硒代蛋氨酸通過PINK1/Parkin介導的線粒體自噬緩解氟誘導的抑郁樣行為

摘 要：本文旨在探究PINK1/Parkin介導的線粒體自噬在硒代蛋氨酸（selenomethionine，Se-Met）緩解氟致抑郁樣行為中的作用。選取40只BALB/c小鼠隨機分為5組：空白對照組（C組）、氟組（NaF150mg·L^-1，F組）、氟+低硒組（NaF150mg·L^-1+1.5mg·L^-1，F+LSe組）、氟+中硒組（NaF150mg·L^-1+3.0mg·L^-1，F+MSe組）、氟+高硒組（NaF150mg·L^-1+6.0mg·L^-1，F+HSe組）。氟化鈉暴露90d后，通過高架O型迷宮和懸尾試驗觀察小鼠的行為學表現，運用HE染色觀察小鼠大腦皮質的損傷情況，采用生化試劑盒檢測氧化應激相關指標的含量，并使用實時熒光定量PCR方法檢測線粒體自噬相關基因的表達水平。動物行為學結果顯示：與C組相比，F組小鼠在懸尾試驗中的“靜止”時間顯著增加（P＜0.05），在高架O型迷宮中進入閉合臂的時間有明顯升高趨勢（P＜0.05）。在補充Se-Met后小鼠“靜止”時間顯著減少（P＜0.05），F+LSe和F+MSe小鼠進入閉合臂的時間相比于F組顯著減少（P＜0.05）。病理組織切片結果顯示：F組小鼠大腦皮質細胞排列紊亂，細胞體積縮小，且椎體細胞數量減少。經Se-Met改善后，F+LSe組的大腦皮質組織核仁清晰，細胞質更加均勻，改善效果更顯著。氧化應激相關指標結果顯示：與C組相比，F組活性氧（reactive oxygen species，ROS）顯著升高（P＜0.05），谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）含量顯著減少（P＜0.05）。與F組相比，F+LSe、F+HSe和F+MSe組ROS含量均顯著降低（P＜0.05），且含量依次表現為F+LSelt;F+HSelt;F+MSe；F+LSe和F+HSe組GSH-PX含量相比于F組顯著升高（P＜0.05）。自噬相關基因的mRNA表達水平結果顯示：與C組相比，F組自噬相關基因Parkin、PINK1、LC3、OPTN、NBR1、Drp1、Fis1的mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05），OPA1、Mfn1、Mfn2的mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05）。與F組相比，F+LSe和F+HSe組顯著降低Parkin、OPTN、PINK1、P62、NBR1和Fis1的mRNA表達水平（P＜0.05），F+LSe和F+MSe組顯著降低Parkin、LC3、Drp1和P62的mRNA表達水平（P＜0.05），顯著增加OPA1的mRNA表達水平（P＜0.05），F+LSe組顯著增加Mfn2的mRNA表達水平（P＜0.05）。綜上所述，1.5mg·L^-1Se-Met可通過影響線粒體自噬相關基因的表達，恢復線粒體融合與分裂的動態(tài)平衡狀態(tài)，緩解大腦皮質氧化應激，從而改善大腦皮質組織損傷和抑郁樣行為的出現。

關鍵詞：硒代蛋氨酸；氟；線粒體自噬；大腦皮質

中圖分類號：S856.9

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-3213-12

收稿日期：2023-11-03

基金項目：國家自然科學基金項目（31972751）; 現代農業(yè)產業(yè)體系項目（2024CYJSTX13-10）; 山西農業(yè)大學橫向科技項目（2022HX286; 2024HX001）

作者簡介：李媛媛（1999-），女，山西晉城人，碩士，主要從事環(huán)境毒理學研究，E-mail：16635049401@163.com；王天玉（1995-），女，山西長治人，博士，主要從事環(huán)境毒理學研究，E-mail：2984232749@qq.com，李媛媛和王天玉為同等貢獻作者

