一株鵝源禽腺病毒4型的分離及致病性

摘 要： 2023年，昆明一朗德鵝場部分雛鵝出現(xiàn)軟脖子癥狀，伴有零星死亡，病變疑似禽心包積液綜合征（hydropericardium syndrome， HPS）。本研究旨在對本次雛鵝病因進行分子病毒學(xué)診斷和病原的致病性研究。采集肝病料接種雞肝癌細胞（leghorn male hepatocellular cells， LMH）：1）觀察細胞病變效應(yīng)（cytopathic effect， CPE），取培養(yǎng)液負染、電鏡觀察病毒粒子形態(tài)；2）靶標(biāo)4型禽腺病毒（serotype 4 fowl adenovirus， FAdV-4）的衣殼蛋白編碼基因hexon基因進行PCR診斷，對擴增基因序列進行遺傳演化分析；3）以5×105.5TCID50/羽的劑量皮下注射感染10日齡健康泰州鵝，進行動物回歸感染以確證其致病性。結(jié)果顯示，將病料上清接種LMH細胞48～72 h后CPE明顯，細胞圓縮、間隙變大、隨后碎裂、逐漸脫落，電鏡觀察見二十面體無囊膜病毒粒子；PCR檢測FAdV-4陽性，分離純化病毒，命名為YNKM2023株；hexon基因的遺傳演化分析顯示，分離株與國內(nèi)已有的雞、鴨FAdV-4流行毒株相似性高達99.8%～99.9%，與印度分離株相似性為99.5%～99.6%。接種感染后，泰州鵝未出現(xiàn)典型的臨床癥狀，但感染后3 d開始出現(xiàn)HPS的特征性病變，感染后6 d檢測到中和抗體。綜上，本研究成功分離到鵝源FAdV-4/YNKM2023株，該毒株與國內(nèi)已有的雞鴨流行毒株高度同源，尚未發(fā)生明顯的基因漂移。分離株可以感染鵝，病毒可以在雛鵝體內(nèi)復(fù)制引起組織器官病變并產(chǎn)生免疫應(yīng)答，對鵝表現(xiàn)出一定的致病性，這有助于了解FAdV-4在鵝群的流行情況及其對雛鵝的致病性。

關(guān)鍵詞： 鵝源；禽腺病毒4型（FAdV-4）；分離；致病性

中圖分類號：S852.65+1

文獻標(biāo)志碼：A 文章編號： 0366-6964（2024）09-4232-09

Isolation and Pathogenicity of a Goose Derived Fowl Adenovirus Type 4

WANG" Yan" GAO" Yadong2， JIANG" Chenghui "ZENG" Qiaoying1*

（1.College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China;

2.Qingdao Huifeng Animal Health Products Co.， Ltd， Qingdao 26611 "China）

Abstract：" In 2023， some goslings at a Longde Goose Farm in Kunming showed symptoms of soft neck accompanied by sporadic deaths， with the pathology suspected to be hydropericardium syndrome（HPS）.The purpose of this study was to carry out molecular virological diagnosis and pathogenicity research on the etiology of gosling. Liver samples from diseased goslings were collected and inoculated with leghorn male hepatocellular cells（LMH）. 1） The cytopathic effect （CPE） was observed. The culture medium was negative stained and the morphology of virus particles was observed by electron microscope. 2） The hexon gene encoding the capsid protein of the target serotype 4 fowl adenovirus （FAdV-4）was subjected to PCR diagnosis， followed by genetic evolutionary analysis of the amplified gene sequence. 3） At a dose of 5×105.5 TCID50 per bird， subcutaneous injection was administered to healthy 10-day-old Taizhou geese for animal retroinfection to confirm its pathogenicity. The results showed that， after the inoculation of LMH cells with the supernant of disease material for 48 to 72 hours， clear cytopathic effects are observed， characterized by cell rounding， increased intercellular spaces， subsequent fragmentation， gradual detachment. Under electron microscopy， non-enveloped icosahedral viral particles were observed. The PCR test result showed positivity for FAdV-4， the virus was isolated and purified， and named strain YNKM2023;Genetic evolution analysis of the hexon gene revealed a high similarity （99.8%～99.9%） with domestically prevalent chicken and duck FAdV-4 strains， and a similarity of 99.5%～99.6% with strains isolated from India. After being infected， Taizhou geese did not exhibit severe characteristic clinical symptoms， but began to show characteristic lesions of HPS three days post-infection， with neutralizing antibodies detected six days post-infection. In conclusion， this study successfully isolated the goose-origin FAdV-4/YNKM2023 strain， which is highly homologous to the existing chicken and duck epidemic strains in the country， with no apparent genetic drift occurring. The isolated strain can infect geese， replicate in goslings causing tissue organ lesions， and trigger an immune response， showing a certain pathogenicity to geese. This contributes to understanding the prevalence of FAdV-4 in goose populations and its pathogenicity to goslings.

