羅伊氏黏液乳桿菌通過(guò)抑制ROS依賴性NLRP3炎性通路緩解大鼠腸缺血/再灌注損傷

摘 要： 本研究旨在以ROS/NLRP3炎性小體為切入點(diǎn)，探討羅伊氏黏液乳桿菌（Limosilactobacillus reuteri，LR）改善腸缺血性再灌注損傷（intestinal ischemia-reperfusion injury，IR）的作用機(jī)制。通過(guò)缺氧/復(fù)氧方法來(lái)構(gòu)建IR細(xì)胞模型，以及微動(dòng)脈夾夾閉/灌注方法來(lái)構(gòu)建大鼠IR模型。細(xì)胞試驗(yàn)分為4組，對(duì)照組、缺血再灌注細(xì)胞模型組、羅伊氏黏液乳桿菌預(yù)處理組、羅伊氏黏液乳桿菌組。動(dòng)物試驗(yàn)分為3組（每組10只大鼠），假手術(shù)組、缺血再灌注損傷組、羅伊氏黏液乳桿菌灌胃處理組。檢測(cè)各組ROS水平，NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白（NLRP3、ASC、Caspase p10、GSDMD）表達(dá)情況，炎性相關(guān)指標(biāo)（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10）水平，氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)（ROS、SOD、GSH-Px、MDA）含量，并進(jìn)行病理組織學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，1）羅伊氏黏液乳桿菌可以減弱IR導(dǎo)致的氧化應(yīng)激以及NLRP3炎性小體的激活。2）羅伊氏黏液乳桿菌通過(guò)減弱ROS的表達(dá)來(lái)緩解NLRP3炎性小體的激活。3）羅伊氏黏液乳桿菌能夠緩解IR對(duì)腸道組織的損傷，以及炎性因子的表達(dá)。綜上所述，LR可緩解大鼠腸IR和氧化應(yīng)激，其作用機(jī)制與抑制ROS依賴性NLRP3炎性小體有關(guān)，為L(zhǎng)R在腸道相關(guān)疾病的獸醫(yī)臨床治療提供試驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 羅伊氏黏液乳桿菌；腸缺血再灌注損傷；活性氧；NLRP3炎性小體

中圖分類號(hào)： S854.1615

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)： 0366-6964（2024）09-4186-10

Limosilactobacillus reuteri Alleviates Intestinal Ischemia/Reperfusion Injury

in Rats by Inhibiting the ROS Dependent NLRP3 Inflammatory Pathway

LI" Ya’nan， MA" Tianwen， YANG" Xiaoyu， WU" Jiaxin， L Xiaoping， REN" Hao， RUAN" Hongri，

LIU" Ying， ZHANG" Jiantao， WEI" Chengwei*

（College of Veterinary Medicine， Northeast Agricultural University， Heilongjiang Key Laboratory

of Animal Disease Pathogenesis and Comparative Medicine， Harbin 150030，" China）

Abstract：" The aim of this study is to explore the mechanism of Limosilactobacillus reuteri （LR） improving intestinal ischemia-reperfusion injury （IR） using ROS/NLRP3 inflammasome as a starting point. The IR cell model was constructed using hypoxia/reoxygenation methods， and the rat IR model was constructed using microarterial clamping/perfusion methods. The cell experiment was divided into four groups： control group， IR group， LR pre-treatment group （LR+IR group）， and LR group. The animal experiment was divided into three groups （10 rats in each group）： sham surgery group （S group）， IR group， and LR gavage treatment group （LR+IR group）. The level of ROS， the expression of NLRP3 inflammasome related proteins （NLRP3， ASC， Caspase p10， and GSDMD）， the levels of inflammation-related indicators， and the content of oxidative stress related indicators in each group were detected. Histopathological evaluation was also performed. The results showed that： 1） LR attenuates IR induced oxidative stress and NLRP3 inflammasome activation. 2） LR alleviates NLRP3 inflammasome activation by attenuating ROS expression. 3） LR could alleviate intestinal injury and the expression of inflammatory factors induced by IR. In summary， LR can alleviate intestinal IR and oxidative stress in rats， and its mechanism of action is related to the inhibition of ROS dependent NLRP3 inflammasome， providing experimental basis for the veterinary clinical treatment of LR in intestinal related diseases.

