齊墩果酸對衰老睪丸間質(zhì)細胞(Leydig細胞)的作用以及EGF/EGFR表達的影響

摘要：目的 觀察齊墩果酸對衰老睪丸間質(zhì)細胞（Leydig細胞）的影響以及對表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）的調(diào)控作用。方法 原代培養(yǎng)大鼠Leydig細胞，將其分為正常組、模型組和齊墩果酸組。模型組和齊墩果酸組采用H2O2（300 μmol/L）和FeSO4（100 μmol/L）每日處理2 h，持續(xù)4 d，造細胞衰老模型。之后正常組和模型組在DMEM/F12 培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，齊墩果酸組在齊墩果酸終濃度為20 μmol/L的DMEM/F12 培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d。ELISA法檢測細胞睪酮分泌情況；BrdU免疫熒光染色檢測細胞增殖率；DAPI熒光染色檢測細胞凋亡率；qRT-PCR檢測細胞EGF和EGFR mRNA表達。結(jié)果 模型組睪酮分泌水平、細胞增殖率、EGF和EGFR mRNA表達水平均低于正常組（Plt;0.05），凋亡率均高于正常組（Plt;0.05）。齊墩果酸可抑制Leydig細胞凋亡（Plt;0.05），并提高細胞睪酮分泌水平、細胞增殖水平、EGF和EGFR mRNA表達水平（Plt;0.05）。結(jié)論 齊墩果酸可促進衰老Leydig細胞睪酮分泌及細胞增殖、抑制細胞凋亡，其機制與調(diào)控EGF和EGFR mRNA表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞：Leydig細胞；齊墩果酸；衰老；表皮生長因子；表皮生長因子受體

DOI：10.3969/j.issn.1674490X.2024.04.001

中圖分類號：Q291""""" 文獻標志碼：A""""" 文章編號：1674490X（2024）04000107

The effect of oleanolic acid on senescent Leydig cells and the expression of EGF/EGFR

DUAN Yulei1， NIU Siyun1， LIANG Si2， LIU Ziming2， ZHU Juan3， WANG Hongjie1，2

（1. School of Basic Medical Sciences， Hebei University， Baoding 071000， China; 2. Department of Anesthesiology， Affiliated Hospital of Hebei University， Baoding 071000， China; 3. Department of Pharmacy， Zhengzhou First Peoples Hospital， Zhengzhou 450004， China）

Abstract： Objective To observe the effect of oleanolic acid on senescent Leydig cells and the regulation of EGF and EGFR. Methods Primary cultured rat Leydig cells were divided into normal group， model group and oleanolic acid group. The model group and the neat fruit acid group were treated with H2O2 （300 μmol/L） and FeSO4 （100 μmol/L） daily for 2 h for 4 d. Thereafter， the normal and model groups were cultured in DMEM/F12

收稿日期：20240625

基金項目：

國家自然科學基金資助項目（82374180）；河北省中醫(yī)藥管理局項目（2020234）；河北大學醫(yī)學學科培育項目（2023B10）

第一作者：段豫磊（1994—），男，河南焦作人，實驗師，碩士，主要從事男性生殖衰老研究。E-mail： 497305795@qq.com

通信作者：王紅杰（1968—），女，河北保定人，主任醫(yī)師，教授，博士，博士生導師，主要從事麻醉與復蘇的臨床及基礎(chǔ)研究。E-mail： hongjiew68@163.com

medium for 3 d， and the oleanolic acid group was cultured in DMEM/F12 medium with a final concentration of 20 μmol/L. Testosterone secretion was measured by ELISA， proliferation by immunofluorescence staining by BrdU， apoptosis by DAPI staining， and EGF and EGFR mRNA expression by qRT-PCR. Results Compared with the normal group， the testosterone secretion level， cell proliferation rate， EGF and EGFR mRNA expression level were significantly decreased （Plt;0.05）， and the apoptosis rate was significantly increased （Plt;0.05）. Oleanolic acid significantly inhibited apoptosis in the model group （Plt;0.05） and significantly increased testosterone secretion， cell proliferation levels， and EGF and EGFR mRNA expression levels （Plt;0.05）. Conclusion Oleanolic acid can promote testosterone secretion and cell proliferation and inhibit cell apoptosis， and its mechanism may be related to the regulation of EGF and EGFR mRNA expression.