*通信作者：王金明，主要從事環(huán)境毒理學研究，E-mail：jm50408@163.com

Selenomethionine，through PINK1/Parkin-mediated Mitochondrial Autophagy，

Alleviates Fluoride-induced Depressive-like Behavior

LIYuanyuan，WANGTianyu，LIMeng，ZHANGWenhui，WANGYinghui，

ZHAOTianrui，LIHaojie，ZHAOYangfei，WANGJinming^*

（College of Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu030801，China）

Abstract：This experiment aims to investigate the role of PINK1/Parkin-mediated mitochondrial autophagy in the alleviation of fluoride-induced depressive-like behavior by selenomethionine（Se-Met）.Forty BALB/c mice were selected and randomly divided into five groups：the blank control group（Group C），the fluorine group（NaF150mg·L^-1，Group F），the fluorine+low selenium group（NaF150mg·L^-1+1.5mg·L^-1，Group F+LSe），the fluorine+medium selenium group（NaF150mg·L^-1+3.0mg·L^-1，Group F+MSe），the fluorine+high selenium group（NaF150mg·L^-1+6.0mg·L^-1，Group F+HSe）.After90d of sodium fluoride exposure，the behavioral performance of mice was assessed by means of an elevated O-maze and hanging tail experiments; HE staining was used to evaluate the damage of the mouse cortex; biochemical kits were used to measure the content of oxidative stress-related indices; and real-time fluorescence quantitative PCR was utilized to determine the expression levels of mitochondrial autophagy-related genes.Animal behavioral results showed：the results indicated that mice in group Fhad asignificantly longer\"resting\"time in the tail suspension test compared to group C（Plt;0.05）and atendency to take more time to enter the closed arm of the elevated O-maze（Plt;0.05）.After Se-Met supplementation，the\"resting\"time of mice was reduced significantly（Plt;0.05），and the F+LSe and F+MSe mice took significantly less time to enter the closed arm（Plt;0.05），compared to the Fgroup.The results of the histopathological sections showed：the mice in group Fhad disorganized cortical cells，reduced cell volume，and fewer vertebral cells.Following Se-Met enhancement，the F+LSe group showed distinct nuclei and more uniform cytoplasm，and the improvement was notably more pronounced.The results of oxidative stress related indicators showed：group Fhad asignificantly higher level of reactive oxygen species（ROS）（Plt;0.05），and asignificantly reduced content of glutathione peroxidase（GSH-PX）（Plt;0.05），when compared to group C.Groups F+LSe，F+HSe，and F+MSe showed significantly lower levels of ROS（Plt;0.05）.Compared to group F，the ROS content was considerably lower（Plt;0.05），in groups F+LSe，F+HSe，and F+MSe，with the content decreasing in the order of F+LSelt;F+HSelt;F+MSe; the GSH-PX content，on the other hand，was significantly higher（Plt;0.05），in groups F+LSe and F+HSe，compared to group F.Results of mRNA expression levels of autophagy-related genes were shown：group Fshowed significantly higher mRNA expression levels of autophagy-related genes Parkin，PINK1，LC3，OPTN，NBR1，Drp1，and Fis1（Plt;0.05），compared to group C，and significantly lower mRNA expression levels of OPA1，Mfn1，and Mfn2（Plt;0.05）.Compared to group F，the mRNA expression levels of Parkin，PINK1，P62，NBR1，OPTN，and Fis1were significantly lower in the F+LSe and F+HSe groups（Plt;0.05），LC3，Parkin，P62and Drp1were significantly decreased in the F+LSe and F+MSe groups（Plt;0.05），OPA1was significantly increased（Plt;0.05），and the F+LSe group showed asignificant increase in the mRNA expression level of Mfn2（Plt;0.05）.In summary，1.5mg·L^-1of Se-Met can alleviate cortical oxidative stress by affecting the expression of mitochondrial autophagy-related genes，restoring the dynamic equilibrium state of mitochondrial fusion and fission，and thus ameliorating cerebral cortex damage and the emergence of depressive-like behaviors.

Key words：selenomethionine; fluoride; mitochondrial autophagy; cerebral cortex

*Corresponding author：WANG Jinming，E-mail：jm50408@163.com

氟作為人體必需微量元素之一，適量攝入時可促進機體對鈣和磷的吸收，加快骨的生長，預防齲齒^[1]。然而，長期攝入過量的氟，不僅會造成氟斑牙和氟骨癥，對多種非骨相組織也存在毒性效應。Wang等^[2]發(fā)現150mg·L^-1氟化鈉對慢性氟中毒患者的精神有不良影響，主要引起記憶和注意力受損、嗜睡和思維困難等。在小鼠的試驗中也發(fā)現100mg·L^-1氟化鈉攝入會導致小鼠行為異常，造成動物出現認知功能障礙和智力缺陷，降低動物的學習和記憶能力^[3]。近年來，氟化物對神經系統(tǒng)影響的相關研究以及防治策略已經成為許多國家（特別是發(fā)展中國家）亟待解決的問題。Duan等^[4]研究發(fā)現，小鼠的慢性社會挫敗應激模型（chronic social defeated stress，CSDS）導致線粒體損傷，從而觸發(fā)杏仁核中的PINK1-Parkin線粒體自噬途徑。PINK1/Parkin通路被認為是線粒體自噬的重要途徑之一，主要參與受損線粒體的清除^[5]。但線粒體的過度自噬會使線粒體受損，導致線粒體功能障礙。有研究表明，氧化應激引起的線粒體功能障礙會導致細胞凋亡激活，從而導致抑郁癥。抑郁癥患者中線粒體DNA（mtDNA）缺失的頻率較高^[6]。而目前也已有研究發(fā)現氟可以產生過量活性氧（ROS），誘導線粒體裂變與融合之間的平衡，導致線粒體功能和形態(tài)異常^[7]。大量研究表明，氟暴露可導致小鼠淋巴細胞線粒體損傷和ROS積累，進一步研究發(fā)現氟中毒可導致線粒體裂變與融合失衡和細胞內ROS增加^[8-10]。