Key words： goose derived; fowl adenovirus type 4 （FAdV-4）; isolation; pathogenicity

*Corresponding author：" ZENG Qiaoying， E-mail：zengqy@gsau.edu.cn

禽腺病毒（Fowl adenovirus， FAdV）屬于禽腺病毒屬，腺病毒科（Adenoviridae）成員［1］。根據(jù)限制性內(nèi)切酶消化模式不同和血清交叉中和試驗可分為A、B、C、D、E等5個種和12個血清型［2］。FAdV為無囊膜，雙鏈DNA病毒［3］。其中，六鄰體衣殼蛋白是該病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，由hexon基因編碼，含有血清型特異性抗原決定簇，利用hexon基因可以對特定的血清型進行區(qū)分［4-5］。不同血清型的病毒對禽類的致病性有所差異［6-7］，有些血清型致病性強，有些致病性弱，也有一些血清型不致?。?-9］。

FAdV-4是一種能引起禽類心包積液綜合征（hydropericardium syndrome， HPS）和包涵體肝炎（inclusion body hepatitis， IBH）癥狀的血清型［10-12］。該病毒主要感染3～5周齡的肉雞，感染后1周內(nèi)急性發(fā)病并且很快死亡。發(fā)病率為10%～30%，死亡率為30%～70%，嚴重時可達80%［13-14］。該病毒除感染雞和鴨［15-16］，還可以感染鴕鳥［17］、鴿子［18］和孔雀［19］等禽類。

2023年6月份，昆明一養(yǎng)鵝場16日齡的朗德鵝出現(xiàn)了軟脖子癥狀，并伴有零星死亡情況。病死鵝心臟出現(xiàn)心包積液，肝、腎、肺腫脹出血，這些癥狀與雞的HPS和IBH病變相似。然而，已有的研究報道表明，感染FAdV-4后導(dǎo)致HPS的宿主主要是雞，其次是鴨，鵝罕見報道。因此，本研究采集了病鵝的肝組織進行病毒的分離鑒定，并對分離株的致病性進行研究，以期了解FAdV在鵝群中的流行情況。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和培養(yǎng)液

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司。AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自愛思進生物技術(shù)（杭州）有限公司?？俁NA提取試劑盒購自天根生物科技（北京）有限公司。Premix Taq Version2.0 plus dye、pMDTM19-T Vector、Cloning Kit、E.coli DH5α Competent Cells和DNA凝膠回收試劑盒購自TaKaRa公司。LMH細胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。細胞生長液為含8%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，細胞維持液為含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)張宇等［20］報道的引物檢測FAdV-4和擴增病毒hexon基因。采用劉晨晨［21］報道引物檢測禽流感病毒（AIV）。采用Guerin等［22］報道引物檢測鵝多瘤病毒（GHPV）。參考新城疫病毒（NDV）F基因序列（OQ144966.1）設(shè)計NDV檢測引物。參考鵝細小病毒（GPV）VP1基因序列（OR413178.1）設(shè)計GPV檢測引物。具體引物信息如表1所示，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 病毒分離培養(yǎng)與CPE觀察

