPK/SIRT1協(xié)同參與調(diào)節(jié)能量代謝。

本研究在飼喂高脂飼料的第4周時(shí)，HFD組的ATP含量和COX-I含量與Con組接近。然而，從6周開始，HFD組均低于Con組，說明高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗會(huì)減弱線粒體的呼吸功能，從而減少線粒體的產(chǎn)生。本研究在胰島素抵抗發(fā)生過程的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，HFD組小鼠肝內(nèi)的AMPK、P-AMPK、SIRT1、PGC-1α的蛋白表達(dá)水平均低于Con組。此試驗(yàn)誘導(dǎo)胰島素抵抗的過程中，HFD組小鼠持續(xù)攝入高脂飼料，體內(nèi)能量一直相對(duì)充裕，因此可能對(duì)能量的需求不高，因此這些蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比相對(duì)較低，線粒體的生物發(fā)生能力和線粒體的能量產(chǎn)出較低。而Con組小鼠由于飼喂的是普通維持飼料，其機(jī)體內(nèi)能量代謝仍處于正常狀態(tài)，能激活A(yù)MPK/SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路促使線粒體生成能量。但是從HFD組的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)比來看，細(xì)胞外長(zhǎng)期的能量過剩似乎會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)能量的平衡產(chǎn)生影響，在第8或10周，HFD組AMPK、PGC-1α的蛋白表達(dá)水平有著升高的跡象，但仍顯著低于Con組，在12周時(shí)表達(dá)又降低。這可能是由于在胰島素抵抗發(fā)生后，肝胰島素信號(hào)活性降低，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至肝內(nèi)的能力減弱，此時(shí)肝細(xì)胞內(nèi)的能量主要以脂肪的方式貯存在肝內(nèi)，在胰島素抵抗后肝可能不足以動(dòng)用這些“存儲(chǔ)的能量”。因此，肝會(huì)增強(qiáng)糖異生的能力來為細(xì)胞供能。雖然細(xì)胞外部能量過剩，但是線粒體作為能量感受器，監(jiān)測(cè)到肝細(xì)胞內(nèi)部能量似乎相對(duì)缺乏，因此可能會(huì)通過反饋調(diào)節(jié)激活A(yù)MPK、SIRT1、PGC-1α信號(hào)通路來促進(jìn)線粒體的生物發(fā)生為機(jī)體供能，這種能量間的嚴(yán)格調(diào)控也是機(jī)體自身的保護(hù)作用，但隨著抵抗逐漸嚴(yán)重，這一調(diào)節(jié)功能似乎未能彌補(bǔ)胰島素抵抗后所導(dǎo)致的能量代謝失衡狀態(tài)，ATP的含量也并不能因此而升高，所以在12周最后表達(dá)又降低。

線粒體功能受損與胰島素抵抗有一定關(guān)系，主要是由于隨著高能量的持續(xù)攝入，使線粒體呈現(xiàn)“超負(fù)荷”工作狀態(tài)，以減少機(jī)體內(nèi)過多的能量［35］。線粒體的融合與分裂事件，是線粒體根據(jù)不同條件強(qiáng)化自身功能的一種重要方式，它們之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)線粒體的健康十分重要［36-37］。Mfn2參與線粒體外膜融合，線粒體的融合或許更有利于增強(qiáng)線粒體的功能，可提高細(xì)胞氧化磷酸化水平、增強(qiáng)線粒體呼吸，有利于能量產(chǎn)生［38］。Drp1調(diào)控線粒體分裂增強(qiáng)，會(huì)使機(jī)體內(nèi)氧化磷酸化水平和ATP含量下降，因此線粒體的分裂似乎不利于能量的產(chǎn)生［39］。