硒現在被廣泛認為是大腦中必需的微量元素。試驗證據表明，硒與神經系統(tǒng)正常功能的維持密切相關^[11]。硒代蛋氨酸（selenomethionine，Se-Met）是一種低毒、高生物利用度的有機硒化合物，是機體吸收硒的重要化學形式^[12]。Se-Met發(fā)揮著關鍵的抗氧化、抗炎作用。前人的研究表明，一定劑量的硒可緩解氟中毒，抑制氟誘導的脂質過氧化，糾正氧自由基，改善氟所致大腦損傷的作用^[13]。王玉鑫等^[14]的研究表明Se-Met可通過抑制氧化應激來拮抗氟對機體造成的損傷。Se-Met在神經系統(tǒng)中的作用不僅歸功于其抗氧化特性，有研究報道缺硒還可能會影響一些心理參數，補硒后發(fā)現其與情緒和抑郁狀態(tài)的改善有關^[15]。長期缺硒會增加阿爾茨海默病等神經退行性疾病的風險^[16]。Zhang等^[17-18]研究發(fā)現Se-Met治療12周能顯著提高阿爾茨海默病模型小鼠的認知能力，降低淀粉樣蛋白-β（amyloid β-protein，Aβ）沉積水平，減輕氧化應激和突觸損傷。不僅如此，雌性小鼠在給藥間三氟甲基-二苯基二硒化物后，抑郁狀況顯著減輕^[19]，以上這些表明Se-Met具有潛在的抗抑郁作用。而硒在抗抑郁中的機制研究已經發(fā)現硒可以有效緩解阿爾茨海默病模型小鼠的線粒體功能障礙，恢復線粒體融合與分裂的動態(tài)平衡^[20]。但目前關于Se-Met是否可以緩解氟中毒引起的大腦皮質損傷以及與PINK1/Parkin介導的線粒體自噬之間是否存在聯(lián)系還鮮有報道。

因此，本研究將從動物行為學試驗、組織形態(tài)學觀察、氧化應激相關指標和線粒體自噬相關基因的mRNA表達水平等方面，通過PINK1/Parkin介導的線粒體自噬探究Se-Met緩解氟中毒小鼠的抑郁樣行為，為今后治療地方性氟中毒誘導的大腦皮質損傷提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

硒代蛋氨酸（上海麥克林生物科技有限公司）；氟化鈉（NaF）（天津市風船化學試劑科技有限公司）；蘇木精、伊紅（廣東臺山化工廠）；ROS試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化氫酶（GSH-PX）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；RNAiso Plus、SYBR Green qPCR Master Mix、SYBR Green PCR kit（大連寶生物工程有限公司）

1.1.2 主要儀器

自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化器廠SZ-93型）；生物組織包埋機（KD-BM）、石蠟組織自動切片機（KD-2508）（深圳永年科技有限公司）；BX51型成像顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；組織勻漿儀（德國IKA公司）；Mx3000P實時熒光定量PCR儀（美國Stratagene公司）；PCR儀、酶標儀（美國Bio-Rad公司）；高速冷凍離心機（D-3752）（德國Sigma公司）；生物組織包埋機HY-BM1160（金華惠支儀器設備有限公司）；電子分析天平（AUY-120，日本島津）；Elevated zero maze行為學裝置和Tail suspension行為學裝置（沃瑞德（深圳）生物科技有限公司）

1.1.3 實驗動物

45只雄性3周齡BALB/c小鼠購買于山西省人民醫(yī)院實驗動物中心。所有動物均飼養(yǎng)在溫度適宜，通風良好的環(huán)境中。本試驗所用實驗動物和試驗設計均遵循山西農業(yè)大學動物實驗倫理審查相關規(guī)定（審批編號：SXAU-EAW-2019M0601）。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組

45只3周齡BALB/c小鼠（體重（20±1）g）適應性飼養(yǎng)一周后，隨機分為5個組，分別為空白對照組（C組）、氟組（NaF150mg·L^-1[21]，F組）、氟+低硒組（NaF150mg·L^-1+1.5mg·L^-1，F+LSe組）、氟+中硒組（NaF150mg·L^-1+3.0mg·L^-1，F+MSe組）、氟+高硒組（NaF150mg·L^-1+6.0mg·L^-1，F+HSe組）。SeMet與NaF均通過飲水攝入。

1.2.2 樣品采集與處理

飼喂90d后，首先對健康小鼠進行行為學試驗，斷頸處死，取小鼠大腦皮質組織，剝離小鼠顱骨，使其大腦完全暴露，用手術刀片切斷大腦和小腦連接處，再切開左右大腦半球，即可暴露大腦皮質組織，用鑷子從大腦側面輕輕剝離，即為大腦皮質組織，每組取3只小鼠的大腦皮質組織用4%多聚甲醛固定，用于病理組織學染色，剩余凍于-80 ℃保存，用于氧化應激相關指標和自噬相關基因的測定。

1.2.3 行為學試驗

1.2.3.1 高架O型迷宮試驗（elevated zero maze，EZM）：黑色O型迷宮離地面50cm，在離圓心40cm處由兩相對開臂和兩相對閉臂區(qū)組成，附有立墻。每只小鼠提前一天訓練5min，使其熟悉EZM環(huán)境。試驗時將小鼠放入開臂區(qū)中間，頭面向閉壁區(qū)，拍攝動物5min內的行為軌跡，記錄分析小鼠在開放臂和閉合臂的時間。每只動物在試驗結束后需要清除糞便，并且用75%酒精噴灑底部。

1.2.3.2 懸尾試驗（tail suspension test，TST）：小鼠懸尾裝置是一個頂上有掛鉤的木制盒。試驗時將小鼠尾巴用膠帶粘住然后頭朝下同時掛在掛鉤上，保證其不會掉落，且頭離盒底要有一定距離，記錄其在5min中內持續(xù)不動的時間。

