INTS11通過介導(dǎo)CDK2和CYCLIND1的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)牛成肌細(xì)胞增殖

摘 要：旨在驗證牛INTS11基因在成肌細(xì)胞中的功能作用，通過生物信息學(xué)分析探討INTS11的CDS區(qū)序列及其編碼蛋白的特征，并使用不同分子試驗技術(shù)驗證其在牛成肌細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮的作用。本研究對牛INTS11基因序列與其他物種進(jìn)行同源性對比并構(gòu)建生物進(jìn)化樹，對其編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)和功能結(jié)構(gòu)分析以及亞細(xì)胞定位。并以體外分離培養(yǎng)的3月齡健康胎牛成肌細(xì)胞為試驗材料，克隆成肌細(xì)胞中INTS11的全部CDS區(qū)序列，構(gòu)建INTS11的過表達(dá)載體并設(shè)計基因的干擾序列，通過CCK8、Edu、RT-qPCR等技術(shù)探究其對成肌細(xì)胞增殖的影響。生物信息分析結(jié)果表明，INTS11位于16號染色體上，CDS區(qū)序列全長為1800bp，具有MBL-foldmetallo-hydro和β-CASP基序兩個功能結(jié)構(gòu)域，屬于非跨膜蛋白，且細(xì)胞定位主要分布于細(xì)胞質(zhì)。在成肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-INTS11質(zhì)粒，結(jié)果顯示在72～96h時試驗組的成肌細(xì)胞比對照組的增殖速度顯著增加（Plt;0.05）；Edu試驗發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞數(shù)目顯著增加（Plt;0.05）；RT-qPCR結(jié)果表明增殖標(biāo)志因子CDK2、CYCLIND1的mRNA表達(dá)水平與對照組相比顯著上升（Plt;0.05）。轉(zhuǎn)入干擾序列后，細(xì)胞增殖速度顯著下降（Plt;0.05），同時增殖標(biāo)志因子CDK2、cyclin D1的mRNA表達(dá)水平與對照組相比顯著下降（Plt;0.05）。本研究預(yù)測了INTS11在家養(yǎng)動物中的保守性，并且INTS11蛋白具有兩個功能結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)其通過介導(dǎo)CDK2、CYCLIND1的mRNA轉(zhuǎn)錄促進(jìn)牛成肌細(xì)胞增殖，其結(jié)果完善了調(diào)控骨骼肌的基因網(wǎng)絡(luò)，為后序探討調(diào)控骨骼肌生長機(jī)制提供理論支持。

關(guān)鍵詞：INTS11；成肌細(xì)胞；細(xì)胞增殖；過表達(dá); 干擾

中圖分類號：S823.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-2927-13

收稿日期：2023-11-01

基金項目：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程（ASTIP-IASO3）；國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位科學(xué)家項目（CARS-37）

作者簡介：王子巖（1998-），女，吉林人，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：wangziyan1023@126.com

*通信作者：李俊雅，主要主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：Lijunya@caas.cn

INTS11Promotes the Proliferation of Bovine Myoblasts by Mediating the Transcription

