基于UPLC-Q-TOF/MS技術的成人草酸鈣尿石癥血液代謝組學研究

摘要：目的" 基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術，通過血液代謝組學尋找成人草酸鈣尿石癥潛在的生物標志物和代謝機制，以指導草酸鈣結石的臨床診治。方法" 前瞻性收集2017年10月—2018年7月北京友誼醫(yī)院收治的36例雙側上尿路草酸鈣結石患者的血液樣本并與36例健康體檢者的血液樣本對照。采用UPLC-Q-TOF/MS技術進行代謝指紋圖譜分析。采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）對多元數據進行分析。通過對比人類代謝組數據庫確定潛在的生物學標記物。最后對所鑒定的化合物行代謝通路分析并構建代謝網絡圖。結果" PCA和OPLS-DA結果顯示健康對照者與結石患者血液代謝物存在顯著差異。進一步鑒定出包括亞油酸、枸櫞酸、尿酸等29種與草酸鈣結石患者血液相關的代謝物，以及膽汁酸合成通路、脂肪酸生物合成通路、甘油磷脂代謝通路、鞘脂代謝通路和嘌呤代謝通路等9條血液代謝通路。結論" 基于UPLC-Q-TOF/MS平臺進行血液代謝組學分析，找到了29種成人草酸鈣尿石癥的潛在血液生物標志物，而嘌呤代謝與脂質代謝可能與草酸鈣結石的成因相關。

關鍵詞：生物學標記物；代謝組學；超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜；草酸鈣；尿石癥；血液代謝

中圖分類號：R691.4""" 文獻標志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2024.09.015

Blood metabolomics research for calcium oxalate urolithiasis in adults based on UPLC-Q-TOF/MS

WANG Xiangyu，JI Jiayuan，CUI Teng，XIAO Jing

（Department of Urology，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China）

ABSTRACT：Objective" Based on ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF/MS），the potential biomarkers and metabolic mechanisms of adult calcium oxalate urolithiasis were identified to guide the diagnosis and treatment of calcium oxalate lithiasis.Methods" Blood samples of 36 patients diagnosed with bilateral upper urinary tract calcium oxalate stones and 36 healthy controls admitted to our hospital during Oct.2017 and Jul.2018 were collected.Metabolic fingerprints were analyzed with UPLC-Q-TOF/MS.The multivariate data were analyzed with principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA）.Potential biological markers were identified by comparing human metabolome datasets.Finally，the metabolic pathways of the identified compounds were analyzed and the metabolic network map was constructed.Results" PCA and OPLS-DA showed significant differences in blood metabolites between patients and healthy controls，and identified 29 blood-related metabolites，including linoleic acid，citric acid，uric acid and so on.The most relevant blood metabolic pathways were bile acid synthesis pathway，fatty acid biosynthesis pathway，glycerophospholipid metabolism pathway，sphingolipid metabolism pathway and purine metabolism pathway.Conclusion" Blood metabolomics analysis based on the UPLC-Q-TOF/MS platform identified 29 potential blood biomarkers of adult calcium oxalate urolithiasis，and purine and lipid metabolism may be related to the genesis of calcium oxalate stones.

KEY WORDS：biomarker; metabolomicsHYPERLINK\"javascript：ViewClassDetails（131）\";" ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF/MS）; calcium oxalate; urolithiasis; blood metabolomics

收稿日期：2023-12-24""" 修回日期：2024-03-26

通信作者：

肖荊，主任醫(yī)師。E-mail：drxiao830@163.com

作者簡介：

王翔宇，博士研究生，住院醫(yī)師。研究方向：泌尿系結石。E-mail：18769513071@163.com

泌尿系結石具有較高的患病率和復發(fā)率，男性患病率約10.6%，女性約7.1% ［1］；術后2、5、10、15年的復發(fā)率分別為11%、20%、31%、39% ［2］。而其中74%的腎結石含有草酸鈣（calcium oxalate，CaOx）成分［3］。然而，目前關于結石的病理生理機制尚不清楚，因此尋找結石相關生物學標記物及相應的代謝通路至關重要。