1.2.4 病理組織切片染色

取用4%多聚甲醛固定的大腦皮質組織，24h后，流水沖洗，通過梯度酒精脫水、透明、浸蠟和包埋后進行切片，厚度為5μm。制備好的組織切片經過脫蠟、水化后用蘇木精染色；用1%鹽酸進行分化，水洗返藍；加入伊紅染液進行染色并充分水洗，經梯度酒精脫水和二甲苯透明后，最后中性樹膠封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 氧化應激相關指標檢測

每組分別取6只小鼠的大腦皮質，按照1∶9（1g組織∶9mL PBS緩沖液）的比例加入PBS緩沖液，冰浴勻漿后4 ℃3000r·min^-1離心20min，取上清液。分別用ROS、CAT、GSH-PX生化試劑盒測定皮質中氧化應激水平，具體操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.6 自噬相關基因mRNA表達水平檢測

每組分別取8只小鼠的大腦皮質，采用Trizol法提取總RNA，進行純度測定，并采用凝膠電泳檢驗總RNA的完整性，檢測后的總RNA利用TaKaRa一步法反轉錄試劑盒進行反轉錄，反轉錄后的cDNA以β-actin為內參，用熒光定量PCR儀檢測自噬相關基因的mRNA表達水平。20μL反應體系包括2×SYBR Green qPCR Master Mix10μL，上下游引物各0.4μL，ddH₂O7.2μL，cDNA2μL。反應條件：95℃預變性10min，循環(huán)反應95℃15s和60℃30s，共40個循環(huán)，最后運用2^－ΔΔCT方法進行基因表達量的計算。根據發(fā)表在NCBI上的基因序列，采用Primer5在線軟件設計特異性引物，相關引物序列見表1。

1.2.7 數據分析

數據的統(tǒng)計和分析采用SPSS26.0軟件進行單因素方差（one-way ANOVA）分析和最小顯著差數法（LSD）多重比較，以Plt;0.05表示差異的顯著性，試驗數據釆用“x-±s”表示。

2 結 果

2.1 高架O型迷宮試驗

圖1結果顯示，F組小鼠在迷宮中進入閉合臂的時間相比于C組有明顯升高趨勢（Plt;0.05），F+LSe和F+MSe組相比于F組小鼠進入閉合臂的時間顯著減少（Plt;0.05）。

2.2 懸尾試驗

懸尾試驗結果（圖2）顯示，F組小鼠在懸尾試驗中的“靜止”時間相比于C組顯著增加（Plt;0.05），與F組相比，F+LSe、F+MSe和F+HSe組小鼠“靜止”時間均顯著降低（Plt;0.05）。

2.3 小鼠大腦皮質組織形態(tài)學變化

通過HE染色（圖3），發(fā)現C組小鼠皮層分隔清晰，細胞排列致密，細胞核清晰。與對照組比較，F組小鼠大腦皮質層細胞排列紊亂，細胞體積縮小，椎體細胞數量減少，軸突變短（如圖3箭頭所示）。與F組相比，F+LSe組的核仁清晰，細胞質更加均勻，椎體細胞數目增加；但F+MSe組和F+HSe組與F組比較雖然大腦皮質組織受損狀況有所減輕，但與F組比較僅有F+LSe組改善效果顯著。

2.4 氧化應激相關指標結果

氧化應激結果（圖4）顯示，與C組相比，F組ROS含量顯著升高（P＜0.05），GSH-PX含量顯著減少（P＜0.05）；與F組相比，F+LSe、F+HSe和F+MSe組ROS含量均顯著降低（P＜0.05），且含量依次表現為F+LSelt;F+HSelt;F+MSe；F+LSe和F+HSe組GSH-PX含量相比于F組顯著升高（P＜0.05）。CAT結果顯示均沒有顯著變化。

2.5 自噬相關基因mRNA表達水平

自噬相關基因mRNA表達水平結果（圖5）顯示，與C組相比，F組Parkin、PINK1、LC3、OPTN、NBR1、Drp1、Fis1的mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05），OPA1、Mfn1、Mfn2的mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），P62的mRNA表達水平沒有顯著變化。與F組相比，F+LSe組顯著降低Parkin、PINK1、LC3、OPTN、NBR1、P62、Drp1和Fis1的mRNA表達水平（P＜0.05），顯著升高OPA1、Mfn2的mRNA表達水平（P＜0.05）；F+MSe組顯著降低Parkin、NBR1、P62、LC3和Drp1的mRNA表達水平（P＜0.05），顯著升高OPA1的mRNA表達水平（P＜0.05）；F+HSe組顯著降低Parkin、PINK1、NBR1、P62、OPTN和Fis1的mRNA表達水平（P＜0.05）。經Se-Met改善后Mfn1的mRNA表達水平沒有顯著變化。