of CDK2and CYCLIND1

WANGZiyan^1，2，WANGYahui²，WUTianyi²，GAO Chen²，DUZhenwei²，GEFei²，

ZHANGXiaobei^1，2，ZHAOWenxuan²，ZHANGLupei²，GAOHuijiang²，

DONGHuansheng¹，LIJunya^2*

（1.College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，

Qingdao266000，China; 2.Institute of Animal Sciences，

Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193，China）

Abstract：The study aimed to verify the functional role of bovine INTS11gene in myogenic cells，explore the sequence of the CDS region of INTS11and the characteristics of its encoded protein by bioinformatics analysis，and verify its role in the proliferation process of bovine myogenic cells using different molecular test techniques.The bovine INTS11gene sequence was compared with other species.This involved the construction of aphylogenetic tree and the examination of the physicochemical properties，functional structure，and subcellular localization of the encoded protein.The test material comprised3-month-old healthy fetal bovine myoblasts isolated and cultured in vitro.The sequences of the coding sequence（CDS）region of INTS11in myoblasts were cloned.An overexpression vector of INTS11was constructed，and interfering sequences of the gene were designed.This was done in order to investigate its effect on the proliferation of myoblasts by CCK8，Edu，RT-qPCR and other techniques.Bioinformatic analysis showed that INTS11had aCDS region of1800bp，two functional domains（MBL-foldmetallo-hydro and β-CASP motif），which belonged to the non-transmembrane proteins and the cellular localization was mainly distributed in the cytoplasm.Transfection of pcDNA3.1-INTS11plasmid showed that the proliferation rate of myoblasts in the test group was significantly increased compared with that in the control group at72-96h（Plt;0.05）; Edu assay revealed asignificant increase in the number of positive cells（Plt;0.05）; and the RT-qPCR results showed that the mRNA expression levels of proliferation marker factors CDK2and CYCLIND1were significantly increased（Plt;0.05）compared with that in the control group.After transferring the interference sequence，the cell proliferation rate was significantly decreased（Plt;0.05）and the number of positive cells was significantly reduced（Plt;0.05），while the mRNA expression levels of proliferation marker factors CDK2and CYCLIND1were significantly decreased（Plt;0.05）compared with the control group.In this study，the conservation of INTS11was predicted in the domesticated animals，and that INTS11protein has two functional structural domains，and it promotes the proliferation of bovine myoblasts by mediating the transcription of CDK2and CYCLIND1.This research has perfected the gene network regulating skeletal muscle growth，provided theoretical support for further exploration of the regulating mechanisms of skeletal muscle growth in the post-sequence.

Key words：INTS11; myoblast; cell proliferation; overexpression; interference

*Corresponding author：LI Junya，E-mail：Lijunya@caas.cn

骨骼肌作為哺乳動物最大的組織，約占總體的60%，對胴體重、產(chǎn)肉率^[1]等有著重要的影響。骨骼肌的生長發(fā)育主要分為兩個階段，一是在胚胎發(fā)生期間骨骼肌的纖維數(shù)量已經(jīng)確定^[2]；二在動物出生后，其肌纖維數(shù)量基本保持在恒定狀態(tài)^[3]，肌肉的生長主要依賴于肌纖維體積增加和肌節(jié)增長^[4]。骨骼肌肌纖維的生長過程包括成肌細(xì)胞的增殖、分化并融合成多核肌管^[5]、以及出生后骨骼肌肌纖維增大增粗的生物發(fā)生^[6]。研究證明，骨骼肌纖維生長是一個十分復(fù)雜且精確的基因調(diào)控過程，并不是單一基因決定的。目前認(rèn)為，以MyoD、MyoG、Myf5、MRF4、MEF2等肌特異性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控為主^[7]，lncRNA和信息傳導(dǎo)途徑以及其他調(diào)控基因^[8]構(gòu)成的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)控骨骼肌的生長發(fā)育。因此本研究以影響胚胎期成肌細(xì)胞生長發(fā)育的基因為研究重點，探討其對生物育種提高肉牛產(chǎn)肉率的重要意義。