Key words： Limosilactobacillus reuteri; intestinal ischemia-reperfusion injury; reactive oxygen species; NLRP3 inflammasome

*Corresponding author：" WEI Chengwei， E-mail： neauweiwei@126.com

腸缺血/再灌注損傷（intestinal ischemia-reperfusion injury，IR）是由于腸道血液供應(yīng)急劇減少而導(dǎo)致的一種多因素且復(fù)雜的病理生理過(guò)程［1］。IR在獸醫(yī)臨床上非常常見(jiàn)，尤其是腸道極易發(fā)生IR損傷［2］。與腸道IR相關(guān)的疾病有很多，包括腸套疊、腸扭轉(zhuǎn)、嵌頓疝、急性腸缺血、絞窄性腸梗阻、創(chuàng)傷、休克和外科手術(shù)（例如腸切除和移植）等［3-4］。腸道IR通過(guò)損害腸上皮細(xì)胞導(dǎo)致腸道屏障功能障礙，從而促進(jìn)細(xì)菌和內(nèi)毒素從腸道轉(zhuǎn)移到血液和遠(yuǎn)處器官［5］。此外，還易引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征、多器官功能衰竭綜合征，甚至死亡［6-7］。由于腸道IR的高發(fā)病率和死亡率，在臨床上將其歸屬于急危重癥。然而，缺乏有效的預(yù)防和治療措施，仍需研發(fā)新型防治藥物。

腸道中的菌群是一個(gè)高度復(fù)雜的生物生態(tài)系統(tǒng)［8-9］，關(guān)于腸道菌群在IR中的變化和潛在作用的研究越來(lái)越多［10］。有研究認(rèn)為腸道屏障功能失效，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，使病原菌及其代謝產(chǎn)物從腸腔移位至血液循環(huán)系統(tǒng)，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)［11］。益生菌對(duì)宿主具有一定的益生作用，通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的作用［12］。羅伊氏黏液乳桿菌（Limosilactobacillus reuteri，LR）作為一種潛在的益生菌，是幾乎存在于所有脊椎動(dòng)物與哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)的乳酸菌。羅伊氏黏液乳桿菌在腸道有著很強(qiáng)的黏附能力，可以改善腸道菌群分布，拮抗有害菌定植，并能產(chǎn)生“羅伊氏菌素”的非蛋白類廣譜抗菌物質(zhì)，能廣泛抑制細(xì)菌真菌、寄生蟲的生長(zhǎng)［13］。同時(shí)，其在防治不同類型的胃腸道感染（如幽門螺旋桿菌感染）以及腸道疾?。ㄈ鐫冃越Y(jié)腸炎和克羅恩病）方面已得到評(píng)估與驗(yàn)證［14-15］。綜上，羅伊氏黏液乳桿菌可以恢復(fù)腸道菌群平衡，產(chǎn)生抗菌代謝物，調(diào)節(jié)腸道免疫并介導(dǎo)黏膜穩(wěn)態(tài)，從而對(duì)消化系統(tǒng)疾病表現(xiàn)出保護(hù)作用。

IR損傷的機(jī)制復(fù)雜，活性氧（reactive oxygen species，ROS）依賴性NLRP3炎性小體通路被認(rèn)為是可能的機(jī)制之一［16］。有研究認(rèn)為ROS刺激組織發(fā)生炎癥并誘導(dǎo)NLRP3炎性小體激活［17］。NLRP3蛋白被激活后，其配體蛋白ASC會(huì)招募Caspase 1前體，形成NLRP3炎性小體，從而導(dǎo)致Caspase 1前體裂解為有活性的Caspase 1。活化的Caspase 1裂解IL-1β和IL-18前體，形成有活性的IL-1β、IL-18和其他相關(guān)炎性因子。同時(shí)，活化的Caspase 1可以在Gasdermin-d（GSDMD）蛋白的特定位點(diǎn)進(jìn)行切割，形成N端和C端截短片段，導(dǎo)致細(xì)胞釋放IL-1β和IL-18，并招募更多炎性細(xì)胞［18］?；诖?，本試驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)、外構(gòu)建IR損傷模型，圍繞ROS依賴性NLRP3炎性小體通路，探究LR緩解IR損傷的調(diào)控機(jī)制，為全面解析LR改善IR損傷機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

羅伊氏黏液乳桿菌菌株：本試驗(yàn)所用羅伊氏黏液乳桿菌GL001（L. reuteri GL00 LR）從健康豬糞便中分離，且已提純并鑒定［19］。

Caco-2細(xì)胞：購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)，編號(hào)：KCB200710YJ。

30日齡雄性SD大鼠，共30只，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。室內(nèi)飼養(yǎng)溫度為22～26 ℃，保持正常大鼠活動(dòng)的晝夜節(jié)律，保證大鼠正常的進(jìn)食與飲水，在此環(huán)境中飼養(yǎng)1周以備試驗(yàn)。