3 討 論

氟化物和其他鹵族元素一樣，可通過血腦屏障進入大腦。目前，已有的流行病學調查和動物實驗研究證實了氟化物的神經毒性作用^[22，23]。據報道，長期飲用氟化物含量較高的水患癡呆癥的風險更高^[24]。氟化物引起的神經毒性會導致機體活性氧的產生、線粒體受損和抗氧化酶能力下降^[25-26]。硒作為大腦中必需的微量元素之一，對大腦和神經系統(tǒng)中參與抗氧化防御的硒蛋白的正常功能至關重要^[27]。試驗證據表明，大腦中的硒水平隨著年齡的增長而降低，并且這種降低與大腦的認知障礙有關^[28]。Loef等^[16]發(fā)現，長期缺硒會增加阿爾茨海默病等神經退行性疾病的風險。

EZM和TST都是評價焦慮狀態(tài)的經典方法，在精神神經藥理學基礎中應用廣泛^[29]。EZM試驗主要探索小鼠的心理活動，正常小鼠會有探索心理而驅使它們向開放區(qū)域運動，而有焦慮抑郁情緒的小鼠向開放區(qū)探索的動力會減弱。TST通過將試驗動物的尾部固定從而使其頭部向下懸掛，其在有限環(huán)境中四肢拼命掙扎但無法逃脫，之后四肢間斷性放棄掙扎，即為典型的“不動狀態(tài)”，反映出了“行為絕望狀態(tài)”。本研究結果顯示150mg·L^-1的NaF引起小鼠焦慮抑郁樣行為的出現。1.5、3.0mg·L^-1的Se-Met都顯著減少了懸尾試驗中的“靜止”時間和小鼠進入閉合臂的時間，緩解了焦慮抑郁的行為。這提示Se-Met的抗抑郁效應與劑量有一定相關性。與本試驗一致的是，一種抗抑郁藥有機硒化合物同樣減輕小鼠在懸尾試驗中的“靜止”時間^[30]。由于動物組織結構是其發(fā)揮具體功能的基礎，因此判斷小鼠抑郁樣行為的出現與其大腦皮質組織結構的變化存在著密切聯(lián)系。本試驗發(fā)現F組小鼠大腦皮質出現空泡化，細胞排列紊亂，有壞死現象，與前人研究結果一致^[31]。經Se-Met改善后，發(fā)現1.5mg·L^-1的Se-Met顯著減輕了大腦皮質的損傷情況，使核仁清晰，細胞質更加均勻，且椎體細胞數目增加。說明低劑量的Se-Met緩解氟中毒導致的細胞損傷，可在一定程度上恢復氟造成的神經細胞損傷。Zheng等^[32]研究發(fā)現，在補充Se-Met后，可明顯減輕阿爾茨海默病模型小鼠的神經元損傷，增加神經細胞的數目，維持較為完整的細胞形態(tài)。大量研究表明，氧化應激是導致氟毒性效應的關鍵機制^[33-34]，氟暴露使小鼠機體處于氧化應激狀態(tài)，從而導致過量的活性氧自由基及氧化應激產物對小鼠大腦皮質組織造成損傷，影響大腦皮質功能。

氧化應激作為引起氟中毒的重要作用機制之一，抗氧化物質在其過程中顯得尤為重要。硒對氟抗氧化能力的影響已經被很多學者研究。硒是機體內谷胱甘肽過氧化物酶的活性中心，是合成抗氧化酶的必需元素^[35]。

酶抗氧化系統(tǒng)作為對抗氧化物質的防線之一，可以拮抗氟誘導的氧化應激。研究顯示，硒在體內的含量可以影響機體GSH-PX、ROS、CAT等因子的活性^[36]。在本試驗中也可看出有機硒可以緩解氟中毒小鼠大腦皮質組織的氧化水平。F組GSH-PX含量相對C組顯著下降，ROS水平顯著升高，與F組相比，1.5mg·L^-1和6.0mg·L^-1的Se-Met顯著增加了GSH-PX含量。因此，本研究表明Se-Met顯著提升了小鼠機體內的抗氧化能力，減少ROS的產生，而這也是Se-Met可保護大腦皮質組織免受氟化物影響的重要原因之一。Wang等^[14]研究發(fā)現補充0.15mg·kg^-1的Se-Met可以顯著提高GSH-PX的活性，改善氟中毒引起的氧化應激。大量研究表明過量的ROS自由基和氧化應激產物可引起組織損傷，進而通過復雜的信號機制導致線粒體功能障礙，影響其正常的生理功能^[37-39]。