代謝組學是一種用來檢測生物樣本所有小分子化合物的方法［4］，為尋找特定疾病引起的內源性代謝物的差異提供了有效途徑，而差異內源代謝物可能作為疾病診斷、預后和治療反應的潛在生物標志物［5］。同時，代謝組學有助于揭示特定疾病的潛在機制。本課題組已進行了有關人類CaOx結石尿液代謝組學的首項研究，并發(fā)表了相關成果，但尿液受飲食及泌尿系感染等影響較大，其代謝物波動較大，無法精準反映人體內代謝狀態(tài)，因此本課題組嘗試收集患者血液進行代謝組學分析。本研究基于超高效液相色譜聯合四極桿飛行時間質譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）的代謝組學方法對比分析成人雙側上尿路CaOx結石患者血液樣本，旨在鑒定成人CaOx上尿路結石的生物學標記物，找到相應的代謝通路，為泌尿系結石的診斷、預防提供理論依據。

1" 材料與方法

1.1" 患者篩選和樣本收集

前瞻性收集2017年10月—2018年7月北京友誼醫(yī)院泌尿外科住院治療的36例泌尿系結石患者臨床資料和生物學樣本。入組標準：①經腹部、盆部計算機斷層掃描（computed tomography，CT）確診的雙側上尿路結石患者；②年齡18～50歲；③患者行輸尿管鏡碎石或經皮腎鏡碎石取到結石標本，經紅外光譜結石成分分析證實為一水CaOx、二水CaOx或兩者的混合物。排除標準：①含有明確的尿路解剖畸形引起梗阻；②含有尿路異物等結石高危因素。在北京友誼醫(yī)院體檢中心匹配與每例結石患者年齡、性別相同的體檢者作為對照組。本研究獲得北京友誼醫(yī)院倫理委員會批準（2018-P2-231-01），所有參與者均已簽署知情同意書。

1.2" 樣本的采集及前處理

于入院第2天采集患者清晨空腹血液樣本，采用血漿抗凝劑乙二胺四乙酸二鉀抗凝，最終取得患者血液樣本36份。同法收集健康體檢者的空腹血液檢測樣本。所有結石組患者及健康對照均來自北京及其周邊地區(qū)，且樣本采集前1 d所有患者及健康對照者均清淡飲食，盡量減少環(huán)境、飲食習慣的影響。

采集的全血樣本，在4 ℃條件下以3000 r/min的速度離心10 min，隨后取上清液分裝至1.5 mL的試管內，于－80 ℃的冰箱中保存。上樣前，將樣本取出放置在25 ℃的溫度下解凍。在200 μL的血漿樣本中加入600 μL的1∶4甲醇水沉淀蛋白，震蕩混勻后，以3000 r/min的速度離心10 min，取400 μL的上清液使用氮氣吹干儀吹干后，加入150 μL的甲醇，并經過超聲震蕩和3000 r/min的速度離心處理10 min。最后，取上清液加入內襯管中。質控樣本（quality control，QC）從所有樣本中分別取出5 μL混合而成。每采集7針樣本后采集1次QC數據，以檢測儀器穩(wěn)定性。

1.3" 數據采集

數據采集應用Waters ACQUITY UPLC系統（Waters公司，Milford，MA，USA）。采用MassLynx V4.1進行參數設定和總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）的簡單判定。

色譜分離法采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters公司，美國）。流動相A是指質量分數為0.1%的甲酸，B為乙腈。UPLC的洗脫條件為：0～0.5 min，0～2% B；0.5～7.0 min，2%～20% B；7.0～9.0 min，20%～35% B；9.0～15.0 min，35%～80% B；15.0～17.0 min，80%～98%B；17.0～26.0 min，98% B；26.0～26.5 min，98%～2% B；26.5～30.0 min，2% B。流量設定為0.35 mL/min，進樣量為4 μL。采集溫度設定為35 ℃。

質譜分析采用Q-TOF/MS（Synspt G2-Si，Waters公司，美國），分析過程采取正離子模式（ESI＋模式）和負離子模式（ESI－模式）。參數設定為：毛細管電壓1 kV，脫溶氣體流量800 L/h，反溶劑溫度450 ℃，源溫度120 ℃，錐形氣流50 L/h，噴霧氣壓6 bar（1 bar=100 kPa），取樣錐電壓20 V。采集模式為全信息串聯質譜的分辨率模式。在全掃描模式下，質量范圍設置為50～1050 m/z（質荷比）。ESI＋模式選取LE（亮氨酸腦啡肽）556.277 1作為調諧和校正的參比物質，ESI－模式選取LE（亮氨酸腦啡肽）554.261 5作為調諧和校正的參比物質進行采集。