1.2 主要試劑

DMEM/高糖培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；10%胎牛血清（BI，以色列）；胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher，美國(guó)）；MRS肉湯培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白分析試劑盒（Sigma，美國(guó)）；5%牛血清白蛋白（BSA）、SDS-PAGE凝膠超快速配制試劑盒和活性氧檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素1β（IL-1β）ELISA試劑盒、大白細(xì)胞介素6（IL-6）ELISA試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素10（IL-10）ELISA試劑盒、大鼠超氧化物歧化酶（SOD）ELISA試劑盒、大鼠還原性谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）ELISA試劑盒、大鼠丙二醛（MDA）ELISA試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司）；GSDMD-N抗體（Abcam，英國(guó)）；NLRP3、ASC、Caspase1 p10、GAPDH抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

1.3 主要儀器

自動(dòng)凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；尼康A(chǔ)1熒光倒置顯微鏡（Nikon公司，日本）；電泳儀（BIO-RAD公司，美國(guó)）；恒溫培養(yǎng)箱和微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀（Thermo，美國(guó)）；Epoch多功能酶標(biāo)儀（BioTek，美國(guó)）。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)

取-80℃凍存的LR，劃線接種于MRS平板，培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落于MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)。次日，按1∶100的比例接種于10 mL離心管中，厭氧靜置培養(yǎng)（37℃）至OD600 nm=0.6，備用。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

用含有10% 胎牛血清，1% 青霉素-鏈霉素的DMEM/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞，將其置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃，5% CO2，95%相對(duì)濕度）。在80%融合時(shí)，用胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞傳代。

將傳代培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，用無(wú)抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至單層細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%時(shí)進(jìn)行細(xì)菌處理。將計(jì)數(shù)完成的LR細(xì)菌培養(yǎng)液，按照MOI=1進(jìn)行預(yù)處理，攻菌3 h后，將未黏附的LR洗掉。隨后，進(jìn)行IR細(xì)胞模型的建立：首先在無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基中低氧（1%O2，94%N2，5%CO2）條件下37℃培養(yǎng)2 h，然后更換為含糖正常氧供應(yīng)（95%空氣，5%CO2）培養(yǎng)基培養(yǎng)［19］。試驗(yàn)分為對(duì)照組（Control，CONT組），缺血再灌注細(xì)胞模型組（Ischemia reperfusion，IR組），羅伊氏黏液乳桿菌預(yù)處理組（IR+LR組），羅伊氏黏液乳桿菌組（LR組）。

H2O2是一種常見(jiàn)的氧化劑，能夠促進(jìn)ROS的產(chǎn)生。將傳代培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的H2O2，孵育0.5 h后，用PBS緩沖液輕柔清洗細(xì)胞3次，每次2 min。在此處理之前需要進(jìn)行LR預(yù)孵育（將計(jì)數(shù)完成的LR細(xì)菌培養(yǎng)液，按照MOI=1來(lái)進(jìn)行預(yù)處理，攻菌3 h后，將未黏附的LR洗掉）。試驗(yàn)分為4組：對(duì)照組（CONT group），單獨(dú)孵育H2O2組（H2O2 group），H2O2+LR組（H2O2+LR group）；單獨(dú)LR組（LR group）。

1.6 IR大鼠模型的建立及分組

30只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（S組）、缺血再灌注損傷組（IR組）、羅伊氏黏液乳桿菌灌胃處理組（LR組），每組10只。LR組在IR處理前14 d每天灌胃1011 cfu·kg-1濃度的羅伊氏黏液乳桿菌無(wú)菌懸液，S組和IR組大鼠在IR處理前每天灌胃生理鹽水，給予標(biāo)準(zhǔn)量食物與飲水。大鼠采用異氟烷吸入麻醉方式進(jìn)行麻醉，使大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，腹部消毒剃毛。S組在腹部做正中切口3 cm，辨清腸系膜上動(dòng)脈（SMA），分離SMA但不進(jìn)行動(dòng)脈夾閉，分離后閉合腹部切口；IR組與LR組分離出SMA后使用微動(dòng)脈夾夾閉1 h，取出動(dòng)脈夾，再灌注2 h［20］。試驗(yàn)第14天，采集各組大鼠血液樣本，1 000 g離心20 min，收集上清液進(jìn)行血清ELISA試驗(yàn)。

1.7 Western blot檢測(cè)目的蛋白

用含有PMSF的RIPA緩沖液來(lái)裂解腸道組織和Caco-2細(xì)胞來(lái)提取總蛋白。應(yīng)用BCA試劑盒來(lái)測(cè)定蛋白濃度。等量的每組蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳處理后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。再用5% BSA封閉PVDF膜后，進(jìn)行抗體孵育。不同的PVDF膜孵育不同的抗體：NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）、Caspase p10（1∶1 000）、GSDMD-N（1∶2 000）、GAPDH（1∶5 000）。然后，孵育相應(yīng)的二抗。滴加ECL緩沖液后，進(jìn)行呈像。最后，使用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析（n=3）。