隨著基因分型技術(shù)的發(fā)展，大量的GWAS研究在肉牛已經(jīng)大規(guī)模開展，但是由于不同模型計算效力等問題，存在大量假陽性結(jié)果，且得到驗證的基因數(shù)量較少。研究人員使用GWAS-RRM模型對808頭華西牛的GWAS分析結(jié)果顯示ARS-BFGL-NGS-BFGL-56551位點與華西牛的體重性狀顯著相關(guān)，并通過基因注釋到INTS11作為影響肉牛骨骼肌生長發(fā)育的關(guān)鍵功能候選基因^[9]。INTS11是INT的重要組成成員^[10]，目前的研究表明INT是至少由15個亞基組成的多亞基復(fù)合體^[3]，研究人員發(fā)現(xiàn)INT在轉(zhuǎn)錄調(diào)控^[11]和基因組^[11-12]維護(hù)中扮演著關(guān)鍵角色。前期關(guān)于INT家族的ChIP-seq研究表明，INT與大量蛋白質(zhì)編碼基因的啟動子相關(guān)，并在含有RNA聚合酶II的基因中顯著富集^[13]。INT復(fù)合體具有與RNA聚合酶II末端結(jié)構(gòu)域CTD相似的結(jié)構(gòu)^[14]，可以穩(wěn)定結(jié)合并相互作用募集到snRNA基因的啟動子上，其中整合子裝載在啟動子處的RNA聚合酶II上與它一起沿著基因移動，通過識別轉(zhuǎn)錄物末端的3′端結(jié)構(gòu)切割新生的初級轉(zhuǎn)錄物^[15]，進(jìn)而維持基因轉(zhuǎn)錄的連續(xù)性^[16]。INT對基因表達(dá)的調(diào)控還涉及調(diào)節(jié)RNA聚合酶II的活性、輔助mRNA剪切以及信號通路的激活。INTS11是INT復(fù)合體的關(guān)鍵亞基，與INTS9和INTS4一起形成INT的核心催化配合物“裂解模塊”^[17]，協(xié)調(diào)發(fā)揮復(fù)合體的功能作用。綜上，INTS11對基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和細(xì)胞功能具有重要調(diào)控作用，INTS11對牛骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控卻鮮有報道。

基于INTS11基因在基因轉(zhuǎn)錄過程中的關(guān)鍵作用，本研究通過對INTS11基因進(jìn)行種屬間保守性分析和結(jié)構(gòu)功能預(yù)測，并構(gòu)建INTS11過表達(dá)載體和干擾序列驗證INTS11基因的過表達(dá)和沉默效果，以期為后續(xù)研究肉牛骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗使用的試驗動物來自2～3月齡荷斯坦牛胎兒，將包裹著羊水且羊膜完整的牛胎兒從母牛子宮中取出后，于4 ℃環(huán)境中放置，并快速送回試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛INTS11蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

根據(jù)NCBI網(wǎng)站下載基因和蛋白質(zhì)的序列信息，通過ＭEGA7.0軟件對不同物種間的基因序列進(jìn)行同源性對比并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，通過在線軟件ProtParam、ProtScale、SOPMA、PHYRE2、SignalP-4.1、NetPhos3.1分別分析牛INTS11蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、信號肽和磷酸化、糖基化位點預(yù)測。

1.2.2 牛成肌細(xì)胞分離與純化

將牛子宮用75%的酒精沖洗后，放置于無菌環(huán)境中剪破羊膜，取出胎兒并用酒精噴洗。剪開胎兒背部皮膚，使用眼科剪刀、鑷子分離出背部肌肉，用含1%青鏈霉素的PBS沖洗兩遍后放入無菌平皿中，在超凈臺把組織表面的筋膜和血管剪掉，取黃豆大小的組織塊用含1%PBS沖洗兩遍，放入0.1%膠原酶Ⅳ中剪成肉糜狀態(tài)看不到組織顆粒，搖床中震蕩45min，每15min拿起來上下顛倒，通過100nm尼龍網(wǎng)篩并收集濾液，1200r·min^-1離心3min后棄上清，用配好的完全培養(yǎng)基（20%FBS+80%DMEM-H）混勻接種在培養(yǎng)皿中，2h后把培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中以篩選細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)80%匯合度時，使用凍存液（10%DMSO+20%FBS+70%DMEM-H）將細(xì)胞凍存，并保存于液氮中。

1.2.3 成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化

將成肌細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度至90%后，更換分化培養(yǎng)基（2%HI+98%DMEM-H）連續(xù)培養(yǎng)4d，每隔24h更換一次培養(yǎng)基，4d后可在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形成明顯的肌管。