1.4" 數據處理" 上述原始數據采集后導入Progenesis QI v2.0軟件進行數據對齊、峰提取、歸一化和去卷積等。歸一化的方式為總峰面積歸一化。采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）評估代謝物在平均值中的統計學意義，P＜0.05為差異有統計學意義。將多元數據導入EZinfo 3.0軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares determinant analysis，OPLS-DA），OPLS-DA中R2Y表示所建模型對Y矩陣的解釋率，Q2表示模型的預測能力，理論上R2、Q2數值越接近1說明模型越好，越低說明模型的擬合準確性越差。利用OPLS-DA生成投影中的重要度變量（variable importance in projection，VIP），展示變量對向量形成的影響?；颊呋€資料對比及受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線構建通過SPSS 19.0軟件進行。

1.5" 生物學標志物鑒定

將根據VIP值區(qū)分的標志物數據導回Progenesis QI，并對比人類代謝組數據庫（human metabolome databaseHYPERLINK\"https：//www.baidu.com/link？url=e7RZQ4Eiuy84KZRgcwMrkE0GSuXJziJu0BDAwl9jF_qamp;wd=amp;eqid=81ad6e650002ad73000000035e645896\"＼t\"_blank\"，HMDB）分子量、質荷比等參數，根據方差分析結果和來自OPLS-DA的VIP值，篩選潛在的用于區(qū)分結石組患者和健康對照組的生物標志物。篩選條件為：VIP＞1，ANOVA Plt;0.05，有二級碎片信息且數據庫中可以鑒定，Progenesis QI軟件鑒別分數＞35。符合條件的化合物被采納鑒定為潛在的生物標記物。

采用SPSS 19.0軟件進行ROC曲線分析，通過靈敏度、特異度及曲線下面積（area under the curve，AUC）衡量這些生物學標志物的診斷效能。將鑒定的標志物通過https：//www.metaboanalyst.caHYPERLINK\"https：//www.metaboanalyst.ca\"網站導入京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and GenomesHYPERLINK\"https：//www.baidu.com/link？url=q1nsv4Cx7DYb5yOFYaa4wJPPZpHsGbm_rDdbmlbdkvOamp;wd=amp;eqid=bf55301900654e82000000035e48a5f6\"＼t\"_blank\"，KEGG）及小分子通路數據庫（Small Molecular Pathway Database，SMPDB）行代謝通路分析，找出涉及的代謝通路并繪制代謝網絡圖。

2" 結" 果

2.1" 兩組樣本來源人群的基線資料比較

結石組患者的平均年齡為（44.0±8.8）歲，其中男性22例，女性14例。結石組尿白細胞陽性患者數較對照組多，差異有統計學意義（P＜0.001），其余資料兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05，表1）。

2.2" PCA結果

通過PCA得分圖可以看出，兩組樣本之間代謝物成分存在差異，而組內樣本具有相對共同的信息特征。QC樣品在PCA得分圖中均有聚集的趨勢，說明實驗過程系統狀態(tài)良好（圖1）。通過EZ-info軟件可以看出，在ESI+模式下有5320個變量，而ESI－模式下有5109個變量。

2.3" OPLS-DA結果

ESI＋及ESI－模式血液多參數數據的OPLS-DA得分圖顯示兩組之間代謝物成分有顯著差別（圖2）。本研究中，ESI＋模式R2Y=97%、Q2=96%，ESI－模式R2Y=98%、Q2=97%，具有比較高的準確性和預測能力。

2.4" CaOx 結石患者潛在血液生物學標記物鑒定

鑒定出的血液潛在生物學標記物信息，以及ROC曲線計算的AUC、代謝物化學式和涉及的代謝通路見表2。表中化合物均按質荷比大小從低到高排序。共有29種代謝物被挑選鑒定，涉及9條代謝通路。

我們利用化合物歸一化豐度繪制了ROC曲線來研究這些生物學標志物的診斷能力，用AUC來評估診斷效能。29個標志物的AUC范圍為0.604～0.822（表2），其中11個標志物具有較高的特異度和靈敏度（AUCgt;0.7）。圖3顯示了5種AUC較高的血液代謝物的ROC曲線。

