鴨疫里氏桿菌LC1和CX1株的分離鑒定及致病性分析

摘 要： 旨在對(duì)福建莆田某養(yǎng)殖場(chǎng)疑似感染鴨傳染性漿膜炎患病番鴨病料進(jìn)行菌株的分離、純化、鑒定和致病性分析。采集10日齡患病番鴨的腦、肝組織進(jìn)行菌株分離純化、16S rDNA PCR鑒定和血清型鑒定，并檢測(cè)分離純化菌株的致病性。結(jié)果得到2株11型鴨疫里氏桿菌，分別將其命名為L(zhǎng)C1和CX1。對(duì)2株分離株進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)序，開(kāi)展遺傳進(jìn)化分析和MLST分型，發(fā)現(xiàn)LC1和CX1分離株16S rDNA遺傳進(jìn)化上與鴨疫里氏桿菌福建分離株RAf115和上海分離株Yb2處在同一進(jìn)化分支上，相似性為99.9%。測(cè)定其耐藥性發(fā)現(xiàn)，分離株對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類及四環(huán)素敏感，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類和氨基糖苷類等抗菌素不敏感。進(jìn)一步檢測(cè)該分離株對(duì)雛番鴨致病性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩株菌株（1.3×106 CFU·mL－1）的致死率為100%，且病死鴨表現(xiàn)典型心包炎、肝周炎、氣囊炎和脾腫大的鴨疫里氏桿菌病。病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)，致死鴨脾紅白髓界線消失，呈現(xiàn)大量壞死灶。此外，兩分離株致死鴨的心肌纖維呈撕裂狀病變。綜上，本研究分離并鑒定2株11型鴨疫里氏桿菌LC1和CX MLST分型分別為ST111、ST114，為鴨疫里氏桿菌病的防控及后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 鴨疫里氏桿菌；LC1；CX1；遺傳進(jìn)化分析；致病性

中圖分類號(hào)：S852.617

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)： 0366-6964（2024）09-4196-08

Isolation， Identification and Pathogenicity Analysis of Riemerella anatipestifer

Strain LC1 and CX1

XIE" Bilin "LIN" Zhimin "LIN" Binbin "XU" Yijuan "LIN" Fengqiang2， YAN" Lu2， WU" Huini2，

LI" Cuiting2， ZHOU" Haiou2， LI" Zhaolong2*

（1.Putian Institute of Agricultural Sciences， Putian 351100，" China;

2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Fujian Academy of

Agricultural Sciences， Fuzhou 350013，" China）

Abstract： In currently study， LC1 and CX1 of Riemerella anatipestifer type 11 were isolated and purified from the brain and liver tissue of 10-day-old ducks，The aim of this study was to isolate， purify， identify and analyze the pathogenicity of the strains from the disease material of Muscovy ducks which suspected to be infected with infectious serositis from a farm in Putian， Fujian Province， China. Brain and liver tissues of 10-day-old diseased Muscovy ducks were collected for strain isolation and purification， and 16S rDNA PCR identification and serotyping were conducted， respectively. The isolates were subjected to 16S rDNA sequencing and genetic evolutionary analyses， and their drug resistance and pathogenicity to ducklings were determined. The 16S rDNA sequence sequencing and genetic evolution of these isolates were analyzed， and their drug resistance and pathogenicity to ducklings were further determined. （Results） The results showed that 2 strains of Riemerella anatipestifer type 11 were obtained and named as LC1 and CX1. The 16S rDNA sequences of LC1 and CX1 showed that the isolates were in the same evolutionary branch as the reference strains of Riemerella anatipestifer Fujian strain RAf115 and Shanghai strain Yb2， with 99.9% similarity. The isolates were sensitive to β-lactams， chloramphenicol， and tetracyclines， but less sensitive to macrolides and aminoglycosides. The pathogenicity assay indicated that the mortality of the two strains （1.3×106 CFU·mL-1） was 100%， and the lethal ducks showed the typical Riemer’s disease with pericarditis， perihepatitis， and enlarged spleen.The pathology results of the HE staining showed that the red-white medullary boundary of the spleen of the lethal ducks disappeared， and a large number of necrotic foci were presented. In addition， myocardial fibers of lethal ducks from the two isolates showed tear-like lesions. These datas demonstrated that two strains of Riemerella anatipestifer type 11 LC1 and CX1 were isolated and characterized， MLST to be ST111 and ST114， respectively， which provide reference basis for the prevention and control of Riemerella anatipestifer disease and subsequent research.