1.2.4 INTS11基因CDS區(qū)克隆及載體構(gòu)建

根據(jù)NCBI中牛的INTS11基因mRNA序列（登錄號：XM-021089863.1），設(shè)計INTS11基因的上下游引物、定量引物和上下游帶有Hind III和Kpn I限制性內(nèi)切酶位點的特異性引物（表1）。以成肌細(xì)胞的cDNA為模板通過PCR擴(kuò)增法擴(kuò)增INTS11基因的CDS區(qū)序列并純化。以pcDNA3.1為載體與INTS11基因片段連接，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)，14h后挑取陽性單克隆送生工生物公司對菌液進(jìn)行PCR鑒定。

1.3 過表達(dá)載體以及干擾序列轉(zhuǎn)染

當(dāng)細(xì)胞匯合度為80%時使用lipofectanine3000轉(zhuǎn)染試劑盒將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到成肌肉細(xì)胞中，每孔3μL lipo3000，1000ng質(zhì)粒，培養(yǎng)24h后檢測過表達(dá)基因?qū)Τ杉〖?xì)胞的影響。

1.4 RT-qPCR

取細(xì)胞融合度達(dá)到80%的成肌細(xì)胞，使用Trizol提取法提取細(xì)胞RNA。具體步驟如下：參照Primescript?RT Reagent Kit（TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒）說明書，合成cDNA。按照SYBR@FAST qPCR Kit Master Mix（2×）Universal熒光定量試劑盒（諾維贊）說明書，以GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系體積為10μL：Mix5μL，cDNA1μL，上、下游引物（10mol·L^-1）各0.25μL，ddH₂O3.5μL（引物見表2）。每個樣品重復(fù)3次。

1.5 CCK8試驗

消化F1代的成肌細(xì)胞，通過血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，傳代到96孔板，每孔2000個細(xì)胞，待細(xì)胞完全貼壁，每孔加入10μL CCK-8試劑（南京諾唯贊生物科技有限公司），5%CO₂，37 ℃下培養(yǎng)2h，使用酶標(biāo)儀在450nm的波長下測吸光度。轉(zhuǎn)染步驟參照“1.3”按照細(xì)胞數(shù)量等比減少轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒濃度。對照組NC和試驗組各轉(zhuǎn)染6個孔，分別在0、24、48、72、96h時對成肌細(xì)胞進(jìn)行CCK8檢測。

1.6 Edu試驗

消化F1代的成肌細(xì)胞，傳代到12孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，5%CO₂，37℃下培養(yǎng)24h，對成肌細(xì)胞進(jìn)行Edu檢測，具體試驗步驟參照Cell Light EdU Apollo488In Vitro Kit說明書。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗和方差分析，Ｐ＜0.05表示差異顯著，Ｐ＞0.05表示差異不顯著。數(shù)據(jù)的可視化使用Graphpad prism8軟件，可視為平均值，誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2 結(jié) 果

2.1 INTS11保守性分析

2.1.1 INTS11蛋白的理化性質(zhì)

對牛INTS11的理化性質(zhì)分析顯示，INTS11基因共編碼599個氨基酸，相對分子質(zhì)量為67601.43，總原子數(shù)為9513。蛋白質(zhì)分子式C₃₀₁₇H₄₇₇₃N₈₂₃O₈₆₁S₃₉，理論等電點為8.27。氨基酸組成結(jié)果顯示，帶負(fù)電殘基總數(shù)68個，帶正電殘基總數(shù)72個，不穩(wěn)定指數(shù)為31.71，脂溶系數(shù)為86.24，細(xì)胞的半衰期為30h；總平均親水性為－0.196。用ProtScale軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的疏水性，表明組成INTS11的氨基酸中親水性氨基酸所占比例較大，且沒有明顯的疏水區(qū)域（圖1）。

2.1.2 INTS11的保守性分析

用MEGA11軟件進(jìn)行同源性分析并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)INTS11序列與水牛的親緣關(guān)系最近為97%，與野雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)為49.1%（圖2）。