將采集的病鵝肝組織加入滅菌PBS液（0.02 mol·L－ PH7.4）進行勻漿，反復(fù)凍融后，8 000×g離心10 min，取上清過濾分裝，-80℃保存?zhèn)溆?。將處理好的病料上?倍稀釋后，接種于LMH單層細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，待出現(xiàn)明顯的細胞病變時，收集細胞培養(yǎng)物，-80℃/室溫反復(fù)凍融2次，收集病毒液。用同樣的方法連續(xù)傳3代（P1～P3），收集每一代病毒液，分裝后-80℃保存。

1.4 病毒PCR檢測及電鏡觀察

將P1代培養(yǎng)液于72～96 h收獲，將P2～P3代培養(yǎng)液于48～72 h收獲。將收獲的培養(yǎng)物-80℃/室溫凍融2次，4℃、8 000×g離心10 min后吸取上清，依據(jù)試劑盒說明書步驟提取核酸，以提取的病毒核酸為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）為：Premix Taq Version2.0 plus dye 12.5 μL，上、下游引物（FAdV4-F/FAdV4-R）各0.5 μL，DNA模板2 μL， ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。待PCR結(jié)束后，擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。將P3代培養(yǎng)液6 000×g離心10 min，取上清吸附到碳膜網(wǎng)表面，之后用2%磷鎢酸負染，在透射電鏡觀察病毒粒子形態(tài)。

1.5 hexon基因測序分析

以P3代病毒液的核酸為PCR模板，引物為FAdV4h-F/FAdV4h-R，依照“1.4”的擴增體系，擴增hexon全基因序列。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸176 s，共32個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。將切膠純化回收后獲得的目的片段連接至pMDTM19-T Vector，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α 感受態(tài)細胞。隨機挑選3個陽性克隆提取質(zhì)粒，送公司測序。根據(jù)測序結(jié)果，使用Mega7.0軟件繪制遺傳進化樹。

1.6 半數(shù)組織感染劑量（TCID50）測定

將P3代病毒液作10倍梯度稀釋，取10-5、10-6、10-7和10-8共4個稀釋度，分別接種LMH細胞96孔板，每個稀釋度接種8孔，100 μL·孔－ 同時設(shè)正常細胞對照，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120 h。觀察并統(tǒng)計細胞病變孔數(shù)，根據(jù)Reed-Munch法計算病毒的TCID50。

1.7 雛鵝孵化與回歸感染試驗

將60枚購自山東萊西某養(yǎng)鵝場的泰州鵝種蛋在實驗室孵化，并于隔離器中飼養(yǎng)至8日齡。通過ELISA抗體試劑盒、PCR擴增法對雛鵝血清與組織進行檢測，確保雛鵝未感染FAdV、AIV、NDV、GPV和GHPV等病原。待雛鵝生長至10日齡時，隨機選取40羽分為2組，試驗組和對照組各20羽，每組隔離飼養(yǎng)。試驗組經(jīng)皮下注射接種分離株病毒液0.5 mL（病毒含量為5×105.5TCID50），對照組以同樣的方式接種滅菌生理鹽水0.5 mL。每天觀察臨床癥狀，并于接種后3、6、14 d每組隨機選取5只，剖檢觀察組織病變，取心、肝、腎和肺組織于10%甲醛溶液固定7 d，制作石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。同時，對肝組織進行勻漿，用FAdV-4檢測引物進行核酸PCR鑒定。在接種前、接種后6 d和接種后14 d采集血液，檢測血清中FAdV-4的中和抗體。

1.8 中和抗體效價檢測

將待檢血清經(jīng)56℃水浴滅活30 min，冰浴2 min，8 000×g離心15 min，取上清，加入雙抗后做2倍系列稀釋，再與200 TCID50的病毒等體積混合，置于5%CO2 細胞培養(yǎng)箱感作1 h。再按100μL·孔－1滴加到96孔細胞板中，置于培養(yǎng)箱感作1 h后棄去溶液，加入含2%FBS的細胞維持液，觀察記錄7 d，同時設(shè)陰、陽性血清對照孔。當(dāng)被檢血清孔出現(xiàn)100%病變即判定為陰性，50%以上出現(xiàn)保護則為陽性?？贵w數(shù)據(jù)采用GraphPad.Prism.9.5制圖。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離鑒定