1.8 ROS熒光染色試驗(yàn)

將各組Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板中，用PBS緩沖液清洗。滴加適量的DCFH-DA工作液（用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，10 μmol·L-1），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育（37 ℃，20 min）。再用PBS緩沖液清洗細(xì)胞3次后，置于共聚焦顯微鏡下觀察，拍照并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（n=8）。

1.9 ELISA檢測(cè)

嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。取Caco-2細(xì)胞（n=5）和大鼠血清（n=10）來(lái)檢測(cè)炎性相關(guān)指標(biāo)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10；氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)ROS、SOD、GSH-Px、MDA。

1.10 病理組織學(xué)評(píng)價(jià)

取各組大鼠（n=10）空腸和十二指腸腸段進(jìn)行固定（4%多聚甲醛，48 h）。對(duì)固定好的組織進(jìn)行如下操作：修塊（0.5～1.0 cm左右的組織小塊）、脫水（50%、70%、85%、95%和100%梯度酒精脫水）、透明（1∶1比例的二甲苯與無(wú)水酒精溶液和二甲苯）、浸蠟（3種不同熔點(diǎn)的石蠟中浸泡，54～56 ℃、56～58 ℃和58～60 ℃）、包埋（60 ℃石蠟）、切片（3 μm厚）、展片與烤片（37 ℃蒸餾水進(jìn)行展片，60 ℃的烤片機(jī)上烘干2 h）、脫蠟（二甲苯Ⅰ；二甲苯Ⅱ；酒精；1∶1比例的二甲苯與無(wú)水酒精溶液；100%酒精Ⅰ；100%酒精Ⅱ；95%酒精Ⅰ；95%酒精Ⅱ；85%酒精）、染色（蘇木素-伊紅Hamp;E染色）、封片。操作完成后，進(jìn)行鏡檢并基于Chui氏分級(jí)評(píng)估腸組織病理學(xué)情況［21］，病理評(píng)分由兩名不知情的病理學(xué)學(xué)者雙盲完成。具體評(píng)估等級(jí)：0級(jí)（正常腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)；無(wú)炎癥反應(yīng)；無(wú)充血/出血）、I級(jí)（腸黏膜絨毛頂端上皮下間隙增寬；炎癥細(xì)胞在固有層局部增多；固有層毛細(xì)血管充血）、II級(jí)（絨毛上皮下間隙進(jìn)一步擴(kuò)大，絨毛尖端上皮抬高與固有層剝離；炎癥細(xì)胞在固有層彌散增多；固有層局部出血）、Ⅲ級(jí)（絨毛兩側(cè)上皮成塊脫落；炎癥細(xì)胞在皮下聚集；固有層彌漫出血）、IV級(jí)（上皮完全脫落僅存固有膜結(jié)構(gòu)；炎癥細(xì)胞在內(nèi)皮下彌散；內(nèi)皮下出血）、V級(jí)（上皮完全脫落僅存固有膜結(jié)構(gòu)；炎癥細(xì)胞在內(nèi)皮下彌散；內(nèi)皮下出血）。

2 結(jié) 果

2.1 LR干預(yù)能夠抑制Caco-2細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生和改善氧化應(yīng)激反應(yīng)

如圖1所示，與CONT組比較，IR組綠色熒光顯著增多（圖1A），ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度極顯著增加（Plt;0.01）（圖1B）。與IR組比較，IR+LR組綠色熒光顯著減少（圖1A），ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著降低（Plt;0.05）（圖1B）。同時(shí)，檢測(cè)其他氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)與IR組比較，IR+LR組GSH-Px和MDA水平顯著降低（Plt;0.05）；SOD水平顯著增加（Plt;0.05）（圖1C～E）。說(shuō)明LR通過(guò)抑制Caco-2細(xì)胞中GSH-Px、MDA和ROS水平，增加SOD活性，改善氧化應(yīng)激反應(yīng)。

2.2 LR減弱IR對(duì)Caco-2細(xì)胞NLRP3炎性小體的激活

如圖2所示，與CONT組比較，IR組Caco-2細(xì)胞中NLRP3和Caspase1 p10蛋白表達(dá)顯著增加（Plt;0.05），ASC和GSDMD-N蛋白表達(dá)極顯著增加（Plt;0.01）。與IR組比較，IR+LR組Caco-2細(xì)胞中NLRP3、ASC、Caspase1 p10和GSDMD-N蛋白表達(dá)極顯著降低（Plt;0.01）。說(shuō)明LR干預(yù)后能夠減弱IR對(duì)Caco-2細(xì)胞NLRP3炎性小體的激活。