2.5" 代謝通路分析

通過MetaboAnalyst網站的通路分析進行血液代謝途徑的分析（圖4），代謝通路分析通過比對KEGG和SMPDB數據庫。相關性最大的代謝途徑是膽汁酸合成、脂肪酸生物合成、嘌呤代謝、鞘脂代謝和甘油磷脂代謝。

3" 討" 論

代謝組學在尿石癥中的應用很少［6］，近期一篇綜述總結其在泌尿系結石中的應用，指出代謝組學已經提供了幾種可能防止或促進結石形成的潛在代謝物［7］，同樣代謝組學可聯合微生物組學來探究結石成因［8］。既往有研究應用代謝組學的方法尋找小鼠CaOx腎結石潛在的生物學標記物并闡述了一些藥物治療小鼠腎結石的作用機理，如連錢草 （Glechomae Herba）［9］、復方金錢草顆粒（Fu-Fang-Jin-Qian-Chao herbal granules）［10］和血尿安（Xue Niao An）［11］等藥物。CHAO等［12］運用同樣的方法行小鼠脂質代謝組學發(fā)現脂質代謝與CaOx結石形成密切相關。這些有關動物CaOx結石的代謝組學研究，已經從尿液或血清樣本中發(fā)現了異常的代謝物譜。最近一項運用代謝組學進行動物實驗的研究表明，琥珀酸鹽作為三羧酸循環(huán)的關鍵參與物，可以減少動物模型腎臟中鈣的沉積和損傷［13］。然而，這些CaOx腎結石是通過給動物注射或喂食相應的化學藥物繼發(fā)引起的，這極有可能與人類CaOx尿石癥形成的機制不同。目前代謝組學應用于人類的文獻報道非常少，且有一定的局限性。部分研究比較淺顯，并無定性及定量結果［14］；部分研究針對極為特殊和有明確病因的結石（如三聚氰胺暴露）［15］或針對特殊人群（如兒童［16］）。同樣有研究納入了不同種類的結石，包括CaOx結石、尿酸石、碳酸磷灰石等成分，而不同成分的腎結石代謝成因可能并不相同［17］。

既往多項研究表明尿石癥是一種與代謝綜合征、慢性腎臟疾病、高血壓、糖尿病和冠狀動脈疾病相關的全身性疾病［18］。雙側上尿路結石可以排除單側潛在的解剖畸形等偏倚因素影響，其結石病因更可能與全身性疾病或代謝紊亂相關。因此，本研究選擇分析雙側上尿路結石患者的生物學樣本，以鑒定CaOx結石潛在的生物標志物，并通過代謝通路分析，盡可能探究CaOx成因及發(fā)病機制。本課題組首次應用基于UPLC-Q-TOF/MS的代謝組學方法研究成人CaOx結石尿液成分［19］。雖然尿液中的化學成分對泌尿系結石形成可能有直接的關系，但是不能確定這些代謝物與CaOx結石的因果關系。所以本團隊用類似的方法對相應的患者進行了血液代謝組學研究，本項研究也是首次將基于UPLC-Q-TOF/MS技術的血液代謝組學分析應用于成人CaOx尿石癥的研究。PCA、OPLS-DA結果顯示了健康對照者與CaOx尿石癥患者血液相比存在代謝物表達差異。我們還鑒定了29種與CaOx尿石癥相關的血液代謝物，涉及9種代謝途徑。

本研究中尿石癥患者血液中的枸櫞酸降低，而枸櫞酸鹽已被證明是含鈣結石形成的抑制因子。它可以通過多方面的機制抑制CaOx晶體的生長［20］。脂質在泌尿系結石形成中起重要作用。研究表明，尿石癥患者尿液中膽固醇、膽固醇酯和甘油三酯的水平明顯高于健康人群［21］?，F有的動物模型證據表明，高脂肪飲食可導致尿液pH值降低，易于形成尿酸晶體和含鈣晶體。此外，有證據表明，食用高脂肪食物的動物，尿液中草酸鹽和鈣的含量增加，晶體滯留在尿路上皮從而造成腎損傷［22］。本研究血液樣本中結石組患者與健康成人之間存在多種脂質代謝成分的區(qū)別，高度提示脂質代謝異常與結石形成相關。本研究發(fā)現，相比健康對照組，結石組血液中的DHA、亞油酸和α-亞麻酸、油酸、棕櫚酸及硬脂酸含量均較低，結合既往文獻報道，我們認為部分脂肪酸對CaOx結石的產生有保護作用，尤其是n-3多聚不飽和脂肪酸及其代謝產物，可能是與這些脂肪酸參與減少氧化應激及炎癥反應相關，小鼠CaOx模型脂質組學也顯示了類似的結果［6］。結石組患者血液中神經鞘磷脂、一磷酸鞘氨醇含量減低，整體鞘脂代謝產物都是降低的狀態(tài)，我們推測鞘脂代謝可能對腎CaOx結石的形成有保護作用，其機制可能也與抑制炎癥反應相關。