Key words： Riemerella anatipestifer; LC1; CX1; genetic evolution analysis; pathogenicity

*Corresponding author： LI Zhaolong，E-mail： lizhaolong522@163.com

鴨傳染性漿膜炎的病原為鴨疫里氏桿菌（Riemerella anatipestifer， RA），是一種以心包炎、肝周炎、氣囊炎（俗稱“三炎”）為病理變化的接觸性，急性敗血癥的傳染病。它是一種不運(yùn)動(dòng)、無(wú)芽孢的革蘭陰性短桿菌［1］，能感染鴨、鵝和火雞等［2-3］，國(guó)內(nèi)學(xué)者郭玉璞等［4］曾從北京的商品鴨場(chǎng)首次分離到1型RA并確診為鴨傳染性漿膜炎。近年來(lái)RA感染的報(bào)道常見(jiàn)于文獻(xiàn)，其高致死率給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的重要致病菌之一［5-8］。

由于RA是一種多血清型病原，且各血清型間無(wú)交叉保護(hù)性［9］，通過(guò)研制疫苗防控該病相對(duì)困難，因此，掌握發(fā)病地RA流行菌株的血清型分布顯得非常必要。此外，當(dāng)前臨床上多用抗生素來(lái)預(yù)防和治療RA病，但由于抗生素的不合理使用，導(dǎo)致RA菌株耐藥性高和耐藥基因傳播廣，多重耐藥現(xiàn)象頻現(xiàn)［10］。因此，開(kāi)展分離菌株的耐藥性研究對(duì)該病的防治具有重大的意義。本研究對(duì)分離自莆田地區(qū)的2株鴨疫里氏桿菌進(jìn)行鑒定，并開(kāi)展耐藥性及血清型等方面研究，以期為本地區(qū)的RA病的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、麥康凱瓊脂購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；新生胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司，藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，2×Taq PCR MasterMix、DL2000 DNA Marker、GeneRed核酸染料、瓊脂糖、TE緩沖液購(gòu)自生工生物公司；試驗(yàn)所使用引物的合成和測(cè)序工作均由生工生物公司完成。鴨疫里氏桿菌血清分型的標(biāo)準(zhǔn)血清及大腸桿菌ATCC 25922菌株由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。

1.2 病例

病料組織分別采集自福建省莆田市荔城區(qū)和城廂區(qū)的番鴨養(yǎng)殖場(chǎng)。番鴨的臨床癥狀為跛行、神經(jīng)癥狀、急性死亡等情況，剖檢見(jiàn)心包炎、氣囊炎和肝周炎，脾腫大，呈大理石樣病變。

1.3 細(xì)菌分離及鑒定

無(wú)菌操作采集病鴨腦部、肝等組織，用無(wú)菌接種環(huán)輕觸組織表面，三區(qū)劃線法接種至含有2%胎牛血清的TSA（下文中使用的TSA/TSB中均含有2%胎牛血清，不再重新標(biāo)注）培養(yǎng)皿中，于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24～48 h，隨后挑取疑似鴨疫里氏桿菌于TSB液體培養(yǎng)基中，置37 ℃搖床160 r·min－1振蕩培養(yǎng)24 h。用無(wú)菌接種環(huán)蘸取液體培養(yǎng)液，劃線到TSA培養(yǎng)皿中，如此操作3次后，獲得純培養(yǎng)物，并對(duì)其進(jìn)行革蘭染色鑒定。分離菌的TSB培養(yǎng)物在30%的甘油保存液中-80℃凍存。

1.4 PCR鑒定及血清型分型

按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明，提取分離菌的核酸，用80 μL洗脫液溶解后存-20 ℃?zhèn)溆?。參考文獻(xiàn)［11］，合成鴨疫里氏桿菌PCR鑒定特異性引物（RA-F：CTTCGGATACTTGAGAGCG，RA-R：GCAGCACCTTGAAAATTGT），稀釋到10 μmol·L－1凍存?zhèn)溆?。?yīng)用以上引物對(duì)單一菌落純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)［11］進(jìn)行。采用瓊脂擴(kuò)散法［12-13］開(kāi)展分離菌的血清型分型鑒定。