2.3 LR減弱H2O2對(duì)NLRP3炎性小體的激活

為了驗(yàn)證LR減弱NLRP3炎性小體的激活是否依賴于ROS，構(gòu)建了氧化應(yīng)激模型。如圖3所示，與CONT組比較，H2O2組Caco-2細(xì)胞中NLRP3、ASC和Caspase1 p10蛋白表達(dá)顯著增加（Plt;0.05），GSDMD-N蛋白表達(dá)極顯著增加（Plt;0.01）。與H2O2組比較，H2O2+LR組Caco-2細(xì)胞中ASC蛋白表達(dá)顯著降低（Plt;0.05），NLRP3、Caspase1 p10和GSDMD-N蛋白表達(dá)極顯著降低（Plt;0.01）。結(jié)果表明IR干預(yù)后能夠減弱H2O2對(duì)NLRP3炎性小體的激活。這說(shuō)明，LR減弱NLRP3炎性小體的激活，是通過(guò)減少ROS的表達(dá)來(lái)發(fā)揮的。

2.4 LR能夠改善IR大鼠腸道顯微結(jié)構(gòu)的病理?yè)p傷

如圖4A為各組大鼠十二指腸和空腸的HE染色代表圖像，圖4B為Chui氏評(píng)分。結(jié)果表明，S組十二指腸、空腸黏膜上皮細(xì)胞屏障完整，固有層正常，腸絨毛完整，隱窩清晰，顯示出正常腸道組織結(jié)構(gòu)；IR組損傷最嚴(yán)重，可見(jiàn)明顯的小腸黏膜上皮細(xì)胞部分脫落，腸絨毛變短脫落出現(xiàn)損傷，隱窩上皮細(xì)胞排列紊亂，炎性細(xì)胞大量聚集；IR+LR組腸道損傷較IR損傷明顯減輕，腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，僅見(jiàn)絨毛間隙增寬或部分脫落，炎性細(xì)胞在固有層彌散程度減輕，固有層僅局部有輕微出血點(diǎn)。此外，Chui氏評(píng)分結(jié)果顯示IR組較S組評(píng)分極顯著增加（Plt;0.01），IR+LR組較IR組評(píng)分極顯著降低（Plt;0.01）。

2.5 LR能夠抑制IR大鼠血清中炎性標(biāo)志物表達(dá)

如圖5所示，與S組比較，IR組的大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平極顯著增加（Plt;0.01）。與IR組比較，IR+LR組的大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平極顯著降低（Plt;0.01）。說(shuō)明LR干預(yù)能夠抑制IR大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6炎性標(biāo)志物表達(dá)。

2.6 LR能夠改善IR大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)

如圖6所示，與S組比較，IR組的大鼠血清中GSH-Px、MDA和ROS水平極顯著增加（Plt;0.01）；SOD水平顯著降低（Plt;0.05）。與IR組比較，IR+LR組的大鼠血清中GSH-Px、MDA和ROS水平極顯著降低（Plt;0.01）；SOD水平極顯著增加（Plt;0.01）。說(shuō)明LR通過(guò)抑制IR大鼠血清中GSH-Px、MDA和ROS水平，增加SOD活性，改" 善大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)。

2.7 LR減弱IR對(duì)大鼠腸道NLRP3炎性小體的激活

如圖7所示，與S組比較，IR組腸道組織中NLRP3、ASC和GSDMD-N蛋白表達(dá)極顯著增加（Plt;0.01），Caspase1 p10蛋白表達(dá)顯著增加（Plt;0.05）。與IR組比較，IR+LR組腸道組織中ASC、Caspase1 p10和GSDMD-N蛋白表達(dá)極顯著降低（Plt;0.01），NLRP3蛋白表達(dá)顯著降低（Plt;0.05），說(shuō)明IR干預(yù)后能夠減弱IR對(duì)大鼠腸道NLRP3炎性小體的激活，與體外結(jié)果一致。