將處理后的肝組織上清液接種LMH細胞，48～72 h后出現(xiàn)明顯CPE，表現(xiàn)為細胞圓縮、間隙變大、碎裂和脫落，正常細胞未見CPE。將P1、P2、P3代病毒液進行PCR檢測，結(jié)果顯示，F(xiàn)AdV-4均為陽性，NDV、AIV、GPV、GHPV均為陰性。將P3代病毒液負染后電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，病毒呈無囊膜二十面體病毒顆粒，頂角纖絲有斷裂，符合腺病毒的形態(tài)特征（圖1）。綜上，分離株鑒定為FAdV-4，將P3代FAdV-4毒株命名為YNKM2023株。

2.2 YNKM2023株的hexon基因序列分析

對YNKM2023株進行hexon基因的擴增，結(jié)果顯示擴增出與預(yù)期大小相符的約2 889 bp的目的條帶。將擴增產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化至重組質(zhì)粒后測序，采用Mega7.0軟件中的最大似然法將拼接好的核苷酸序列和參考序列生成進化樹，結(jié)果顯示：YNKM2023株與國內(nèi)已報道的雞源、鴨源、鵝源FAdV-4流行毒株序列相似性最高，為99.8%～99.9%，聚為一小分支，與其中已報道的鵝源分離株CG-G株、雞源攻毒株HN151025株和鴨源SDJN株的核苷酸相似性均為99.8%，可以推測國內(nèi)不同地區(qū)不同宿主的FAdV-4 hexon基因變異較小。與印度分離株聚為一大支，核苷酸相似性為99.5%～99.6%，親緣關(guān)系較近。與韓國、墨西哥、奧地利分離株核苷酸相似性為98.5%～98.8%，進化關(guān)系較遠。與非致病性代表株ON1的核苷酸相似性為98.6%（圖2）。

2.3 YNKM2023株TCID50測定與雛鵝回歸感染試驗

將YNKM2023株病毒液經(jīng)10倍梯度稀釋后接種單層LMH細胞，測定病毒TCID50，于接毒后120 h觀察并統(tǒng)計細胞病變孔數(shù)，結(jié)果根據(jù)Reed-Munch法計算病毒含量為106.8TCID50/0.1 mL。

試驗組雛鵝在接種YNKM2023株后第2天，排大量綠色稀糞，第3～6天部分鵝出現(xiàn)羽毛蓬松，至14 d試驗結(jié)束時，均未觀察到特征性臨床癥狀。接種后3 d剖檢時，部分鵝組織器官開始出現(xiàn)病變。第6天時器官病變更加明顯且程度加劇，眼觀發(fā)現(xiàn)：心臟出現(xiàn)少量淺黃色透亮的心包積液（圖3A），肝腫大邊緣出血（圖3B），腎腫脹出血（圖3C），肺水腫出血（圖3D）。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：心肌纖維間隙增大，少量炎性細胞浸潤和液體存在（圖3E）；肝匯管區(qū)局灶性淋巴細胞浸潤，肝細胞明顯發(fā)生腫脹，部分壞死（圖3F）；腎小管上皮細胞發(fā)生變性、壞死，部分管腔發(fā)生閉鎖，間質(zhì)有炎性細胞浸潤（圖3G）；肺泡壁淤血，肺臟局部實變，炎性細胞浸潤（圖3H）。對照組中，心、肝、腎和肺組織眼觀均無明顯病變。鏡下可見，少量心肌炎性細胞浸潤（圖3I）；腎小管上皮細胞輕度變性（圖3K）；肺泡壁少量淤血，局部可見炎性細胞浸潤（圖3L）。PCR核酸檢測結(jié)果顯示，試驗組病變肝均為FAdV-4陽性感染，對照組肝均為陰性（表2）。