1.5 生化特性鑒定

用微量移液槍吸取5 μL分離菌純培養(yǎng)物分別接種至生化反應(yīng)管內(nèi)，反應(yīng)管包括葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、蛋白胨水、葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水、枸櫞酸鹽、硝酸鹽還原、硫化氫、明膠、精氨酸、賴氨酸、尿素和氧化酶等，置37 ℃ CO2培養(yǎng)24～48 h，觀測(cè)結(jié)果并記錄。

1.6 分離株的藥敏試驗(yàn)

根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，采用K-B紙片法，以大腸桿菌ATCC 25922菌株為質(zhì)控，對(duì)分離菌進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、多肽類和酰胺醇類的部分抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)。

吸取120 μL分離菌培養(yǎng)液（1.3×108 CFU·mL－1），用無(wú)菌涂布棒在TSA平板上均勻涂抹，待無(wú)明顯液體后，將藥敏紙片均勻敷貼在平板上，在含5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀測(cè)并記錄抑菌情況。

1.7 MLST分型

依據(jù)參考文獻(xiàn)［14］報(bào)道的鴨疫里氏桿菌的7個(gè)管家基因的引物序列，合成相應(yīng)管家基因的引物（dnaB，groEL，gyrA，mdh，gluD，gpi，rpoB，具體序列見(jiàn)表1），對(duì)分離株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，陽(yáng)性樣品送生物公司測(cè)序。測(cè)序返回的序列經(jīng)拼接后，與數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubmlst.org/）進(jìn)行比對(duì)，獲取分離株的ST分型數(shù)據(jù)。

1.8 分離株的雛番鴨回歸試驗(yàn)

挑取鴨疫里氏桿菌純培養(yǎng)單菌落至TSB中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，6 000×g離心10 min，棄去上清，用移液器吸取無(wú)菌PBS吹吸沉淀重懸并離心，重復(fù)2次后用無(wú)菌PBS調(diào)整至合適濃度存4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

購(gòu)買規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的7日齡健康番鴨45只，隨機(jī)分成3組，每組15只，按照常規(guī)飼養(yǎng)7 d。其中一組以無(wú)菌PBS腿肌注射，其余2組分別以1.3×106 CFU·mL－1腿肌注射感染分離菌株，每只注射1 mL。感染后予以觀察1周，每天3次，記錄雛番鴨癥狀和死亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離及鑒定

三區(qū)劃線的TSA平板上長(zhǎng)有半透明圓形菌落，邊緣整齊，直徑為1 mm左右的菌落。經(jīng)革蘭染色鑒定，分離菌為革蘭陰性的短桿菌，分別命名為L(zhǎng)C1和CX1。

2.2 PCR鑒定及血清型分型

對(duì)分離菌進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在960 bp處有條帶（圖1A）。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生物公司測(cè)序，返回的序列拼接后于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，與鴨疫里氏桿菌的序列相似性超過(guò)99%，確定以上2株分離菌均為鴨疫里氏桿菌（分離株的序列信息已上傳至國(guó)家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心https：//ngdc.cncb.ac.cn/，LC1登錄號(hào)：0002618; CX1登錄號(hào)：0002624），系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖1B。鴨疫里氏桿菌福建分離株RAf115和上海分離株Yb2處在同一進(jìn)化分支上，相似性為99.9%。瓊脂擴(kuò)散法鑒定分離株的血清型，以上2株分離株均為11型。

2.3 生化特性

對(duì)2株分離菌生化特性鑒定后發(fā)現(xiàn)，其生化特性相同，均不發(fā)酵糖類（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖），枸櫞酸鹽、靛基質(zhì)、MR-VP、硝酸鹽還原等試驗(yàn)均為陰性，未能液化明膠，不產(chǎn)生硫化氫，氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，符合鴨疫里氏桿菌的生化特性。

