五味子多糖納米硒的體外抗氧化和腸道菌群調(diào)節(jié)作用研究

摘 要：旨在探究五味子多糖納米硒（SCP-Selenium nanoparticles，SCP-SeNPs）的體外抗氧化活性和腸道菌群調(diào)節(jié)作用。本研究通過ABTS⁺、DPPH自由基、OH^-和O₂^-體外清除以及還原力檢測試驗系統(tǒng)評價了SCP-SeNPs的體外抗氧化活性；進(jìn)一步通過16S rRNA高通量測序技術(shù)探究其對小鼠腸道菌群的影響。結(jié)果顯示，SCP-SeNPs具有良好的體外抗氧化活性，且對OH^-和O₂^-的清除活性優(yōu)于五味子多糖（Schisandra Chinensis polysaccharide，SCP）。16S rRNA檢測結(jié)果顯示，SCP-SeNPs組小鼠盲腸菌群的α多樣性指數(shù)高于空白對照組（BC組）（Pgt;0.05）；β多樣性指數(shù)表明SCP-SeNPs組與BC組菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異。腸道菌群結(jié)構(gòu)分析顯示，擬桿菌門、厚壁菌門是小鼠腸道菌群的主要構(gòu)成。菌群結(jié)構(gòu)差異分析顯示，屬水平上，SCP-SeNPs組普雷沃氏菌屬、Muribaculum、杜波西氏菌屬、棲糞桿菌屬和梭菌屬_UCG_014等有益菌的相對豐度顯著增加（Plt;0.05）。PICRUSt2功能預(yù)測分析顯示，蛋白酶體、過氧化物酶體以及苯丙氨酸代謝和托烷、哌啶、吡啶生物堿的生物合成這4個通路在SCP-SeNPs組顯著富集（Plt;0.05）。綜上，SCP-SeNPs具有一定的抗氧化能力，可能通過提高腸道有益菌的豐度和調(diào)節(jié)腸道微生物的物質(zhì)代謝發(fā)揮腸道保護(hù)作用，提示SCP-SeNPs可以作為一種新型功能性微量元素添加劑。

關(guān)鍵詞：五味子多糖；納米硒；抗氧化；腸道菌群

中圖分類號：S816.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-3234-12

收稿日期：2023-09-26

基金項目：重慶市自然科學(xué)基金面上項目（CSTB2022NSCQ-MSX0470）；國家生豬技術(shù)創(chuàng)新中心先導(dǎo)科技項目（NCTIP-XD/B12）；重慶市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊項目（CQMAITS202312）

作者簡介：杜紅旭（1989-），男，河南新野人，講師，博士，主要從事中獸醫(yī)藥研究，E-mail：hongxudu@swu.edu.cn

*通信作者：杜紅旭，主要從事中獸醫(yī)藥研究，E-mail：hongxudu@swu.edu.cn

Study on the in vitro Antioxidant and Intestinal Flora Modulating Effects of

Schisandra Chinensis Polysaccharides-selenium Nanoparticles

DUHongxu^1，2*，SULijuan¹，HEZhengke¹，TANXiaoyan¹，ZHANGXu¹，MAQi^1，2，

CAOLiting^1，2，CHEN Hongwei¹，GANLing¹

（1.College of Veterinary Medicine，Southwest University，Chongqing402460，China;