2.4 攻毒后鵝血清中和抗體滴度檢測

YNKM2023株感染后，不同時間段血清中和抗體滴度見圖4，結(jié)果顯示，攻毒后第6天可以檢測到特異性中和抗體，至14 d試驗結(jié)束時抗體平均滴度上升為4.1log2。綜合來看，病毒感染后機體產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，抗體滴度呈上升趨勢，但組內(nèi)個體差異較大。

3 討 論

HPS主要是由FAdV-4引起的高度傳染性疾病［9，23］。臨床上該病多見于雞、鴨，鵝群爆發(fā)HPS的報道十分少見。本研究通過將臨床疑似爆發(fā)HPS的鵝組織病料接種LMH細胞，分離到了FAdV-4/YNKM2023株，其P3代細胞毒純凈，病毒含量可達106.8TCID50/0.1 mL。這是國內(nèi)首次報道從鵝群中分離到FAdV-4。

禽腺病毒hexon基因編碼的蛋白具有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇，能引起中和反應(yīng)，如果該基因被替代或發(fā)生突變，將導(dǎo)致中和表位的缺失［13］。FAdV-4中hexon基因的抗原表位區(qū)主要集中在前段、中段，推測其具有型和群特異性表位，在診斷血清型時常作為首選蛋白［24］。對本研究的分離株進行hexon基因核苷酸遺傳進化分析顯示，YNKM2023株與參考株序列相似性為98.5%～99.9%，這表明hexon基因具有嚴格的保守性。同時，與國內(nèi)雞、鴨等不同宿主的分離株高度相似，可以推測國內(nèi)不同地區(qū)不同宿主FAdV-4的hexon基因變異較小。YNKM2023株與印度分離株處于同一進化分支，與韓國、墨西哥、奧地利、加拿大分離株處于不同的進化分支，表明FAdV-4流行存在地理區(qū)域的差異性。

FAdV-4可自然感染雞和鴨，損傷宿主肝細胞、形成心包積液。魏志鵬［25］用鴨源分離株SDJN株的雞胚毒，分別通過口服途徑和皮下注射途徑人工感染不同日齡的泰州鵝，10 d皮下攻毒組的鵝臨床癥狀較為明顯，剖檢病變表現(xiàn)為心包積液，肝、肺、腎、胸腺均呈現(xiàn)不同程度的出血或腫脹現(xiàn)象。李雪峰等［26］通過滴鼻點眼途徑對30日齡鵝接種雞源FAdV-4強毒株后，無明顯的發(fā)病和死亡情況，剖檢靶器官也未見典型眼觀病變，但鵝群排毒，并且產(chǎn)生了中和抗體。Li等［27］研究發(fā)現(xiàn)，將對SPF雞致病性強的FAdV-4病毒液感染SPF鴨，臨床幾乎沒有表現(xiàn)出異常體征變化，也無肉眼可見或組織病理學(xué)病變，器官中也未檢測到病毒存在。說明FAdV-4的感染受到日齡、感染方式、宿主品種等因素的影響。與上述研究不同的是，本試驗用于攻毒的YNKM2023株是鵝源分離株，于皮下接種10日齡泰州鵝后，未出現(xiàn)特征性臨床癥狀，但攻毒后3、6、14 d出現(xiàn)不同比例的部分組織器官病變，且在病變的肝組織中檢測到FAdV-4核酸，說明YNKM2023株可以在雛鵝體內(nèi)復(fù)制引起HPS特征性的病變，對鵝表現(xiàn)出一定的致病性。本研究中感染組并未表現(xiàn)出軟脖子、零星死亡等自然感染的臨床癥狀，可能是與分離株的致病性較低有關(guān)，也可能是不同品種的鵝對病毒的抗感染能力不同所致，具體原因還需進一步驗證。

