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    香煙煙霧提取物對外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老的影響及其機(jī)制研究

    2016-12-19 07:22:00鄭浩李占魯孔旭鋼沈嘯華傅國勝
    心腦血管病防治 2016年5期
    關(guān)鍵詞:衰老

    鄭浩 李占魯 孔旭鋼 沈嘯華 傅國勝

    [摘要]目的觀察香煙煙霧提取物(CSE)對外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)衰老的影響,探討其司能機(jī)制。方法 密度梯度離心法獲取人外周血單核細(xì)胞,培養(yǎng)4d后,收集貼壁細(xì)胞,分別加入2.5%,5%,10%和15%的CSE干預(yù)。采用SA-β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測衰老細(xì)胞;MIT比色法檢測EPC的增殖能力;端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(TRAP).ELIsA定量檢測EPC端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性;逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄因子(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)mRNA水平;Western蛋白印跡檢測EPC Akt Ser磷酸化水平。結(jié)果CSE能顯著增加SA-β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞數(shù)量,15%CSE影響最為明顯,同時顯著抑制EPC增殖能力;CSE能顯著抑制端粒酶活性及hTERT mRNA表達(dá);另外,CSE能抑制EPCAkt磷酸化。結(jié)論CSE誘導(dǎo)EPC衰老,伴隨EPC增殖能力的損害,提示細(xì)胞衰老也許是CSE影響EPC功能的機(jī)制之一;CSE誘導(dǎo)EPC衰老可能與抑制EPC端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性、減少hTERT mRNA表達(dá)及抑制Akt磷酸化有關(guān)。

    [關(guān)鍵詞]香煙煙霧提取物;內(nèi)皮祖細(xì)胞;衰老;端粒末端轉(zhuǎn)移酶

    中圖分類號:R446.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1009-816X(2016)05-0348-03

    自1977年Asahara及其同事第一次提出內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell,EPC)以來,越來越多的證據(jù)顯示EPC在缺血組織的血管新生中扮演的重要作用。香煙煙霧中含有超過4000多種有毒物質(zhì)。香煙煙霧提取物(cigarette smoking extract,CSE)幾乎包含了香煙中所有的成分,如尼古丁、焦油等。研究顯示,長期吸煙可以明顯下降外周血EPC的數(shù)量及功能,后者與心血管危險因素的發(fā)生有密切關(guān)系,甚至發(fā)現(xiàn)吸煙者的EPC在培養(yǎng)早期就出現(xiàn)大量死亡。但是吸煙致EPC功能損傷的具體機(jī)制尚不明確。細(xì)胞的增殖能力受細(xì)胞分化及衰老所調(diào)控。最近的研究表明,EPC數(shù)量減少、功能減退與細(xì)胞衰老有關(guān)。細(xì)胞衰老的機(jī)制尚不十分清楚,目前認(rèn)為端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性與細(xì)胞衰老關(guān)系密切。本研究利用體外培養(yǎng)人外周血單核細(xì)胞源的EPC,觀察不同濃度的CSE對EPC增殖功能的影響,進(jìn)一步探討CSE對EPC衰老的影響及其可能機(jī)制。

    1材料與方法

    1.1主要材料與試劑:人纖維連接蛋白(human fi-bronectin,HFN)購自Chemicon公司;淋巴細(xì)胞分離液購自Cedarlane公司;EGM-2MV購自Clonetic公司;二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自華美生物工程公司,進(jìn)口分裝;細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(Senescenceβ-Galactesidase Staining Kit)購自Biovision公司;TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA試劑盒購自Roche公司;Trizol購自Invitrogen公司;抗phospho-Akt-Ser473單克隆抗體、抗Akt單克隆抗體購自Cell Signalling Technology公司。

    1.2方法:

    1.2.1 EPC分離、培養(yǎng):取健康、非吸煙成人空腹外周血20ml,密度梯度離心法獲取單核細(xì)胞(MNCs)。將MNCs接種于HFN包被的培養(yǎng)板。EGM-2 MV培養(yǎng)基(含EBM-2,5%胎牛血清及VEGF-A、hFGF-2、hEGF、IGF-1、維生素、抗生素)培養(yǎng)4d,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗掉非貼壁細(xì)胞,換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至7d,PBS洗掉非貼壁細(xì)胞,貼壁細(xì)胞供實驗用。貼壁細(xì)胞隨機(jī)分為5組:(1)對照組:含5%胎牛血清的EGM-2MV培養(yǎng)基(含EBM-2及VEGF-A、hFGF-2、hEGF、IGF-1、維生素、抗生素);(2)香煙煙霧提取劑各濃度組(共4組):加入2.5%,5%,10%及15%CSE干預(yù)。

    1.2.2香煙煙霧提取物制備:參照Carp和Janoff方法并改良,將一支去過濾嘴香煙連于一個連續(xù)抽吸驅(qū)動裝置,每支煙吸5min,一共抽吸兩支香煙。吸入的煙霧經(jīng)過真空容器的一個入口通入50ml的EBM培養(yǎng)液中制成懸液,懸液用NaOH調(diào)至pH 7.4,經(jīng)0.22um微孔濾膜(購自Millipore公司)過濾做為CSE原液。配置好的CSE于30min之內(nèi)用于實驗。CSE原液加入含EPC的培養(yǎng)液中稀釋成所需濃度。10%的CSE作用大致相當(dāng)于每天吸入30支香煙。