2.4 分離株的耐藥表型

K-B紙片法測(cè)定分離株對(duì)抗菌藥的耐藥情況，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，分離株對(duì)β-內(nèi)酰胺類的青霉素G、氨芐西林、頭孢曲松，酰胺醇類的氟苯尼考及四環(huán)素的四環(huán)素和強(qiáng)力霉素等敏感，對(duì)氨基糖苷類的慶大霉素、艾米卡星和新霉素，大環(huán)內(nèi)酯類和磺胺類的部分抗菌素不敏感。

2.5 MLST分型

LC1和CX1分離株的7對(duì)管家基因引物的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳顯示，分別在570、519、797、532、769、575和686 bp處有相應(yīng)的條帶（圖2），與文獻(xiàn)報(bào)道［14］一致。

測(cè)序返回的序列經(jīng)過(guò)拼接后，將基因序列提交到MLST網(wǎng)站［15］比對(duì)，在數(shù)據(jù)庫(kù)中未查詢到管家基因組合的ST分型，提示分離株為新的ST分型。將分離株的管家基因序列上傳數(shù)據(jù)庫(kù)后，新分配的ST分型見(jiàn)表3。

2.6 LC1和CX1分離株的致病性試驗(yàn)

LC1和CX1分離株分別接種15只14日齡雛番鴨后能夠復(fù)制鴨傳染性漿膜炎的臨床典型癥狀，主要表現(xiàn)為精神萎靡，采食量降低、不喜飲水甚至廢絕，排綠色糞便，24 h內(nèi)出現(xiàn)少食或拒食，行走不穩(wěn)。48 h部分鴨子出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、頭頸震顫、轉(zhuǎn)圈、角弓反張等神經(jīng)癥狀。在接種48 h后試驗(yàn)雛番鴨開(kāi)始出現(xiàn)死亡，發(fā)病率100%，至試驗(yàn)結(jié)束共死亡30只，死亡率100% （圖3）；對(duì)照組試驗(yàn)雛番鴨無(wú)死亡，精神狀態(tài)和飲食均正常。

病死試驗(yàn)雛番鴨剖檢肉眼可見(jiàn)心及心包、肝表面均有白色的纖維素沉著，氣囊混濁增厚，有干酪樣的纖維素性滲出物，膽囊充盈、脾腫大等。圖4所示的脾臟HE染色顯示，LC1和CX1分離株導(dǎo)致雛番鴨脾紅髓白髓界線不清，生發(fā)中心不明顯，脾臟嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量大增，并出現(xiàn)明顯的破裂和死亡（圖4）。此外，致死番鴨心肌纖維呈撕裂樣病變，肝細(xì)胞腫脹，間隙大。從鴨疫里氏桿菌分離株攻毒試驗(yàn)的雛番鴨病變組織中均可分離鑒定到攻毒菌，革蘭染色呈陰性短小桿菌，生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果與分離株一致。因此，根據(jù)LC1和CX1的分離鑒定結(jié)果和敏感動(dòng)物的回歸試驗(yàn)，確定從莆田雛番鴨養(yǎng)殖場(chǎng)中分離得到2株鴨疫里氏桿菌。

3 討 論

鴨疫里氏桿菌的血清型較多，有25種血清型，且在各省份的流行優(yōu)勢(shì)血清型不盡相同［9］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，吉林省主要流行1型和2型，福建省主要以2型和11型為主，貴州三穗?yún)^(qū)流行2型菌株［16］。因血清型之間缺乏交叉保護(hù)，鴨疫里氏桿菌病的防控較為困難，該病已成為危害水禽養(yǎng)殖行業(yè)最為嚴(yán)重的疫病之一。

當(dāng)前各地區(qū)防控鴨疫里氏桿菌病首要任務(wù)是確定各自發(fā)病菌株的血清型及敏感抗菌素，隨后才能制訂完善的免疫計(jì)劃或采用相對(duì)應(yīng)的抗菌素予以治療，降低經(jīng)濟(jì)損失。但由于藥敏試驗(yàn)的滯后性和繁瑣性，導(dǎo)致大部分番鴨養(yǎng)殖業(yè)主在日常飲水中盲目添加抗菌素，因此臨床上抗菌素的不合理治療造成細(xì)菌耐抗菌素的種類越來(lái)越多。開(kāi)展鴨疫里氏桿菌病細(xì)菌耐藥譜的研究，是當(dāng)前防控該病的首要任務(wù)。陸續(xù)有報(bào)道鴨疫里氏桿菌分離株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類等多種抗菌素不敏感，對(duì)β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類等抗菌素敏感［10，17］。本研究分離自兩個(gè)番鴨養(yǎng)殖場(chǎng)的2株鴨疫里氏桿菌，經(jīng)PCR鑒定和生化試驗(yàn)，血清型均為11型，對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類及四環(huán)素類敏感，分離株對(duì)抗菌藥的敏感性與林彬彬等［12］研究報(bào)道一致。