2.Department of Traditional Chinese Veterinary Medicine，Southwest University，

Chongqing402460，China）

Abstract：The aim of this study was to explore the in vitro antioxidant property and intestinal microbiota modulation effect of Schisandra Chinensis polysaccharide-selenium nanoparticles（SCP-SeNPs）.The in vitro antioxidant property of SCP-SeNPs was evaluated using ABTS⁺，DPPH radicals，OH^-and O₂^-scavenging assays，and reducing power assays.Furthermore，the impact of SCP-SeNPs on the intestinal microbiota of mice was investigated using16S rRNA high-throughput sequencing technology.The results showed that，SCP-SeNPs exhibited significant in vitro antioxidant property，with better scavenging effects on OH^-and O₂^-radicals compared to SCP.The16S rRNA analysis indicated that the α-diversity index of cecal microbiota in the SCP-SeNPs group was higher than that of the Blank control（BC）group（Pgt;0.05）.The β-diversity index suggested notable differences in microbial composition between the SCP-SeNPs and BC groups.Intestinal microbiota structure analysis revealed that Bacteroidota and Firmicutes were the major constituents of the mouse intestinal microbiota.Differential analysis of microbial composition indicated that at the genus level，beneficial bacteria such as Prevotellaceae，Muribaculum，Dubosiella，and Faecalibaculum and Clostridia_UCG_014were significantly enriched in the SCP-SeNPs group（Plt;0.05）.PICRUSt2functional prediction analysis revealed that the pathways of Proteasome，Peroxisome，Phenylalanine metabolism，and biosynthesis of Tropane，piperidine，and pyridine alkaloids were significantly enriched in the SCP-SeNPs group（Plt;0.05）.In conclusion，SCP-SeNPs has certain antioxidant capacity and may have the potential to regulate intestinal microbiota composition and impact microbial metabolism through the enhancement of beneficial bacteria.These results suggest that SCP-SeNPs can serve as anovel functional trace element supplement.

Key words：Schisandra Chinensis polysaccharide; selenium nanoparticles; antioxidant; intestinal microbiota

*Corresponding author：DU Hongxu，E-mail：hongxudu@swu.edu.cn

氧化應(yīng)激是機體在體內(nèi)外不利因素刺激下，氧化與抗氧化穩(wěn)態(tài)失衡的表現(xiàn)^[1]。隨著集約化養(yǎng)殖模式的推廣，養(yǎng)殖效率得到提高的同時，也帶來了一些諸如空間束縛、飼料飲水限制、斷奶、轉(zhuǎn)籠和病原微生物感染等誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的因子^[2]。研究表明，氧化應(yīng)激不僅會影響生物體大分子的活性、組織和器官的功能，甚至?xí)档蛣游餀C體的生產(chǎn)性能和繁殖效率，已成為影響畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)的重要因素^[3-4]。因此，維持和改善機體氧化還原狀態(tài)，對提高動物經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

腸道菌群是由寄居在動物腸道內(nèi)的各種微生物構(gòu)成的群落^[5]，對機體血腦屏障^[6]、肝代謝^[7]、腸道屏障^[8]等多種重要生理功能的正常發(fā)揮起著關(guān)鍵作用。大量研究已證實，多種疾病病理過程中均伴隨有腸道菌群失衡，改善腸道菌群失衡則可以有效緩解動物機體病理損傷^[9]。同時，增加腸道菌群多樣性，提高有益菌豐度也被發(fā)現(xiàn)對提升動物抵抗力、降低動物發(fā)病率具有意義^[10]。

本課題組前期首次以SCP為軟模板，高效合成了穩(wěn)定的SCP-SeNPs，且體內(nèi)研究表明，SCP-SeNPs較SCP具有更強的生物活性，能更有效地維護(hù)腸道健康^[11]。但關(guān)于SCP-SeNPs的抗氧化活性及其對腸道菌群的影響仍不清楚。為了進(jìn)一步探究SCP-SeNPs的上述生物學(xué)功能，本研究擬通過體外抗氧化試驗和16S rRNA測序技術(shù)系統(tǒng)評價SCP-SeNPs的體外抗氧化活性和對小鼠腸道菌群的影響，以期為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

SCP與SCP-SeNPs由本實驗室前期制備^[11]。2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、硫酸亞鐵購自北京化工廠；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）購自北京華越洋生物公司；鐵氰化鉀購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯乙酸購自上海展云化工有限公司；三羥基甲基氨基甲烷購自北京索萊寶科技有限公司；鹽酸購自重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；鄰苯三酚購自萊陽化工試驗室；抗壞血酸購自上海實驗試劑有限公司；無水乙醇購自成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 SCP-SeNPs的體外抗氧化活性