線粒體是高度動態(tài)的細胞器，可根據細胞環(huán)境的變化進行融合和裂變，并能通過PINK1和Parkin調控的線粒體自噬來確保線粒體周轉和受損線粒體的清除^[40]。正常情況下，PINK1含量極低，然而，當線粒體受損時，PINK1進入線粒體內膜的路徑被阻斷，并聚集于線粒體外膜，將Parkin募集至受損線粒體。PINK1位于Parkin上游發(fā)揮作用，兩者協(xié)同調控線粒體自噬^[5]。本研究發(fā)現，1.5、3.0和6.0mg·L^-1的Se-Met均顯著下調了自噬相關基因Parkin和PINK1的mRNA的表達水平，其中1.5mg·L^-1Se-Met的改善效果相較于3.0和6.0mg·L^-1Se-Met的改善效果更好。研究表明，在PINK1/Parkin介導的線粒體自噬發(fā)生過程中，P62將優(yōu)先定位于鄰近線粒體之間，通過其PB1寡聚結構域促進受損線粒體的聚積^[41]。但在本研究中氟暴露后并沒有導致P62mRNA表達增加。有研究顯示敲除P62，對Parkin募集至線粒體這一過程并沒有影響，只是影響到對受損線粒體的最終清除。而NBR1是連接LC3與泛素蛋白的另一蛋白，與P62協(xié)同參與線粒體自噬過程^[42]。本研究發(fā)現，Se-Met顯著降低了NBR1的mRNA，1.5和3.0mg·L^-1的Se-Met顯著降低了LC3的mRNA表達水平。因此推測本試驗中NBR1與P62協(xié)同參與自噬的過程，其中主要以NBR1為主。研究表明，OPTN是PINK1/Parkin介導線粒體自噬過程的主要受體，線粒體的有效清除需它們參與^[43]。本研究結果顯示1.5和6.0mg·L^-1的Se-Met顯著下調了OPTN的mRNA表達水平，使自噬恢復到正常水平。以上這些結果表明，1.5和6.0mg·L^-1的Se-Met可以緩解氟暴露導致PINK1/Parkin介導的線粒體自噬，進而維持線粒體功能正常。氟中毒可引起線粒體功能障礙，部分原因是線粒體裂變與融合之間的平衡被破壞，導致線粒體形態(tài)發(fā)生變化，進而導致線粒體功能障礙^[44]。線粒體融合由三種GTPases調節(jié)，即線粒體外膜中的Mfn1和Mfn2以及內膜中的OPA1^[45]。這個過程將相鄰的線粒體連接在一起，并合并它們的內膜和外膜，最終形成一個線粒體。Drp1被轉運到線粒體外膜以啟動寡聚反應，沿著線粒體外表面形成圍繞未來裂變位點的大環(huán)復合物^[46]。研究發(fā)現重度抑郁患者大腦中Drp1表達增加，而Mfn1、Mfn2和OPA1的mRNA表達減少^[47]。還有報道稱，Drp1表達的減少可減少阿爾茨海默病模型小鼠中寡聚淀粉樣蛋白-β（Aβ）的產生，減少線粒體功能障礙，維持線粒體動力學，并增強線粒體生物發(fā)生和突觸活性^[47-48]。本研究發(fā)現1.5和3.0mg·L^-1的Se-Met顯著上調OPA1的mRNA表達，且顯著下調Drp1的mRNA表達，1.5和6.0mg·L^-1的Se-Met顯著下調Fis1的mRNA表達，1.5mg·L^-1的Se-Met顯著上調Mfn2的mRNA表達。Chen等^[20]研究結果發(fā)現，6mg·L^-1Se-Met顯著增加小鼠線粒體融合蛋白Mfn2的表達水平，并降低Drp1的表達水平，與本文結果相似。綜上所述，1.5mg·L^-1Se-Met可以更顯著緩解氟誘導的線粒體自噬，并恢復線粒體融合與分裂的動態(tài)平衡狀態(tài)，進而維持線粒體的正常功能。

4 結 論

1.5mg·L^-1Se-Met可通過影響線粒體自噬相關基因的表達，恢復線粒體融合與分裂的動態(tài)平衡狀態(tài)，緩解大腦皮質氧化應激，從而改善大腦皮質組織損傷和抑郁樣行為的出現。

參考文獻（References）：

[1]李洋杰，祁 榮，張馨予，等.丁酸鈉對氟中毒模型大鼠的神經保護及乙?；鞍捉M學分析[J].中國組織工程研究，2023，27（20）：3151-3157.

LI YJ，QI R，ZHANG XY，et al.Neuroprotective effects of sodium butyrate and acetylation proteomics analysis in fluorosis rats[J].Chinese Journal of Tissue Engineering Research，2023，27（20）：3151-3157.（in Chinese）

[2]WANG FQ，LI YJ，TANG DX，et al.Exploration of the SIRT1-mediated BDNF-TrkB signaling pathway in the mechanism of brain damage and learning and memory effects of fluorosis[J].Front Public Health，2023，11：1247294.

[3]李洋杰.丁酸鈉通過糖酵解途徑改善氟中毒小鼠學習記憶損傷的機制研究[D].沈陽：沈陽醫(yī)學院，2023.

LI YJ.The mechanism of sodium butyrate improving learning and memory impairment in fluorosis mice through glycolysis pathway[D].Shenyang：Shenyang Medical College，2023.（in Chinese）

[4]DUAN KZ，GU QH，PETRALIA RS，et al.Mitophagy in the basolateral amygdala mediates increased anxiety induced by aversive social experience[J].Neuron，2021，109（23）：3793-3809.e8.

[5]張笑妍，李洋杰，王正東，等.氟中毒致神經損傷機制的研究進展[J].沈陽醫(yī)學院學報，2021，23（6）：617-621.

ZHANG XY，LI YJ，WANG ZD，et al.Advances in the mechanism of nerve injury induced by fluorosis[J].Journal of Shenyang Medical College，2021，23（6）：617-621.（in Chinese）

[6]LINDQVIST D，FERNSTR?M J，GRUDET C，et al.Increased plasma levels of circulating cell-free mitochondrial DNA in suicide attempters：associations with HPA-axis hyperactivity[J].Transl Psychiatry，2016，6（12）：e971.