Key words： Leydig cells; oleanolic acid; senescence; epidermal growth factor; epidermal growth factor receptor

隨著中國經(jīng)濟的快速發(fā)展以及生活環(huán)境的劇烈變化，人口老齡化已成為嚴重的社會問題，提高老年人口的生活質(zhì)量刻不容緩［1-2］。睪丸作為男性生殖系統(tǒng)的重要靶腺，其功能減退是機體衰老的早期信號之一，決定衰老進程［3-4］。Leydig細胞是睪丸中生產(chǎn)雄激素以及維持生精功能的重要細胞，Leydig細胞衰老導致性腺功能衰退并誘導老年疾病發(fā)生，對男性的生活質(zhì)量帶來嚴重的負面影響［5］。目前，在延緩衰老以及提高男性性腺功能方面，西醫(yī)藥尚缺乏有效應對措施，而中醫(yī)藥卻有獨到之處，但作用機制不明。女貞子可補腎強腰、明目烏發(fā)，中醫(yī)臨床用于治療陰虛內(nèi)熱、眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發(fā)早白等老年性疾病。已有報道女貞子具有延緩衰老的作用，可改善衰老大鼠腎上腺及睪丸組織退行性變［6］，但其發(fā)揮藥理作用的活性組分尚不明確。齊墩果酸是一種五環(huán)三萜類化合物，是中藥材女貞子的主要活性成分［7］，具有恢復睪丸功能的作用［8］，但其對衰老Leydig細胞的影響及可能的分子機制尚無研究。表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）廣泛參與調(diào)控細胞分化、增殖與凋亡過程［9］，維持睪丸穩(wěn)態(tài)［10］，高度表達于Leydig細胞［11］?；诖耍狙芯坎捎醚趸瘧p傷的方法建立Leydig細胞衰老模型，觀察齊墩果酸對衰老Leydig細胞功能的影響以及對EGF和EGFR的調(diào)控作用，分析其可能機制，為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 實驗動物

SPF級2月齡Wistar大鼠20只（體質(zhì)量220～260 g），雌雄各半，用于合籠繁殖新生鼠。由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：1510063。河北大學醫(yī)學部動物實驗中心培養(yǎng)，許可證號：SYXK（冀）2017-002。

1.2" 藥物及試劑

胎牛血清（以色列Biological Industries公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；膠原酶Ⅰ（美國Sigma公司）；BrdU一抗（美國Abcam公司）；即用型DAPI 溶液（中國索萊寶公司）；Caymans Testosterone ELISA Kit（美國Cayman公司）；TRIzol Reagent（美國Ambion公司）；PrimeScriptTM RT reagent Kit（日本Takara公司）；TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ（日本Takara公司）。

1.3" 方法

1.3.1 "Leydig細胞培養(yǎng)

取11～19日齡新生Wistar大鼠，頸椎脫臼處死，無菌狀態(tài)下取雙側(cè)睪丸組織，于無菌PBS溶液中剝離白膜并置于膠原酶Ⅰ中消化，游離生精小管周圍間質(zhì)中的細胞，采用差異貼壁法分離純化Leydig細胞［12］。將獲得的Leydig細胞以每皿1×107個細胞接種于培養(yǎng)皿中，在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待融合度達80%時以1∶2進行傳代，第3代的細胞以每孔1×106個細胞接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)2 d后備用。

1.3.2" 細胞分組和處理

將“1.3.1”中培養(yǎng)的Leydig細胞分為正常組、模型組和齊墩果酸組。其中模型組和齊墩果酸組采用自由基氧化損傷法造Leydig細胞衰老模型：培養(yǎng)液中加入300 μmol/L H2O2和100 μmol/L FeSO4作用2 h，之后更換新鮮的培養(yǎng)液，每日1次，持續(xù)4 d（各組細胞加入終濃度為20 μmol/mL的BrdU溶液用于免疫熒光實驗）。模型組繼續(xù)在含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d；齊墩果酸組在終濃度20 μmol/L齊墩果酸的DMEM/F12 培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d。

1.3.3" DAPI熒光染色

各組細胞去除培養(yǎng)液，PBS清洗3遍，每遍5 min。4% 多聚甲醛固定細胞10 min，PBS清洗3遍，每遍5 min。DAPI染色試劑染色，甘油與水1∶1混合液封片，置于熒光顯微鏡（日本 Nikon 公司）下觀察拍照，細胞核亮藍白色為陽性細胞，計數(shù)每個視野內(nèi)陽性細胞。各組觀察10個視野，計算平均陽性率。重復3次獨立實驗。