初級膽酸、膽酸和鵝去氧膽酸由膽固醇在肝臟內合成，與甘氨酸和牛磺酸結合后暫時儲存和集中在膽囊內，協助消化吸收脂質，并可以促進膽固醇的排泄［23］。未被吸收的膽汁酸和脂肪酸通過誘導鈣皂化作用，破壞自由鈣和草酸在腸道內的結合，增加腸道對草酸鹽的吸收，從而增加CaOx尿石癥的發(fā)生風險［24］。本研究結果顯示，相較于健康對照組，結石組患者血液中膽酸、牛黃脫氧膽酸、鵝去氧膽酸、甘氨膽酸及牛黃膽酸明顯升高，可能提示膽酸合成通路代謝物會提高結石發(fā)病率。

本研究涉及的血液中代謝物肌酐、次黃嘌呤、尿酸和XPPPPX均參與嘌呤代謝。本研究中，尿石癥患者血液中尿酸、肌酐和次黃嘌呤升高，而XPPPPX降低。根據嘌呤代謝途徑，不論是肌酐、次黃嘌呤的升高，還是XPPPPX的降低都可能導致尿酸的升高，而尿酸可以促進CaOx晶體成核［25］。

本研究仍存在一些局限性：①患者飲食習慣及外源性物質對代謝組學的結果有影響。本研究結果發(fā)現，亞油酸和α-亞麻酸及其代謝產物很可能由飲食攝取而來，但我們對患者具體的飲食情況并未做研究。②各種慢性疾病及代謝性疾病都會影響代謝物組學的結果，甚至帶來偏倚，需要對其機制進行更深入的研究，以說明結果的意義。③由于所有樣本是在碎石術前采集，繼發(fā)的泌尿系感染或結石可能會引起組織損傷，從而造成代謝物的差異，更多樣本的對比以及采集患者術后完全恢復的樣本可避免此偏倚。④結石成分分析為一水CaOx、二水CaOx或二者混合，后續(xù)還需開展進一步研究一水CaOx/二水CaOx比例闡述結石成因。與所涉及的具體代謝物和代謝通路對CaOx結石成因影響的機制還需要進一步深入研究。

綜上所述，本研究利用UPLC-Q-TOF/MS的代謝組學方法對比分析成人雙側上尿路CaOx結石患者血液樣本，發(fā)現CaOx結石患者血液代謝物成分與健康對照者存在顯著差異，鑒定了29種與CaOx尿石癥相關的血液標志物，嘌呤代謝與脂質代謝可能與CaOx結石成因相關。

參考文獻：

［1］ SCALES CD JR，SMITH AC，HANLEY JM，et al.Prevalence of kidney stones in the United States［J］.Eur Urol，2012，62（1）：160-165.

［2］ RULE AD，LIESKE JC，LI X，et al.The ROKS nomogram for predicting a second symptomatic stone episode［J］.J Am Soc Nephrol，2014，25（12）：2878-2886.

［3］ LIESKE JC，PENA LS，SLEZAK JM，et al.Renal stone epidemiology in Rochester，Minnesota：an update［J］.Kidney Int，2006，69（4）：760-764.

［4］ ALBERICE JV，AMARAL AF，ARMITAGE EG，et al.Searching for urine biomarkers of bladder cancer recurrence using a liquid chromatography-mass spectrometry and capillary electrophoresis-mass spectrometry metabolomics approach［J］.J Chromatogr A，2013，1318：163-170.

［5］ VAN QN，VEENSTRA TD，ISSAQ HJ.Metabolic profiling for the detection of bladder cancer［J］.Curr Urol Rep，2011，12（1）：34-40.

［6］ 王翔宇，王苗苗，肖荊，等.泌尿系結石代謝組學研究進展［J］.現代泌尿外科雜志，2019，24（3）：242-245.