[7]STRUNECKA A，STRUNECKY O.Chronic fluoride exposure and the risk of autism spectrum disorder[J].Int JEnviron Res Public Health，2019，16（18）：3431.

[8]WANG HW，ZHU SQ，LIU J，et al.Fluoride-induced renal dysfunction via respiratory chain complex abnormal expression and fusion elevation in mice[J].Chemosphere，2020，238：124607.

[9]LU YJ，LUO Q，CUI HM，et al.Sodium fluoride causes oxidative stress and apoptosis in the mouse liver[J].Aging，2017，9（6）：1623-1639.

[10]WANG JJ，WEI ZK，HAN Z，et al.Sodium fluoride exposure triggered the formation of neutrophil extracellular traps[J].Environ Pollut，2020，257：113583.

[11]YING HM，ZHANG Y.Systems biology of selenium and complex disease[J].Biol Trace Elem Res，2019，192（1）：38-50.

[12]鄭 瑞.硒代蛋氨酸對AD小鼠腦內神經再生的影響[D].深圳：深圳大學，2017.

ZHENG R.The effect of selenomethionine on neurogenesis in aAD mouse model[D].Shenzhen：Shenzhen University，2017.（in Chinese）

[13]ZHENG XR，SUN Y，KE LL，et al.Molecular mechanism of brain impairment caused by drinking-acquired fluorosis and selenium intervention[J].Environ Toxicol Pharmacol，2016，43：134-139.

[14]WANG YX，XIAO X，ZHAN XA.Antagonistic effects of different selenium sources on growth inhibition，oxidative damage，and apoptosis induced by fluorine in broilers[J].Poult Sci，2018，97（9）：3207-3217.

[15]WANG J，UM P，DICKERMAN BA，et al.Zinc，magnesium，selenium and depression：a review of the evidence，potential mechanisms and implications[J].Nutrients，2018，10（5）：584.

[16]LOEF M，SCHRAUZER GN，WALACH H.Selenium and Alzheimer’s disease：a systematic review[J].J Alzheimers Dis，2011，26（1）：81-104.

[17]ZHANG ZH，WU QY，CHEN C，et al.Selenomethionine attenuates the amyloid-β level by both inhibiting amyloid-β production and modulating autophagy in neuron-2a/AβPPswe cells[J].J Alzheimers Dis，2017，59（2）：591-602.

[18]ZHANG ZH，WU QY，ZHENG R，et al.Selenomethionine mitigates cognitive decline by targeting both Tau hyperphosphorylation and autophagic clearance in an Alzheimer’s disease mouse model[J].J Neurosci，2017，37（9）：2449-2462.

[19]BRüNING CA，SOUZA AC G，GAI BM，et al.Antidepressant-like effect of m-trifluoromethyl-diphenyl diselenide in the mouse forced swimming test involves opioid and serotonergic systems[J].Eur JPharmacol，2011，658（2-3）：145-149.

[20]CHEN C，CHEN Y，ZHANG ZH，et al.Selenomethionine improves mitochondrial function by upregulating mitochondrial selenoprotein in amodel of Alzheimer’s disease[J].Front Aging Neurosci，2021，13：750921.

[21]YANG JR，LI HJ，HAO ZJ，et al.Mitigation effects of selenium nanoparticles on depression-like behavior induced by fluoride in mice via the JAK2-STAT3pathway[J].ACS Appl Mater Interfaces，2022，14（3）：3685-700.

[22]MCPHERSON CA，ZHANG GZ，GILLIAM R，et al.An evaluation of neurotoxicity following fluoride exposure from gestational through adult ages in Long-Evans hooded rats[J].Neurotox Res，2018，34（4）：781-798.

[23]龔 藝，鄭 丹，陳芳萍，等.地方性氟中毒流行現狀與法醫(yī)學鑒定[J].中國司法鑒定，2022（2）：35-40.

GONG Y，ZHENG D，CHEN FP，et al.Epidemic status and forensic identification of endemic fluorosis[J].Chinese Journal of Forensic Sciences，2022（2）：35-40.（in Chinese）

[24]HE LL，TU CL，HE SY，et al.Fluorine enrichment of vegetables and soil around an abandoned aluminium plant and its risk to human health[J].Environ Geochem Health，2021，43（3）：1137-1154.

[25]SUN XL，REUTHER JF，PHILLIPS ST，et al.Coupling activity-based detection，target amplification，colorimetric and fluorometric signal amplification，for quantitative chemosensing of fluoride generated from nerve agents[J].Chem-A Eur J，2017，23（16）：3903-3909.

[26]BORTOLOZZI R，CARTA D，PRM D，et al.Evaluating the effects of fluorine on biological properties and metabolic stability of some antitubulin3-substituted7-phenyl-pyrroloquinolinones[J].Eur JMed Chem，2019，178：297-314.

[27]李禹韜.硒代蛋氨酸通過“微生物-腸-腦”軸緩解氨神經毒性機制的研究[D].哈爾濱：東北農業(yè)大學，2022.

LI YT.Study on selenomethionine alleviating the neurotoxicity of ammonia by modulating“microbiota-gut-brain”axis[D].Harbin：Northeast Agricultural University，2022.（in Chinese）

[28]RITA CARDOSO B，SILVA BANDEIRA V，JACOB-FILHO W，et al.Selenium status in elderly：relation to cognitive decline[J].J Trace Elem Med Biol，2014，28（4）：422-426.