3 討 論

腸IR損傷是獸醫(yī)臨床上常見(jiàn)疾病，嚴(yán)重威脅動(dòng)物生命安全，但有效的防治措施仍然有限。故而，需要開(kāi)發(fā)新型防治藥物。LR作為一種對(duì)宿主有益生作用的益生菌，吸引了學(xué)者的注意。LR在較多消化系統(tǒng)疾病中具有保護(hù)作用［22］，如定植的LR菌株可以預(yù)防小鼠結(jié)腸炎的發(fā)展［23］。同時(shí)，有研究表明，LR還可以調(diào)節(jié)結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群和代謝紊亂。如Wang等［24］從健康斷奶仔豬中分離LR I5007菌株，具有抑制結(jié)腸炎癥、改善結(jié)腸腸道菌群組成以及調(diào)節(jié)代謝途徑方面的作用。Xie等［25］開(kāi)發(fā)了一種新型LR-LFCA（編碼牛乳鐵素-乳鐵蛋白的LR CO21），可以通過(guò)改善腸道屏障功能和腸道菌群組成增強(qiáng)新生仔豬腸道免疫反應(yīng)，來(lái)緩解產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染引起的炎癥反應(yīng)。還有研究報(bào)道，LR DSM 17938通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)以及T細(xì)胞的誘導(dǎo)和遷移，并降低壞死性腸炎的發(fā)病率和嚴(yán)重程度［26］。以上這些研究都足以說(shuō)明LR在腸道疾病方面的預(yù)防和保護(hù)作用。本研究通過(guò)體內(nèi)、外研究發(fā)現(xiàn)LR能夠減輕腸IR損傷，其作用與抑制NLRP3炎性小體激活進(jìn)而減少炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激的發(fā)生有關(guān)。

腸IR在早期階段會(huì)產(chǎn)生大量ROS，能夠通過(guò)誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化、破壞細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑和激活促炎因子來(lái)造成細(xì)胞損傷［27］。同時(shí)，ROS會(huì)促進(jìn)腸道組織發(fā)生炎癥以及NLRP3炎性小體的激活，反過(guò)來(lái)NLRP3炎性小體還可以直接或間接誘導(dǎo)線粒體ROS產(chǎn)生，造成惡性循環(huán)［28］。本研究結(jié)果顯示，LR能夠抑制Caco-2細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，并且在大鼠IR模型中LR干預(yù)能抑制IR血清中GSH-Px、MDA和ROS水平，增加SOD活性，減輕大鼠氧化損傷。這說(shuō)明LR通過(guò)調(diào)節(jié)ROS和抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)氧化程度，緩解IR造成的氧化損傷。IR導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)也會(huì)促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生，引發(fā)細(xì)胞凋亡基因的改變，啟動(dòng)細(xì)胞自噬和凋亡等。有研究發(fā)現(xiàn)，給斷奶仔豬灌喂LR后，可以顯著下調(diào)回腸促炎因子IL-1β mRNA表達(dá)量，下調(diào)促炎因子IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)量，減少仔豬的斷奶應(yīng)激反應(yīng)［29］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，IR組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6等水平均升高，這說(shuō)明觸發(fā)了細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而LR干預(yù)后相關(guān)炎性標(biāo)志物水平均下調(diào)，證明LR可以被腸道受體識(shí)別，刺激腸道黏膜應(yīng)答，抑制腸道促炎因子的表達(dá)，減輕IR導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。其中，抗炎因子IL-10表達(dá)在IR期間也上升，猜測(cè)是由于本模型造成的缺血后再灌注時(shí)間較短，可能機(jī)體正處于一個(gè)強(qiáng)烈的防御反應(yīng)，對(duì)抗階段。

ROS是激活NLRP3炎性小體的重要第二信使，NLRP3炎性小體參與腸IR損傷［30］。NLRP3、ASC、Caspase-1或IL-1β的下調(diào)可增加腸道IR損傷后的細(xì)胞存活率，改善炎癥、ROS產(chǎn)生和血管通透性增加等病理特征。GSDMD的N端有一個(gè)細(xì)胞死亡結(jié)構(gòu)域，在Caspase-1的催化下釋放，與細(xì)胞膜結(jié)合形成10～14 nm的孔，促使IL-18和IL-1β分泌到細(xì)胞外，加速炎性反應(yīng)［31］。有研究表明，在腸IR期間，NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白表達(dá)水平顯著上升［32］。鑒于ROS和NLRP3炎性小體之間的緊密聯(lián)系。為了驗(yàn)證ROS是否在腸IR和LR保護(hù)作用中的發(fā)揮重要作用，本研究應(yīng)用H2O2構(gòu)建Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。結(jié)果顯示，LR可以減少H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞中NLRP3、ASC、Caspase1 p10和GSDMD-N蛋白表達(dá)的增加。說(shuō)明LR能夠通過(guò)抑制ROS來(lái)緩解NLRP3炎性小體的激活。其中，有部分LR組的蛋白相對(duì)于IR+LR組來(lái)說(shuō)，表達(dá)量升高，但是相對(duì)于對(duì)照組來(lái)說(shuō)，沒(méi)有明顯變化。而NLRP3炎性小體是否被激活應(yīng)該與對(duì)照組進(jìn)行比較?？傮w來(lái)說(shuō)，LR沒(méi)有引起NLRP3炎性小體的激活。這些結(jié)果都說(shuō)明，LR應(yīng)用的一定安全性，然而，還需要進(jìn)一步的體內(nèi)、外研究闡明LR治療腸IR的有效性。重要的是，在研究其臨床應(yīng)用的可能性之前，需要廣泛的藥理和毒性研究。盡管如此，本研究結(jié)果仍可以為L(zhǎng)R對(duì)腸IR的保護(hù)機(jī)制提供新的見(jiàn)解。