中和抗體可以通過結(jié)合抗原、中和病原體來阻止病原體感染靶細胞，使得與其結(jié)合后的病原體失去感染性，因此，檢測抗FAdV-4的中和抗體水平是評估感染狀況的有效方法。FAdV-4的衣殼蛋白（hexon、penton base、fiber-1和fiber-2）在雞中誘導(dǎo)體液和/或細胞免疫應(yīng)答，并對HPS有保護作用［28-31］。Watanabe等［32］使用FAdV-4重組Fiber-1蛋白制備疫苗免疫2周齡的SPF雞，誘導(dǎo)了高水平的中和抗體，且顯著抑制了雞的病毒載量，也抑制了由FAdV-4感染引起的肝細胞死亡，維持了正常的肝功能。本研究中試驗組于感染后6、14 d均檢測到中和抗體，說明病毒能夠感染機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。雖然第6天可以檢測到中和抗體，但此時剖檢發(fā)現(xiàn)組織病變比例高且病變較為嚴重，可能是感染前期群體抗體滴度低、個體差異大，不能有效中和病毒，使得病毒感染造成多器官出血腫大和炎癥。第14天時，伴隨著群體中和抗體滴度升高個體差異降低，組織器官病變比例降低、病變減輕，推測可能是中和抗體抑制了機體的病毒載量，降低了由FAdV-4感染引起的細胞死亡。本研究接種FAdV-4后產(chǎn)生中和抗體的變化規(guī)律與Guo等［33］的報道一致。

目前，用于試驗的無特定病原體（Specific pathogen free，SPF）鵝較難獲得，而水禽本身容易攜帶多種病毒而臨床并無發(fā)病表現(xiàn)［34-35］。本研究先后從多個優(yōu)質(zhì)鵝場獲取種蛋，孵化、隔離飼養(yǎng)并檢測抗原抗體雙陰性后才用于試驗。重復(fù)試驗證明，只有試驗組表現(xiàn)出典型的HPS病理特征，而對照組病理變化并不典型。在今后的研究中，可以嘗試建立和篩選SPF鵝場，也可以選擇更多來源的種蛋或雛鵝進行嘗試。

4 結(jié) 論

本研究從昆明某鵝場疑似爆發(fā)HPS的肝組織樣品中成功分離出1株鵝源FAdV-4株（YNKM2023株）。據(jù)hexon基因遺傳演化分析，該毒株與國內(nèi)已有的雞鴨流行毒株高度同源，尚未發(fā)生明顯的基因漂移。接種感染與自然感染的雛鵝均出現(xiàn)與雞相似的HPS典型病變。這是國內(nèi)首次報道從自然感染的鵝群中分離到FAdV-4，并對雛鵝進行致病性試驗研究，進一步豐富了FAdV-4的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，也為FAdV-4感染鵝的臨床診斷及防控研究提供了參考資料。

參考文獻（References）：

［1］ BENKO″ M，AOKI K，ARNBERG N，et al.ICTV virus taxonomy profile：Adenoviridae 2022［J］.J Gen Virol，2022，103（3）：001721.

［2］ CUI N，LU M，SUN S P，et al.Illumina high-throughput sequencing for the genome of emerging fowl adenovirus D species and C species simultaneously［J］.Poult Sci，2023，102（1）：102295.

［3］ WANG K L，LIU C，DU X S，et al.Complete genome sequence and pathogenicity analysis of a highly pathogenic FAdV-4 strain［J］.Res Vet Sci，2023，159：84-92.

［4］ LEBDAH M，ALSHAYA D S，JALAL A S，et al.Molecular characterization of aviadenovirus serotypes and pathogenicity of the identified adenovirus in broiler chickens［J］.Poult Sci，2022，101（12）：101918.

［5］ LIU J Y，MEI N，WANG Y L，et al.Identification of a novel immunological epitope on Hexon of fowl adenovirus serotype 4［J］.AMB Express，202 11（1）：153.

［6］ GUAN R，TIAN Y M，HAN X X，et al.Complete genome sequence and pathogenicity of fowl adenovirus serotype 4 involved in hydropericardium syndrome in Southwest China［J］.Microb Pathog，2018，117：290-298.

［7］ LIU Y K，WAN W Y，GAO D S，et al.Genetic characterization of novel fowl aviadenovirus 4 isolates from outbreaks of hepatitis-hydropericardium syndrome in broiler chickens in China［J］.Emerg Microbes Infect，2016，5（11）：e117.