融合蛋白Mfn2的表達(dá)情況檢測(cè)顯示，在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)HFD組的Mfn2表達(dá)水平均低于Con組，HFD組由于能量過剩，線粒體不需要通過增加融合來為機(jī)體供能。同時(shí)，PGC-1α的激活能促進(jìn)線粒體的融合功能，在本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組的PGC-1α與Mfn2的表達(dá)水平均低于對(duì)照組同步驗(yàn)證了試驗(yàn)結(jié)果，說明在高脂飼料誘導(dǎo)的肝胰島素抵抗會(huì)減弱線粒體的融合功能。在肝胰島素抵抗發(fā)生后，線粒體自身可能會(huì)通過反饋調(diào)節(jié)，通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路激活PGC-1α，來促進(jìn)融合蛋白Mfn2的表達(dá)增強(qiáng)線粒體供能的能力，但是隨著抵抗的嚴(yán)重這種代償可能會(huì)失去作用，導(dǎo)致最后表達(dá)降低。因此猜測(cè)在肝臟胰島素抵抗發(fā)生后，線粒體的融合功能可能存在先升高再降低的趨勢(shì)，對(duì)于線粒體的融合功能在胰島素抵抗的發(fā)生過程中具體如何變化仍有待進(jìn)一步研究。通過透射電子顯微鏡結(jié)果可以看出，高脂飼料飼喂的HFD組小鼠肝內(nèi)線粒體處于分裂狀態(tài)的較多，10、12周HFD組小鼠鏡下線粒體分裂程度較高。Western blot結(jié)果中也顯示，HFD組的Drp1在4、6周時(shí)表達(dá)低于Con組，在第8周后高于Con組。猜測(cè)可能是因?yàn)樵谝葝u素抵抗前，線粒體的功能正常，其融合與分裂之間的動(dòng)態(tài)平衡未被打破。但是在胰島素抵抗后，線粒體可能需要通過增強(qiáng)自身的分裂水平對(duì)自身修復(fù)并保護(hù)：一方面將逐漸增多的受損線粒體從網(wǎng)絡(luò)中分離進(jìn)行自噬清除，另一方面降低線粒體對(duì)底物的攝入以減少氧化對(duì)線粒體造成的損傷。

線粒體的自噬與線粒體的融合分裂相互影響，共同發(fā)揮作用，維持線粒體的穩(wěn)態(tài)。線粒體分裂是線粒體自噬的前提，分裂會(huì)將受損的線粒體從線粒體網(wǎng)絡(luò)中分離出來，從而協(xié)助線粒體自噬的發(fā)生［40］。PINK1和PARKIN蛋白在線粒體自噬中發(fā)揮重要作用［41］。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著高脂飼料飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)，HFD組小鼠肝中PINK1和Parkin蛋白水平逐漸降低，提示線粒體自噬能力逐漸減弱。這表明，在胰島素抵抗的發(fā)生過程中，即使線粒體的分裂能力在逐漸增強(qiáng)，但是隨著受損的線粒體逐漸增多，線粒體的自噬水平可能不足以完全清除損傷的線粒體；而且在胰島素抵抗后，細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化水平、線粒體呼吸能力減弱，AMPK等能量調(diào)控蛋白表達(dá)水平較低，線粒體自噬水平可能因此受到抑制。

4 結(jié) 論

飼喂12周60%高脂飼料可以成功誘導(dǎo)C57BL6小鼠胰島素抵抗，且胰島素抵抗的發(fā)展過程是漸進(jìn)性的，在第6、8周時(shí)發(fā)生了胰島素抵抗及肝的損傷，在抵抗的發(fā)展過程中肝內(nèi)脂肪沉積逐漸增多。其次，在胰島素抵抗發(fā)生的過程中，肝胰島素信號(hào)通路活性逐漸減弱，肝內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、肝內(nèi)糖原合成逐漸減弱，肝內(nèi)糖酵解逐漸減弱，而肝糖異生與脂肪生成卻逐漸增強(qiáng)，說明攝入的高能量飼料導(dǎo)致肝發(fā)生了選擇性的胰島素抵抗。另外，在胰島素抵抗發(fā)生的過程中，肝線粒體的呼吸逐漸減弱，生物發(fā)生和融合總體逐漸減弱，在抵抗后出現(xiàn)短暫的代償性增強(qiáng)，但隨后又開始減弱，肝線粒體分裂逐漸增強(qiáng)，肝線粒體自噬逐漸減弱。

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（編輯 白永平）