4 結(jié) 論

LR可緩解大鼠腸IR和氧化應(yīng)激，其作用機(jī)制與抑制ROS依賴性NLRP3炎性小體的激活有關(guān)，為L(zhǎng)R在腸道相關(guān)疾病的臨床治療提供試驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ HOU M， CHEN F， HE Y， et al. Dexmedetomidine against intestinal ischemia/reperfusion injury：a systematic review and meta-analysis of preclinical studies［J］. Eur J Pharmacol， 2023， 959：176090.

［2］ ZHOU P， ZHANG S， WANG M H， et al. The induction mechanism of ferroptosis， necroptosis， and pyroptosis in inflammatory bowel disease， colorectal cancer， and intestinal injury［J］. Biomolecules， 2023， 13（5）：820.

［3］ ACOSTA S. Epidemiology of mesenteric vascular disease：clinical implications［J］. Semin Vasc Surg， 2010， 23（1）：4-8.

［4］ WEN J， XU B， SUN Y C， et al. Paeoniflorin protects against intestinal ischemia/reperfusion by activating LKB1/AMPK and promoting autophagy［J］. Pharmacol Res， 2019， 146：104308.

［5］ SENDA A， KOJIMA M， WATANABE A， et al. Profiles of lipid， protein and microRNA expression in exosomes derived from intestinal epithelial cells after ischemia-reperfusion injury in a cellular hypoxia model［J］. PLoS One， 2023， 18（3）：e0283702.

［6］ GUTI RREZ-S NCHEZ G， GARC A-ALONSO I， DE SANTA MAR A J G， et al. Antioxidant-based therapy reduces early-stage intestinal ischemia-reperfusion injury in rats［J］. Antioxidants （Basel）， 202 "10（6）：853.

［7］ CHEN J Y， WANG Y， SHI Y X， et al. Association of gut microbiota with intestinal ischemia/reperfusion injury［J］. Front Cell Infect Microbiol， 2022， 12：962782.

［8］ B CKHED F， LEY R E， SONNENBURG J L， et al. Host-bacterial mutualism in the human intestine［J］. Science， 2005， 307（5717）：1915-1920.

［9］ 周 敏， 汪凱歌， 張 濂， 等. 微生物-腸-肌軸調(diào)節(jié)骨骼肌代謝和功能的研究進(jìn)展［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2022， 53（9）：2845-2857.

ZHOU M， WANG K G， ZHANG L， et al. Advances in microbiota-gut-muscle axis regulating skeletal muscle metabolism and function［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2022， 53（9）：2845-2857. （in Chinese）

［10］ WANG F， LI Q R， WANG C Y， et al. Dynamic alteration of the colonic microbiota in intestinal ischemia-reperfusion injury［J］. PLoS One， 2012， 7（7）：e42027.

［11］ WANG X， LIU H L， LI Y F， et al. Altered gut bacterial and metabolic signatures and their interaction in gestational diabetes mellitus［J］. Gut Microbes， 2020， 12（1）：1840765.

［12］ SAVIGAMIN C， SAMUTHPONGTORN C， MAHAKIT N， et al. Probiotic as a potential gut microbiome modifier for stroke treatment：a systematic scoping review of in vitro and in vivo studies［J］. Nutrients， 2022， 14（17）：3661.

［13］ M RQUEZ C M， "LVAREZ P F， DELGADO T V， et al. Randomized， double-blind， placebo-controlled clinical trial on the usefulness of probiotic Lactobacillus reuteri in bismuth-containing quadruple eradication therapy for infection with helicobacter pylori［J］. Rev Esp Enferm Dig， 2022， 114（2）：89-95.

［14］ CHEN F Y， LEE M T， HUANG H W. Sigmoidal concentration dependence of antimicrobial peptide activities：a case study on alamethicin［J］. Biophys J， 2002， 82（2）：908-914.

［15］ PENG Y J， MA Y Z， LUO Z C， et al. Lactobacillus reuteri in digestive system diseases：focus on clinical trials and mechanisms［J］. Front Cell Infect Microbiol， 2023， 13：1254198.