［7］ KOWALCZYK NS，PROCHASKA ML，WORCESTER EM.Metabolomic profiles and pathogenesis of nephrolithiasis［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens，2023，32（5）：490-495.

［8］ GAO H，LIN J，XIONG F，et al.Urinary microbial and metabolomic profiles in kidney stone disease［J］.Front Cell Infect Microbiol，2022，12：953392.

［9］ LUO Y，LAI CJ，ZHANG J，et al.Comprehensive metabolic profile of phenolic acids and flavonoids in Glechomae Herba using ultra-high-performance liquid chromatography coupled to quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry with diagnostic ion filtering strategy［J］.J Pharm Biomed Anal，2019，164：615-629.

［10］ CHEN W，LIU WR，HOU JB，et al.Metabolomic analysis reveals a protective effect of Fu-Fang-Jin-Qian-Chao herbal granules on oxalate-induced kidney injury［J］.Biosci Rep，2019，39（2）：BSR20181835.

［11］ PENG Z，CHEN W，GAO S，et al.Therapeutic effect of Xue Niao An on glyoxylate-induced calcium oxalate crystal deposition based on urinary metabonomics approach［J］.J Clin Biochem Nutr，2014，55（3）：184-190.

［12］ CHAO Y，GAO S，WANG X，et al.Untargeted lipidomics based on UPLC-QTOF-MS/MS and structural characterization reveals dramatic compositional changes in serum and renal lipids in mice with glyoxylate-induced nephrolithiasis［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2018，1095：258-266.

［13］ ZHANG XZ，LEI XX，JIANG YL，et al.Application of metabolomics in urolithiasis：the discovery and usage of succinate［J］.Signal Transduct Target Ther，2023，8（1）：41.

［14］ 高瑤，林東紅，陳敏，等.基于液相色譜/電噴霧飛行時間質譜技術的結石癥尿液代謝組學探討［J］.分析試驗室，2015，34（6）：625-629.

［15］ DUAN H，GUAN N，WU Y，et al.Identification of biomarkers for melamine-induced nephrolithiasis in young children based on ultra high performance liquid chromatography coupled to time-of-flight mass spectrometry （U-HPLC-Q-TOF/MS）［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2011，879（30）：3544-3550.

［16］ WEN J，CAO Y，LI Y，et al.Metabolomics analysis of the serum from children with urolithiasis using UPLC-MS［J］.Clin Transl Sci，2021，14（4）：1327-1337.

［17］ DUAN X，ZHANG T，OU L，et al.1H NMR-based metabolomic study of metabolic profiling for the urine of kidney stone patients［J］.Urolithiasis，2020，48（1）：27-35.

［18］ SAKHAEE K，MAALOUF NM，SINNOTT B.Clinical review.Kidney stones 2012：pathogenesis，diagnosis，and management［J］.J Clin Endocrinol Metab，2012，97（6）：1847-1860.

［19］ WANG X，WANG M，RUAN J，et al.Identification of urine biomarkers for calcium-oxalate urolithiasis in adults based on UPLC-Q-TOF/MS［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2019，1124：290-297.

［20］ BEK-JENSEN H，FORNANDER AM，NILSSON MA，et al.Is citrate an inhibitor of calcium oxalate crystal growth in high concentrations of urine？［J］.Urol Res，1996，24（2）：67-71.

［21］ KHAN SR，GLENTON PA，BACKOV R，et al.Presence of lipids in urine，crystals and stones：implications for the formation of kidney stones［J］.Kidney Int，2002，62（6）：2062-2072.

［22］ DEVARAJAN A.Cross-talk between renal lithogenesis and atherosclerosis：an unveiled link between kidney stone formation and cardiovascular diseases［J］.Clin Sci （Lond），2018，132（6）：615-626.

［23］ DOWLING RH.The enterohepatic circulation of bile acids as they relate to lipid disorders［J］.J Clin Pathol Suppl （Assoc Clin Pathol），1973，5：59-67.

［24］ CHEN CH，LIN CL，JENG LB.Association between chronic pancreatitis and urolithiasis：a population-based cohort study［J］.PLoS One，2018，13（3）：e0194019.

［25］ COE FL，STRAUSS AL，TEMBE V，et al.Uric acid saturation in calcium nephrolithiasis［J］.Kidney Int，1980，17（5）：662-668.

（編輯" 郭楚君）