［8］ NIU Y，SUN Q，ZHANG G，et al.Epidemiological investigation of outbreaks of fowl adenovirus infections in commercial chickens in China［J］.Transbound Emerg Dis，2018，65（1）：e121-e126.

［9］ GRGIC＇ H，POLJAK Z，SHARIF S，et al.Pathogenicity and cytokine gene expression pattern of a serotype 4 fowl adenovirus isolate［J］.PLoS One，2013，8（10）：e77601.

［10］ SCHACHNER A，MATOS M，GRAFL B，et al.Fowl adenovirus-induced diseases and strategies for their control-a review on the current global situation［J］.Avian Pathol，2018，47（2）：111-126.

［11］ LI H X，WANG J，QIU L Y，et al.Fowl adenovirus species C serotype 4 is attributed to the emergence of hepatitis-hydropericardium syndrome in chickens in China［J］.Infect Genet Evol，2016，45：230-241.

［12］ ZHAO J，ZHONG Q，ZHAO Y，et al.Pathogenicity and complete genome characterization of fowl adenoviruses isolated from chickens associated with inclusion body hepatitis and hydropericardium syndrome in China［J］.PLoS One，2015，10（7）：e0133073.

［13］ VERA-HERN NDEZ P F，MORALES-GARZ N A，CORT S-ESPINOSA D V，et al.Clinicopathological characterization and genomic sequence differences observed in a highly virulent fowl Aviadenovirus serotype 4［J］.Avian Pathol，2016，45（1）：73-81.

［14］ MENG F F，DONG G W，ZHANG Y B，et al.Co-infection of fowl adenovirus with different immunosuppressive viruses in a chicken flock［J］.Poult Sci，2018，97（5）：1699-1705.

［15］ YU G L，WANG Y W，ZHANG M M，et al.Pathogenic，phylogenetic，and serological analysis of group I fowl adenovirus serotype 4 SDSX isolated from Shandong，China［J］.Front Microbiol，2018，9：2772.

［16］ CHEN H，DOU Y，ZHENG X，et al.Hydropericardium hepatitis syndrome emerged in cherry valley ducks in China［J］.Transbound Emerg Dis，2017，64（4）：1262-1267.

［17］ 李昌靜，王冬冬，王建琳，等.鴕鳥Ⅰ群禽腺病毒的分離鑒定、血清型鑒定以及Hexon蛋白基因序列分析［J］.中國獸醫(yī)雜志，2016，52（12）：14-16，20.

LI C J，WANG D D，WANG J L，et al.Gene sequence analysis of Hexon protein and separation identification and serotype identification of fowl adenovirus group I in ostrich［J］.Chinese Journal of Veterinary Medicine，2016，52（12）：14-16，20.（in Chinese）

［18］ 習(xí) 碩，趙 蕾，靳 換，等.鴿源禽腺病毒的分離鑒定及全基因序列分析［J］.中國家禽，2022，44（4）：108-112.

XI S，ZHAO L，JIN H，et al.Isolation，identification and whole genome sequence analysis of adenovirus Isolate from pigeon［J］.China Poultry，2022，44（4）：108-112.（in Chinese）

［19］ WANG X W，LI D Y，DENG Y，et al.Molecular characterization and pathogenicity of a fowl adenovirus serotype 4 isolated from peacocks associated with hydropericardium hepatitis syndrome［J］.Infect Genet Evol，202 90：104766.

［20］ 張 宇，喬 涵，徐朋麗，等.禽腺病毒4型河南株Hexon全基因的克隆及遺傳進化分析［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2017，45（6）：30-36.

ZHANG Y，QIAO H，XU P L，et al.Cloning and sequence analysis of full-length Hexon gene of fowl adenovirus-4 strain in Henan［J］.Journal of Northwest Aamp;F University：Natural Science Edition，2017，45（6）：30-36.（in Chinese）

［21］ 劉晨晨.2018—2019年江蘇地區(qū)禽流感病毒的流行病學(xué)調(diào)查與H3和H9亞型禽流感病毒遺傳進化分析［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

LIU C C.Epidemiological investigation and genetic evolution analysis of avian influenza viruses of H3 and H9 subtypes in Jiangsu province in 2018-2019［D］.Nanjing：Nanjing Agricultural University，2020.（in Chinese）

［22］ GUERIN J L，GELFI J，DUBOIS L，et al.A novel polyomavirus （goose hemorrhagic polyomavirus） is the agent of hemorrhagic nephritis enteritis of geese［J］.J Virol，2000，74（10）：4523-4529.