1.3.4" BrdU免疫熒光染色

各組細胞去除培養(yǎng)液，PBS清洗2遍。之后4%多聚甲醛固定細胞10 min，2 mol/L鹽酸變性30 min，0.1 mol/L硼酸鈉中和15 min，BrdU一抗稀釋液（1∶100）室溫孵育過夜，羊抗兔二抗稀釋液（1∶500）37 ℃避光孵育2 h，DAPI復染細胞核，甘油與水1∶1混合液封片，置于熒光顯微鏡下觀察拍照，計數(shù)每個視野內(nèi)陽性細胞。每組細胞計10個視野，重復3次獨立實驗，計算平均陽性細胞率。

1.3.5" ELISA法檢測細胞睪酮分泌

采用Caymans Testosterone ELISA Kit進行各組Leydig細胞培養(yǎng)液中睪酮含量的測定，每組重復3次獨立實驗。首先按照說明書進行排版設(shè)計：包括 2個空白孔（Blk）、2個本底孔（NSB）、2個最大結(jié)合孔（B0）和8孔標準曲線。每個培養(yǎng)液樣本3個復孔。使用ELISA Buffer稀釋各組培養(yǎng)液，每孔50 μL配置好的培養(yǎng)液，各孔添加50 μL Testosterone AChE Tracer（除Blk外），后各孔加入50 μL Testosterone ELISA Antiserum（除NSB和Blk外）。塑料薄膜覆蓋全板，室溫振蕩孵育2 h，各孔采用Wash Buffer清洗5次。每孔加入200 μL Ellman Reagent，23 ℃下避光孵育90 min。酶標儀405～420 nm波長讀板，并計算樣本濃度。

1.3.6" 熒光定量PCR（qRT-PCR）

TRIzol法提取各組細胞總RNA，按照PrimeScript RT reagent Kit說明，逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。使用TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒對各組cDNA于qRT-PCR儀中進行擴增，以β-actin為內(nèi)參基因，利用2-△△ct 方法統(tǒng)計各組EGF和EGFR基因轉(zhuǎn)錄水平。重復3次獨立實驗。各基因引物序列見表1。

1.3.7" 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。各實驗數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗，滿足正態(tài)分布后采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。若滿足方差齊性，兩兩比較選用最小顯著差法（least significant difference，LSD），若方差不齊則用 Dunnetts T3 法，Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2" 結(jié)果

2.1" Leydig細胞分泌睪酮的含量

首先使用睪酮ELISA試劑盒檢測各組細胞培養(yǎng)液的睪酮含量，結(jié)果顯示，模型組細胞培養(yǎng)液的睪酮含量低于正常組（Plt;0.05），經(jīng)齊墩果酸干預后，睪酮含量升高（Plt;0.05），但不如正常組（Plt;0.05）（圖1）。

與正常組比較，aPlt;0.05；與模型組比較，bPlt;0.05

2.2" Leydig細胞BrdU免疫熒光染色

BrdU在S期可替代胸腺嘧啶核苷選擇性結(jié)合細胞DNA，是細胞增殖的常見標記物。免疫熒光染色顯示，BrdU陽性產(chǎn)物呈紅色，定位于細胞核（圖2A）。統(tǒng)計結(jié)果表明，模型組BrdU陽性細胞率低于正常組（Plt;0.05），經(jīng)齊墩果酸干預后，陽性細胞率升高（Plt;0.05）（圖2B）。

A 各組Leydig細胞BrdU免疫熒光染色（×200）；B 各組Leydig細胞BrdU陽性率統(tǒng)計；與正常組比較，aPlt;0.05；與模型組比較，bPlt;0.05

2.3" DAPI染色檢測Leydig細胞凋亡率

對各組Leydig細胞進行DAPI染色，DAPI染色呈藍色熒光，凋亡細胞細胞核濃縮變小，染色加深，顯示出強亮藍白色熒光，如圖中紅色箭頭指示（圖3），為凋亡細胞。計算各組細胞中凋亡細胞百分率，結(jié)果顯示，模型組細胞凋亡率高于正常組（Plt;0.05），經(jīng)齊墩果酸干預后，細胞凋亡率降低（Plt;0.05）。