將SCP與SCP-SeNPs用無菌水配置成質(zhì)量濃度為200、250、300、350、400μg·mL^-1的供試品溶液備用。

1.2.1 ABTS自由基清除能力測定

以10、20、30、40、50mg·mL^-1的VC溶液為陽性對照。分別取10μL不同濃度樣品到96孔板中，加入190μLABTS工作液充分混勻，5min后用多功能酶標(biāo)儀測定734nm處吸光度，同時以蒸餾水作空白對照，按以下公式計算ABTS^＋清除率：

S=A_x-A_yA_x×100%

式中S表示ABTS^＋清除率（%）；A_x表示空白組的吸光度；A_y表示樣品的吸光度。

1.2.2 DPPH自由基清除能力測定

以20、40、60、80、100μg·mL^-1的VC溶液為陽性對照。取1 mL100mmol·L^-1醋酸鈉緩沖液（pH5.5）、1.8mL乙醇和0.1mL DPPH（7.8mg·mL^-1無水乙醇溶液）溶液于EP管中充分混勻后，分別加入0.1mL不同濃度梯度的SCP、SCP-SeNPs與VC溶液，室溫黑暗環(huán)境靜置30min，于517nm波長處測定吸光度，以蒸餾水為空白對照。同時以無水乙醇代替DPPH溶液，設(shè)置SCP、SCP-SeNPs與VC的本底對照，其他條件保持不變，操作方法同上，按照以下公式計算DPPH自由基清除率：

S=A_z-A_yA_x×100%

式中S表示DPPH自由基清除率（%）；A_x表示空白組的吸光度；A_z表示本底組的吸光度；A_y表示樣品的吸光度。

1.2.3 羥基自由基（OH^-）清除能力測定

以25、50、100、200、400μg·mL^-1的VC溶液為陽性對照。分別取不同濃度梯度的SCP、SCP-SeNPs與VC溶液1mL于10mL試管中，依次加入1mL硫酸亞鐵（9mmol·L^-1）、1mL水楊酸-乙醇溶液（9mmol·L^-1）和1mL過氧化氫溶液（8.8mmol·L^-1）。充分混勻后放入37℃孵育30min，冷卻后測定510nm處吸光度，以蒸餾水做空白對照。同時以無水乙醇代替水楊酸-乙醇溶液，設(shè)置SCP、SCP-SeNPs與VC的本底對照，其他條件保持不變，操作方法同上，按照以下公式計算OH^-清除率：

S=[Ax-（A_y-A_z）]A_x×100%

式中S表示OH^-清除率（%）；A_x表示蒸餾水替代樣本的吸光度；A_y表示加入樣品反應(yīng)后的吸光度；A_z表示用無水乙醇代替水楊酸-乙醇溶液，加入樣品反應(yīng)后的吸光度。

1.2.4 還原力測定

以20、40、60、80、100μg·mL^-1的VC溶液為陽性對照。取2mL不同濃度的SCP、SCP-SeNPs與VC溶液于試管中，加入2mL1%（W/V）鐵氰化鉀溶液和2mL磷酸緩沖液（0.2mol·L^－1，pH6.6）充分混勻，50℃恒溫振蕩孵育20min后加入2mL10%（W/V）三氯乙酸溶液混勻，5000r·min^-1離心10min。取2mL上清液加入2mL蒸餾水和0.4mL0.1%（W/V）氯化鐵溶液混勻，50 ℃恒溫振蕩10min，測定其在700nm處吸光度，以蒸餾水做空白對照，按照以下公式計算還原力：

S=A_x-A_yA_x×100%

式中S表示還原力；A_x表示空白組的吸光度；A_y表示SCP、SCP-SeNPs與VC樣品的吸光度。

1.2.5 超氧陰離子自由基（O₂^-）清除能力測定

以20、40、60、80、100μg·mL^-1的VC溶液為陽性對照。取4.5mL50mmol·L^-1的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液（Tris-HCl，pH8.2）與3.2mL蒸餾水充分混勻，25℃水浴10min后分別加入1mL不同濃度梯度的SCP、SCP-SeNPs與VC溶液，再加入0.3mL50mmol·L^-1的鄰苯三酚溶液，迅速混勻于325nm處每30s測一次吸光度，2min后，以吸光度為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)作圖，計算斜率K_b。同時以等體積蒸餾水代替樣品作為空白對照，按照以下公式計算O₂^-清除能力：