［23］ LI W，YOU G J，HAIYILATI A，et al.Critical role of viral protein Hexon in hypervirulent fowl adenovirus serotype-4-induced autophagy by interaction with BAG3 and promotion of viral replication in LMH cells［J］.J Virol，2023，97（6）：e0028423.

［24］ RAHIMI M，RAHIMI S，KARIMI TORSHIZI M A，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor gamma （PPARγ） activation：a potential treatment for ascites syndrome in broiler chickens［J］.Poult Sci，2023，102（9）：102859.

［25］ 魏志鵬.一株鴨源血清4型I群禽腺病毒的分離鑒定及其對鵝的致病性［D］.泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

WEI Z P.Isolation and identification of a duck-derived fowl adenovirus serotype 4 and its pathogenicity to goose［D］.Tai’an：Shandong Agricultural University，2019.（in Chinese）

［26］ 李雪峰，姜 磊，孫金艷，等.人工感染禽腺病毒血清4型對鵝天然免疫反應(yīng)的影響［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2020，50（2）：222-232.

LI X F，JIANG L，SUN J Y，et al.Effects of artificially infected fowl adenovirus serotype 4 on natural immune response of geese［J］.Chinese Veterinary Science，2020，50（2）：222-232.（in Chinese）

［27］ LI R，LI G，LIN J，et al.Fowl adenovirus serotype 4 SD0828 infections causes high mortality rate and cytokine levels in specific pathogen-free chickens compared to ducks［J］.Front Immunol，2018，9：49.

［28］ SCHACHNER A，MAREK A，JASKULSKA B，et al.Recombinant FAdV-4 fiber-2 protein protects chickens against hepatitis-hydropericardium syndrome （HHS）［J］.Vaccine，2014，32（9）：1086-1092.

［29］ 遲麗麗，王君娜，張宇名，等.禽腺病毒4型fiber-2與8b型fiber截短融合蛋白的原核表達及其免疫原性分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2023，54（12）：5162-5170.

CHI L L，WANG J N，ZHANG Y M，et al.Prokaryotic expression and immunogenicity analysis of truncated fusion protein of FAdV-4 fiber2 and FAdV-8b fiber［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2023，54（12）：5162-5170.（in Chinese）

［30］ WANG X L，TANG Q X，CHU Z L，et al.Immune protection efficacy of FAdV-4 surface proteins fiber- fiber-2，Hexon and penton base［J］.Virus Res，2018，245：1-6.

［31］ TUFAIL S，SHAH M A，ZAFAR M，et al.Identification of potent epitopes on Hexon capsid protein and their evaluation as vaccine candidates against infections caused by members of Adenoviridae family［J］.Vaccine，202 39（27）：3560-3564.

［32］ WATANABE S，YAMAMOTO Y，KUROKAWA A，et al.Recombinant fiber-1 protein of fowl adenovirus serotype 4 induces high levels of neutralizing antibodies in immunized chickens［J］.Arch Virol，2023，168（3）：84.

［33］ GUO Y W，XIE S H，XU Z Q，et al.An efficient and rapid assay for detecting neutralizing antibodies against serotype 4 fowl adenovirus［J］.Front Vet Sci，2022，9：867697.

［34］ XU X N，SCREATON G R，MCMICHAEL A J.Virus infections：escape，resistance，and counterattack［J］.Immunity，200 15（6）：867-870.

［35］ KANG H M，CHOI J G，KIM K I，et al.Genetic and antigenic characteristics of H4 subtype avian influenza viruses in Korea and their pathogenicity in quails，domestic ducks and mice［J］.J Gen Virol，2013，94（1）：30-39.

（編輯 范子娟）