[29]孫世光，韓興軍，王 群，等.高架﹢/瘙懟迷宮實驗：經典狀態(tài)焦慮動物模型相關性研究[J].中國藥理學通報，2018，34（3）：437-442.

SUN SG，HAN XJ，WANG Q，et al.Correlation between elevated plus and zero mazes as two animal models of state anxiety in Kunming mice[J].Chinese Pharmacological Bulletin，2018，34（3）：437-442.（in Chinese）

[30]BROD LM P，FRONZA MG，VARGAS JP，et al.Involvement of monoaminergic system in the antidepressant-like effect of（octylseleno）-xylofuranoside in the mouse tail suspension test[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2016，65：201-207.

[31]REDDY YP，TIWARI S，TOMAR LK，et al.Fluoride-induced expression of neuroinflammatory markers and neurophysiological regulation in the brain of wistar rat model[J].Biol Trace Elem Res，2021，199（7）：2621-2626.

[32]ZHENG R，ZHANG ZH，CHEN C，et al.Selenomethionine promoted hippocampal neurogenesis via the PI3K-Akt-GSK3β-Wnt pathway in amouse model of Alzheimer’s disease[J].Biochem Biophys Res Commun，2017，485（1）：6-15.

[33]LIU HL，HOU CC，ZENG Q，et al.Role of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in rat thyroid toxicity caused by excess fluoride and/or iodide[J].Environ Toxicol Pharmacol，2016，46：277-285.

[34]ABDELALEEM MM，EL-TAHAWY NF G，ABOZAID SM M，et al.Possible protective effect of curcumin on the thyroid gland changes induced by sodium fluoride in albino rats：light and electron microscopic study[J].Endocr Regul，2018，52（2）：59-68.

[35]凌錫賢.不同硒源對白羽肉雞生長性能、肉品質和抗氧化性能的影響[D].綿陽：西南科技大學，2023.

LING XX.Effects of different selenium sources on growth performance，meat quality and antioxidant capacity of white feather broilers[D].Mianyang：Southwest University of Science and Technology，2023.（in Chinese）

[36]BRENNEISEN P，STEINBRENNER H，SIES H.Selenium，oxidative stress，and health aspects[J].Mol Aspects Med，2005，26（4-5）：256-267.

[37]FILOMENI G，DE ZIO D，CECCONI F.Oxidative stress and autophagy：the clash between damage and metabolic needs[J].Cell Death Differ，2015，22（3）：377-388.

[38]HADJIADAMOU I，VLASIOU M，SPANOU S，et al.Synthesis of vitamin Eand aliphatic lipid vanadium（IV）and（V）complexes，and their cytotoxic properties[J].J Inorg Biochem，2020，208：111074.

[39]PARK EJ，LEE GH，YOON C，et al.Comparison of distribution and toxicity following repeated oral dosing of different vanadium oxide nanoparticles in mice[J].Environ Res，2016，150：154-165.

[40]FISCHER F，HAMANN A，OSIEWACZ HD.Mitochondrial quality control：an integrated network of pathways[J].Trends Biochem Sci，2012，37（7）：284-292.

[41]NARENDRA D，KANE LA，HAUSER DN，et al.P62/SQSTM1is required for Parkin-induced mitochondrial clustering but not mitophagy; VDAC1is dispensable for both[J].Autophagy，2010，6（8）：1090-1106.

[42]KIRKIN V，LAMARK T，JOHANSEN T，et al.NBR1co-operates with p62in selective autophagy of ubiquitinated targets[J].Autophagy，2009，5（5）：732-733.

[43]王香香，凌江紅，王煜姣，等.Pink1/Parkin信號通路調控線粒體自噬的研究進展[J].基因組學與應用生物學，2022，41（4）：919-926.

WANG XX，LING JH，WANG YJ，et al.Regulation of mitochondrial autophagy by Pink1/Parkin signaling pathway[J].Genomics and Applied Biology，2022，41（4）：919-926.（in Chinese）

[44]ADEBAYO M，SINGH S，SINGH AP，et al.Mitochondrial fusion and fission：the fine-tune balance for cellular homeostasis[J].FASEB J，2021，35（6）：e21620.

[45]SITA G，HRELIA P，GRAZIOSI A，et al.Back to the fusion：mitofusin-2in Alzheimer’s disease[J].J Clin Med，2020，9（1）：126.

[46]JI WK，HATCH AL，MERRILL RA，et al.Actin filaments target the oligomeric maturation of the dynamin GTPase Drp1to mitochondrial fission sites[J].eLife，2015，4：e11553.

[47]BAEK SH，PARK SJ，JEONG JI，et al.Inhibition of Drp1ameliorates synaptic depression，Aβ deposition，and cognitive impairment in an Alzheimer’s disease model[J].J Neurosci，2017，37（20）：5099-5110.

[48]MANCZAK M，KANDIMALLA R，FRY D，et al.Protective effects of reduced dynamin-related protein1against amyloid beta-induced mitochondrial dysfunction and synaptic damage in Alzheimer’s disease[J].Human Mol Genet，2016，25（23）：5148-5166.

（編輯 白永平）