2.2 INTS11結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 INTS11的磷酸化位點和糖基化位點預(yù)測結(jié)果

利用在線軟件Netphos3.1對INTS11潛在的磷酸化位點進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該蛋白有42個潛在的磷酸化位點，分別為17個蘇氨酸、19個絲氨酸、6個酪氨酸。分別用在線軟件NetoGlyc4.0和NetoGlyc1.0對INTS11潛在的Ｏ-糖基化位點和Ｎ-糖基化位點進(jìn)行分析，表明該蛋白有4個潛在的Ｏ-糖基化位點，分別位于202、204、205、208位氨基酸處；8個Ｎ-糖基化潛在位點，分別位于第28、119、298、343、409、434、440、489位氨基酸處（圖3）。

2.2.2 INTS11蛋白功能結(jié)構(gòu)域

利用SignalP4.1Server在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)INTS11的氨基酸序列不存在信號肽（圖4）。用PSORT軟件分析INTS11蛋白的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，INTS11主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，占總體的65.2%，細(xì)胞骨架占17.4%，細(xì)胞核中占13%，過氧化酶酶體占4.3%。利用NCBI在線網(wǎng)站預(yù)測INTS11蛋白功能結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)INTS11序列的第4～444位氨基酸具有MBL-foldmetallo-hydro結(jié)構(gòu)域，屬于MBL折疊金屬水解酶超家族的成員。第1501～1689位氨基酸構(gòu)成保守的β-CASP基序蛋白結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)位于MBL結(jié)構(gòu)域上方的單獨結(jié)構(gòu)域，其本身由N端和C端組成，該結(jié)構(gòu)域含有保守氨基酸（圖5）。

2.2.3 INTS11蛋白的高級結(jié)構(gòu)

利用在線軟件SOPMA預(yù)測INTS11的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，該蛋白主要以α-螺旋和延伸鏈以及無規(guī)則卷曲組成，β-轉(zhuǎn)角少量分布（圖6）。其中α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲有566個氨基酸共占94.49%；β-轉(zhuǎn)角只有33個氨基酸占總體的5.51%（表3）。利用PHYRE2在線軟件預(yù)測INTS11的三級結(jié)構(gòu)，并構(gòu)建三維模型（圖7）。

2.3 牛成肌細(xì)胞鑒定

2.3.1 牛成肌細(xì)胞形態(tài)觀察

肌肉組織經(jīng)膠原酶和胰蛋白酶消化，再經(jīng)過差速貼壁純化后，能夠獲得大量、純度較高的肌肉細(xì)胞。純化后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h，大量細(xì)胞都能夠完全貼壁生長，此時細(xì)胞形態(tài)呈橢圓形、細(xì)胞較??；繼續(xù)培養(yǎng)48h后，細(xì)胞形態(tài)逐漸展開，呈明顯的梭形、折光性強(qiáng)、有明顯的兩極。

2.3.2 成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)果

成肌細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以上后，加入分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行誘導(dǎo)分化；結(jié)果顯示，隨著分化時間的增加，成肌細(xì)胞之間逐漸發(fā)生相互融合，形成長條形肌管；細(xì)胞融合后，多個細(xì)胞核發(fā)生聚集，分布在肌管中央；平行排列的肌管之間也能夠發(fā)生相互融合，最終形成更粗的肌管，并利用免疫熒光染色對肌管的MYH3蛋白進(jìn)行染色（圖8）。

2.3.3 INTS11基因CDS區(qū)克隆以及過表達(dá)載體構(gòu)建

以成肌細(xì)胞得到cDNA為模板，設(shè)計INTS11基因的上、下游引物（表1），進(jìn)行PCR及凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)在1800bp處有一條與預(yù)期大小相一致的條帶（圖9A），分別將有正確基因片段的cDNA和pcDNA3.1質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切并連接，通過熱激法將其轉(zhuǎn)入DH5α體感受態(tài)細(xì)胞中，對構(gòu)建成功的載體進(jìn)行測序，分別從正向和反向測序（圖9B）。測序結(jié)果與INTS11基因CDS區(qū)序列完全一致，表明INTS11基因的過表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為pcDNA3.1-INTS11。