多位點(diǎn)序列分型（MLST）技術(shù)是通過(guò)分析菌株的酶管家基因序列，準(zhǔn)確記錄細(xì)菌基因水平上的進(jìn)化，以揭示分離株的地理來(lái)源及進(jìn)化時(shí)間，且分型信息可以方便地在不同實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行共享，可用于細(xì)菌的流行病學(xué)和進(jìn)化等方面的研究［14，18］。本研究通過(guò)PCR方法克隆出RA的7個(gè)管家基因，提交到數(shù)據(jù)庫(kù)未獲得ST分型號(hào)，提示分離的菌株可能為新的ST型。在MLST數(shù)據(jù)庫(kù)查詢到4個(gè)ST型與本研究分離的2株RA菌株僅有1個(gè)管家基因（gpi）的差異，說(shuō)明RA在一定的范圍內(nèi)發(fā)生基因突變。2株分離菌與福建分離株RAf115和上海分離株Yb2處在同一進(jìn)化分支上，具有較高的同源性。

鴨感染RA的不同血清型菌株的臨床癥狀和解剖病變大體一致，心、肝和氣囊等臟器均有纖維性沉著現(xiàn)象［19］。陳國(guó)權(quán)等［20］分離鑒定的11型RA動(dòng)物回歸試驗(yàn)的結(jié)果顯示，攻毒的鴨子出現(xiàn)頭頸歪斜，角弓反張等神經(jīng)癥狀，解剖見(jiàn)心、肝、氣囊有纖維素附著；組織切片見(jiàn)心外膜，肝脾被膜外滲出的纖維素中有白細(xì)胞聚集的現(xiàn)象。本研究為了進(jìn)一步驗(yàn)證分離株的毒力情況，將分離株進(jìn)行敏感動(dòng)物回歸試驗(yàn)，能夠成功復(fù)現(xiàn)鴨疫里氏桿菌的典型臨床癥狀和組織病變。感染后的鴨子出現(xiàn)不同程度的少食、行走不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)等臨床癥狀；解剖病死鴨子發(fā)現(xiàn)鴨傳染性漿膜炎典型的“三炎”病變，肝脾腫大，心、肝和脾組織切片HE染色圖可見(jiàn)不同程度的病變和白細(xì)胞聚集，進(jìn)一步證實(shí)了該分離株的毒力。

由于鴨疫里氏桿菌具有多血清型且無(wú)交叉保護(hù)性的特點(diǎn)，應(yīng)用滅活全菌疫苗在預(yù)防該疫病的其他血清型顯得無(wú)能為力，但是安全有效的疫苗仍然是防控鴨疫里氏桿菌病較理想的途徑。

4 結(jié) 論

本研究成功地從兩個(gè)番鴨養(yǎng)殖場(chǎng)分離得到2株鴨疫里氏桿菌，分離株的血清型均為11型，經(jīng)過(guò)動(dòng)物回歸試驗(yàn)，證明該分離株具有強(qiáng)的致病性。通過(guò)K-B法分析，該2株分離株對(duì)β-內(nèi)酰胺類的青霉素G、氨芐西林、頭孢曲松，酰胺醇類的氟苯尼考及四環(huán)素類和強(qiáng)力霉素等敏感，對(duì)氨基糖苷類的慶大霉素、阿米卡星和新霉素，大環(huán)內(nèi)酯類和磺胺類的部分抗菌素缺乏敏感，為臨床患病的鴨場(chǎng)治療提供用藥指導(dǎo)。ST分型特性為鴨疫里氏桿菌的流行病學(xué)調(diào)查和細(xì)菌的跨區(qū)域傳播普查提供依據(jù)。

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（編輯 范子娟）