與正常組比較，aPlt;0.05；與模型組比較，bPlt;0.05

2.4" qRT-PCR檢測Leydig細胞EGF和EGFR基因mRNA表達

為探討齊墩果酸延緩Leydig細胞衰老的可能機制，采用qRT-PCR檢測各組Leydig細胞EGF和EGFR基因mRNA表達（圖4），結(jié)果顯示，模型組細胞中EGF和EGFR基因mRNA表達均低于正常組（Plt;0.05），經(jīng)齊墩果酸干預后，EGF和EGFR基因mRNA表達均升高（Plt;0.05）。

與正常組比較，aPlt;0.05；與模型組比較，bPlt;0.05

3" 討論

衰老是一種自然的、多因素的現(xiàn)象，其特征是退化過程的積累。衰老不僅伴有更年期癥狀，也是導致大多數(shù)慢性疾病和組織功能障礙的主要原因，機體通過性激素對其直接或間接地發(fā)揮調(diào)控作用［13］。Leydig細胞是雄激素（睪酮）產(chǎn)生的重要細胞，睪酮的產(chǎn)生隨著年齡的增長而減少［14］，不僅影響男性生殖功能，而且與心血管病、前列腺增生、代謝綜合征、骨質(zhì)疏松癥、阿爾茨海默病等老年病密切相關(guān)［15］。Leydig 細胞衰老導致增殖能力減弱，其數(shù)量因凋亡率升高而下降，且細胞的睪酮合成能力降低，從而導致血清睪酮水平隨年齡增長而下降［16］?；诖?，靶向延緩 Leydig 細胞衰老進程成為可能的治療策略。

目前，臨床治療男性性腺衰老仍以睪酮替代療法為主，但其有明顯的毒副作用，且對男性生育能力有不良影響［17］。傳統(tǒng)中藥在延緩衰老及防治相關(guān)疾病方面效果顯著?！侗静菰傩隆酚涊d，女貞子“養(yǎng)陰益腎，補氣舒肝。治腰腿疼，通經(jīng)和血”“主補中，安五臟，養(yǎng)精神，除百疾”。但因女貞子有效作用成分和藥理機制尚不明確，影響其臨床使用。齊墩果酸是女貞子的成分，已有報道其具有抗氧化、抗感染［18］、神經(jīng)保護［19］以及胃腸道保護［20］作用，并可延長秀麗隱桿線蟲壽命［21］，提示其潛在的抗衰老功效，但其對Leydig細胞的作用尚不清楚。本研究顯示，齊墩果酸可顯著提高自由基氧化損傷誘導的衰老Leydig細胞增殖、抑制細胞凋亡，并提高Leydig細胞睪酮分泌，表明齊墩果酸對衰老Leydig細胞具有積極作用。

EGFR是表皮生長因子受體家族成員之一，具有酪氨酸激酶活性，是一種重要的跨膜受體。EGF是EGFR高親和力配體，與之結(jié)合并激活EGFR，進而激活MAPK、PI3K、c-Src等多條信號通路［22］。EGF與EGFR在包括上皮和間充質(zhì)譜系在內(nèi)的許多細胞類型中得到廣泛表達，調(diào)節(jié)包括發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)、增殖、存活和分化等多種細胞生物學關(guān)鍵過程［23］。有研究表明，激活EGF信號傳導可延緩秀麗隱桿線蟲的衰老［24］，EGF和EGFR mRNA和蛋白水平下調(diào)還與細胞衰老［25］以及多種老年病的發(fā)生密切相關(guān)［26］。在本研究中，齊墩果酸可顯著上調(diào)衰老Leydig細胞中EGF和EGFR mRNA水平，初步證明齊墩果酸對Leydig細胞EGF/EGFR信號傳導的調(diào)控作用。而齊墩果酸對Leydig細胞EGF/EGFR下游通路的調(diào)控作用以及EGF/EGFR與Leydig細胞衰老的關(guān)系，將是進一步研究的工作。

綜上所述，齊墩果酸可促進衰老Leydig細胞睪酮分泌，促進其增殖并抑制凋亡，其機制可能與調(diào)控EGF和EGFR mRNA表達有關(guān)，為齊墩果酸的臨床應用提供了理論依據(jù)和科學支撐。

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（責任編輯：劉俊華）