2.3.4 INTS11基因過表達(dá)促進(jìn)牛成肌細(xì)胞增殖

為研究INTS11對成肌細(xì)胞增殖過程的影響，把構(gòu)建成功的pcDNA-INTS11轉(zhuǎn)染到成肌細(xì)胞中，分別進(jìn)行CCK8、Edu和熒光定量PCR試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，試驗組細(xì)胞的INTS11基因表達(dá)量顯著上升（圖10A），可以確定轉(zhuǎn)染成功。CCK8結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗組的72～96h增殖速度顯著高于對照組（圖10B），可初步認(rèn)定過表達(dá)INTS11能夠明顯促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖（Plt;0.05）。EdU試驗陽性細(xì)胞率顯著升高（圖10D，Plt;0.05）。熒光定量試驗結(jié)果表明與對照組相比轉(zhuǎn)染pcDNA-INTS11的成肌細(xì)胞中與細(xì)胞增殖相關(guān)的標(biāo)志性基因CDK2、CYCLIND1的mRNA表達(dá)量顯著性增加（Plt;0.05，圖10E）。

2.3.5 干擾INTS11抑制細(xì)胞增殖

結(jié)果顯示，使用3條siRNA干擾INTS11基因時，選擇干擾效率最高的si-bta-INTS11-002序列為接下來試驗的干擾序列。結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染si-bta-INTS11-002后，72～96h試驗組細(xì)胞增殖速度顯著下降；CDK2、CYCLIND1mRNA表達(dá)顯著降低（Plt;0.05，圖11）。

3 討 論

INTS11屬于INT蛋白家族核心模塊的組成成員，是一種具有高度保守性的蛋白，具有核酸內(nèi)切酶活性^[18]。目前對INTS11的功能研究主要集中在基因的轉(zhuǎn)錄機(jī)制以及在RNA的產(chǎn)生和加工、核酸代謝中發(fā)揮的作用^[19]。但關(guān)于INTS11基因?qū)趋兰〖?xì)胞生長發(fā)育的影響目前停留在生物信息學(xué)分析階段，其在骨骼肌細(xì)胞中的功能作用還鮮見報道。

本研究以體外分離的成肌細(xì)胞為試驗對象，克隆出INTS11基因完整CDS序列，對其編碼的氨基酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能進(jìn)行了綜合分析，通過對INTS11基因進(jìn)行不同物種間的同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)普通牛與水牛的親緣關(guān)系最近，與野雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，符合生物進(jìn)化特征，并且具有廣泛的同源性，說明INTS11對動物生長發(fā)育過程的基因調(diào)控具有不可替代的作用。在INTS11蛋白結(jié)構(gòu)中預(yù)測的MBL-foldmetallo-hydro結(jié)構(gòu)域，屬于MBL折疊金屬水解酶超家族的成員^[20]，例如，人類5′-核酸外切酶（SNM1A）具有5′-3′外切核糖核溶解和核內(nèi)裂解活性，可以催化核糖核酸去除tRNA前體的3′延伸^[21]。β-CASP基序的蛋白結(jié)構(gòu)域，其主要組成是水解酶和相關(guān)蛋白質(zhì)，是位于MBL結(jié)構(gòu)域上方的單獨結(jié)構(gòu)域，本身由N端和C端組成，該結(jié)構(gòu)域含有保守氨基酸，可以協(xié)調(diào)金屬離子用于催化^[22]，預(yù)測該結(jié)構(gòu)域作為RNA特異性內(nèi)切核酸酶起作用^[23]，可以調(diào)節(jié)INTS11的催化活性。本研究發(fā)現(xiàn)，INTS11基因的序列具有保守性，且其蛋白屬于無信號識別功能的非分泌蛋白，主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用，這為后續(xù)INTS11的功能驗證提供了理論基礎(chǔ)和研究方向。