［16］ LYU H P， NI H Z， HUANG J Y， et al. VX-765 prevents intestinal ischemia-reperfusion injury by inhibiting NLRP3 inflammasome［J］. Tissue Cell， 2022， 75：101718.

［17］ ROSA C P， BELO T C A， DE MELO SANTOS N C， et al. Reactive oxygen species trigger inflammasome activation after intracellular microbial interaction［J］. Life Sci， 2023， 331：122076.

［18］ XUE J C， YUAN S， HOU X T， et al. Natural products modulate NLRP3 in ulcerative colitis［J］. Front Pharmacol， 2023， 14：1265825.

［19］ 李 婷， 湯繼浪， 盛宣博， 等. 豬源羅伊氏乳桿菌GL001的分離與益生特性研究［J］. 畜牧與獸醫(yī)， 2022， 54（7）：47-53.

LI T， TANG J L， SHENG X B， et al. Isolation and characterization of Lactobacillus reuteri from pigs［J］. Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine， 2022， 54（7）：47-53. （in Chinese）

［20］ LI Y， FENG D C， WANG Z Y， et al. Ischemia-induced ACSL4 activation contributes to ferroptosis-mediated tissue injury in intestinal ischemia/reperfusion［J］. Cell Death Differ， 2019， 26（11）：2284-2299.

［21］ CHIU C J， MCARDLE A H， BROWN R， et al. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological， hemodynamic， and metabolic reappraisal［J］. Arch Surg， 1970， 101（4）：478-483.

［22］ YU Z H， CHEN J H， LIU Y X， et al. The role of potential probiotic strains Lactobacillus reuteri in various intestinal diseases：new roles for an old player［J］. Front Microbiol， 2023， 14：1095555.

［23］ GUARNER F， CASELLAS F， BORRUEL N， et al. Role of microecology in chronic inflammatory bowel diseases［J］. Eur J Clin Nutr， 2002， 56 Suppl 4：S34-S38.

［24］ WANG G， HUANG S， CAI S， et al. Lactobacillus reuteri ameliorates intestinal inflammation and modulates gut microbiota and metabolic disorders in dextran sulfate sodium-induced colitis in mice［J］. Nutrients， 2020， 12（8）：2298.

［25］ XIE W C， SONG L Y， WANG X Y， et al. A bovine lactoferricin-lactoferrampin-encoding Lactobacillus reuteri CO21 regulates the intestinal mucosal immunity and enhances the protection of piglets against enterotoxigenic Escherichia coli K88 challenge［J］. Gut Microbes， 202 "13（1）：1956281.

［26］ LIU Y Y， FATHEREE N Y， DINGLE B M， et al. Lactobacillus reuteri DSM 17938 changes the frequency of Foxp3+ regulatory T cells in the intestine and mesenteric lymph node in experimental necrotizing enterocolitis［J］. PLoS One， 2013， 8（2）：e56547.

［27］ PAGLIARO P， PENNA C. Inhibitors of NLRP3 inflammasome in ischemic heart disease：focus on functional and redox aspects［J］. Antioxidants （Basel）， 2023， 12（7）：1396.

［28］ MINUTOLI L， PUZZOLO D， RINALDI M， et al. ROS-mediated NLRP3 inflammasome activation in brain， heart， kidney， and testis ischemia/reperfusion injury［J］. Oxid Med Cell Longev， 2016， 2016：2183026.

［29］ 華 鋒， 劉金輝. TNF-α在抗感染中的作用［J］. 南昌大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版， 2012， 52（5）：96-99.

HUA F， LIU J H. Role of TNF-α in anti-infection［J］. Journal of Nanchang University：Medical Science， 2012， 52（5）：96-99. （in Chinese）

［30］ GHAFOURI-FARD S， SHOOREI H， POORNAJAF Y， et al. NLRP3：role in ischemia/reperfusion injuries［J］. Front Immunol， 2022， 13：926895.

［31］ DING J J， WANG K， LIU W， et al. Pore-forming activity and structural autoinhibition of the gasdermin family［J］. Nature， 2016， 535（7610）：111-116.

［32］ 曹雪芬， 冷玉芳， 韓曉霞， 等. 川芎嗪通過(guò)抑制NLRP3減輕腸缺血再灌注損傷的細(xì)胞焦亡［J］. 中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)， 2023， 28（11）：1201-1208.

CAO X F， LENG Y F， HAN X X， et al. Tetramethylpyrazine protected against intestinal ischemia-reperfusion injury induced pyroptosis by inhibiting NLRP3 inflammasome activation［J］. Chinese Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics， 2023， 28（11）：1201-1208. （in Chinese）

（編輯 白永平）