    1.2.3細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色:在EPC培養(yǎng)7d后,加入各濃度的CSE干預(yù)24h,再進(jìn)行SA-β-半乳糖苷酶染色。按照試劑盒提示說明書操作,鏡下觀察,計數(shù)200個細(xì)胞,確定藍(lán)色細(xì)胞百分比。

    1.2.4增殖能力檢測:在培養(yǎng)第7d消化細(xì)胞、計數(shù),采用MTF方法檢測EPC增殖能力。

    1.2.5 TRAP-PCR-ELISA法檢測端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性:在EPC培養(yǎng)7d后,加入各濃度的CSE干預(yù)24h,按照TRAP-PCR-ELISA法進(jìn)行端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性測定。

    1.3統(tǒng)計學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)采用SPSSl0.0版統(tǒng)計學(xué)軟件分析,計量資料以(x±s)表示,組間資料比較采用ANOVA檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1 CSE對EPC衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色、抑制EPC增殖能力、EPC端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性的影響:我們之前的研究顯示,剛分離獲得的單個核細(xì)胞是圓形的,體積較小,懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)7d后形成了梭形的內(nèi)皮樣細(xì)胞。用FITC-UEA.T和acLDL-Dil對細(xì)胞染色后,通過共聚焦顯微鏡鑒定,UEA.T和DiLDL雙染色陽性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPC。流式細(xì)胞儀檢測貼壁細(xì)胞表面標(biāo)志,即VEGFR2,CD34和AC133的表達(dá)以進(jìn)一步確定為分化中的EPC。結(jié)果顯示,加入CSE與EPC培養(yǎng)24h后,可以明顯增加SA-β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞數(shù)量。其作用呈明顯的劑量相關(guān)性,與對照組相比,15% CSE作用最為顯著。CSE誘導(dǎo)EPC衰老,我們進(jìn)一步觀察CSE是否能影響EPC增殖能力。MTF法檢測發(fā)現(xiàn),CSE在誘導(dǎo)EPC凋亡的同時可以顯著抑制EPC的增殖功能。CSE加入EPC培養(yǎng)24h后抑制EPC端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性,其作用呈明確的劑量相關(guān)性,見表1。

    2.2 CSE對EPC human telomerase reverse transcriptase(hTERT)mRNA表達(dá)的影響:為了觀察CSE對EPChTERTmRNA表達(dá)的影響,將不同濃度的CSE加入EPC培養(yǎng)6h,半定量RT-PCR結(jié)果顯示,CSE能顯著抑制hTERT mRNA的表達(dá),呈明顯的量效關(guān)系,在15%的濃度時最為明顯,見圖1。

    2.3 CSE對EPC Akt活性的影響:最近研究表明Akt在調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老和端粒酶活性中扮演重要角色,因此,我們觀察了CSE對EPC活性的影響。Western蛋白印跡結(jié)果顯示,加入不同濃度CSE分別培養(yǎng)15min后,磷酸化Akt的表達(dá)隨CSE濃度的增加而顯著減少,在15%時達(dá)到最大效應(yīng)。

    3討論

    本研究發(fā)現(xiàn),CSE可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)EPC的衰老,伴隨著其增殖能力的降低。大量的研究顯示,EPC衰老與EPC數(shù)量減少和功能損害有關(guān)。長期吸煙可以明顯下降外周血EPC的數(shù)量及功能,本研究為該現(xiàn)象提供了一定的分子學(xué)機(jī)制。在細(xì)胞分子水平上,染色體末端端粒的損耗是衰老的重要機(jī)制,端粒丟失最終可造成細(xì)胞衰老直至凋亡。端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶,能以自身RNA為模板合成端粒DNA并添加到染色體末端,延長真核細(xì)胞染色體端粒。因此端粒酶活性缺乏可造成端粒長度的縮短從而誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。大量研究顯示,各種心血管危險因子可以降低大鼠或人外周血EPC端粒長度及端粒酶活性,同時能增加衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞比例。我們之前研究亦發(fā)規(guī)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α延緩EPC的衰老可能與端粒酶活動增加及端粒長度延長有關(guān)。因此,我們推斷EPC衰老可能與端粒端粒酶有關(guān)。

    hTERT mRNA的表達(dá)和端粒酶的活性具有很強的關(guān)聯(lián)性。我們近期的研究亦顯示,基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α抑制EPC衰老及促進(jìn)缺血組織再內(nèi)皮化與其促進(jìn)hTERT mRNA表達(dá)有關(guān)。本研究顯示,CSE能降低EPC端粒酶活性,同時亦能抑制EPC hTERTmRNA的表達(dá),據(jù)此我們推測CSE誘導(dǎo)EPC衰老可能與其抑制EPC端粒酶活性及抑制hTERT mRNA的表達(dá)有關(guān)。細(xì)胞衰老機(jī)制除了端粒學(xué)說(即復(fù)制下衰老)之外,尚有非端粒學(xué)說,后者包括氧自由基學(xué)說及DNA損傷學(xué)說。香煙煙霧中包含了4000多種物質(zhì),其中就包括大量的自由基和氧化劑。吸煙導(dǎo)致NO合成減少、EPC功能損傷與氧化應(yīng)激有關(guān)。因此,CSE誘導(dǎo)EPC衰老的相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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