細(xì)胞增殖是分化的前提^[24]，促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖對骨骼肌纖維^[25]的生長發(fā)育有積極意義。本研究通過構(gòu)建INTS11的過表達(dá)載體和干擾序列并分別轉(zhuǎn)染到牛的成肌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)INTS11基因在成肌細(xì)胞中過表達(dá)后促進(jìn)增殖基因CDK2、CYCLIND1的表達(dá)。反之，當(dāng)對成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾序列時，成肌細(xì)胞增殖效率下降，同時CDK2、CYCLIND1基因的表達(dá)量下降。以往關(guān)于INTS11的研究集中在基因表達(dá)調(diào)控中的分子機(jī)制，一方面INTS11可以與RNA聚合酶II進(jìn)行互作參與基因表達(dá)的調(diào)控^[26]；另一方面INTS11的濃度改變可以啟動某些信號通路，如MAPK通路等^[27]。果蠅模型研究發(fā)現(xiàn)，敲低果蠅INTS11表達(dá)導(dǎo)致果蠅運動能力降低^[28]。一些報道稱，RNAi沉默INTS11可以導(dǎo)致UsnRNA前體3′端處理異常，產(chǎn)生大量的UsnRNA錯誤剪切^[29]。3′端非編碼區(qū)富含非典型polyA信號和GC富集的基因轉(zhuǎn)錄終止依賴于INT復(fù)合體^[30]，敲低INTS11導(dǎo)致這些基因的轉(zhuǎn)錄延長^[31]，并表現(xiàn)出異常的RNA聚合酶II占據(jù)模式以及異常的組蛋白修飾^[32]等。在人類的癌細(xì)胞（EAL）研究中發(fā)現(xiàn)INTS11可以激活Notch靶基因上調(diào)而導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖，將INTS11敲除導(dǎo)致EAC細(xì)胞生長停滯甚至凋亡^[33]，缺失INTS11蛋白結(jié)構(gòu)的細(xì)胞系在U1和U2初級轉(zhuǎn)錄物的加工中表現(xiàn)出明顯的缺陷^[34]。在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，INTS11基因?qū)π∈蟮闹痉只嘘P(guān)鍵作用^[35]，在人類的免疫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)INTS11缺失導(dǎo)致造血系統(tǒng)中造血祖細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯^[36]，進(jìn)而導(dǎo)致免疫細(xì)胞的功能障礙。但在肌肉細(xì)胞中INTS11發(fā)揮的功能和分子機(jī)制還鮮見報道。本研究發(fā)現(xiàn)INTS11過表達(dá)或干擾時參與細(xì)胞調(diào)控的基因（CYCLIND1、CDK2）^[37]分別上調(diào)和下調(diào)，其中CYCLIND1能促進(jìn)細(xì)胞周期G1期的細(xì)胞增殖^[38-39]。CDK2是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，它通過與CCNA2形成復(fù)合體來促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期過渡^[40-41]，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)展。因此，可以認(rèn)為INTS11可能通過Notch信號通路作用于細(xì)胞增殖周期的靶基因促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖。

4 結(jié) 論

本研究分析了INTS11在家養(yǎng)動物中的保守性和牛INTS11蛋白的序列信息，預(yù)測到INTS11具有MBL-foldmetallo-hydro和β-CASP基序兩個功能結(jié)構(gòu)域，初步證實INTS11通過介導(dǎo)CDK2和CYCLIND1的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)牛成肌細(xì)胞增殖。但關(guān)于INTS11在牛個體水平上如何調(diào)節(jié)骨骼肌生長發(fā)育的機(jī)制需更多試驗驗證。本研究為探究INTS11的基因調(diào)控機(jī)制和肉牛骨骼肌發(fā)育，提供了試驗基礎(chǔ)和理論參考。

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（編輯 郭云雁）