S=1-K_bK₀×100%

式中S是O₂^-清除率；K_b表示SCP與SCP-SeNPs樣品反應(yīng)時吸光度隨時間變化的斜率；K₀表示空白組的吸光度隨時間變化的斜率。

1.3 試驗動物分組與處理

將21只體重18～22 g的SPF雄性KM小鼠（購自西南醫(yī)科大學(xué)）經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后隨機分為3組：空白對照組（BC）、五味子多糖組（SCP）和五味子多糖-納米硒組（SCP-SeNPs）。SCP組與SCP-SeNPs組均按照10mg·kg^-1分別灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，持續(xù)14d，BC組給予等體積無菌水灌胃，期間記錄小鼠體重。本動物試驗根據(jù)西南大學(xué)實驗動物福利倫理委員會批準(zhǔn)指南進(jìn)行（倫理編號：IACUC-20210915-03）。

1.4 SCP-SeNPs對小鼠生長性能的影響

1.4.1 SCP-SeNPs對小鼠體重增長的影響

正式試驗開始后每日對小鼠進(jìn)行空腹稱重，按照以下公式計算平均日增重（average daily gain，ADG）。

平均日增重（g·d^－1）=末重（g）-初始重量（g）天數(shù)（d）

1.4.2 SCP-SeNPs對小鼠臟器指數(shù)的影響

第14天對小鼠進(jìn)行末次稱重后麻醉處死，迅速采集其肝、脾稱重，按照以下公式計算各臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)（%）=器官重量（g）體重（g）×100%

1.5 糞便16S rRNA測序

在給藥14d后，采集各組小鼠糞便，提取DNA、擴增16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)，進(jìn)行Illumina MiSeq測序。為了確保操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）以及后續(xù)α多樣性和β多樣性分析的準(zhǔn)確性，使用Trimmomatic（v0.36）、Pear（v0.9.6）、Flash（v1.20）和Vsearch（v2.7.1）軟件對下機原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、拼接、篩除和降噪處理。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)通過SPSS20.0軟件做單因素方差分析（One-Way ANOVA），結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）”的形式表示，Plt;0.05為差異顯著，Pgt;0.05為差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 SCP-SeNPs的體外抗氧化活性

2.1.1 ABTS自由基清除能力

由圖1可知，隨著濃度的升高，陽性對照VC的ABTS^＋清除能力也隨之升高，而SCP與SCP-SeNPs的ABTS^＋清除率則維持在相對較低水平，且二者之間差異不明顯。

2.1.2 DPPH自由基清除能力

由圖2可知，隨著藥物濃度增加，SCP的DPPH自由基清除能力隨之上升，而SCP-SeNPs的DPPH自由基清除能力卻基本沒有變化。當(dāng)SCP濃度為400μg·mL^-1時，其DPPH自由基清除率達(dá)到了68.89%，而同濃度的SCP-SeNPs只有23.98%。

2.1.3 羥基自由基清除能力

由圖3可以看出，隨著藥物濃度的升高，VC的OH^-清除能力不斷增加。當(dāng)藥物濃度處于低濃度（25～200μg·mL^-1）時，SCP-SeNPs的OH^-清除能力始終略高于SCP。但隨著濃度的增加，SCP-SeNPs的OH^-清除能力逐漸上升，當(dāng)藥物濃度達(dá)到400μg·mL^-1時，SCP-SeNPs顯示出比SCP更強的OH^-清除能力，達(dá)到28.43%，而SCP仍維持在較低的水平。

2.1.4 還原力

由圖4可知，隨藥物濃度的升高，SCP與SCP-SeNPs的還原能力也隨之升高，但兩者之間差異不明顯。當(dāng)藥物濃度低于300μg·mL^-1時，SCP-SeNPs的還原力略高于SCP；當(dāng)藥物濃度高于300μg·mL^-1時，SCP的還原力略高于SCP-SeNPs。

2.1.5 超氧陰離子自由基清除能力

由圖5可知，當(dāng)SCP與SCP-SeNPs濃度范圍在200～400μg·mL^-1時，其O₂^-清除率均隨藥物濃度升高而升高。但在相同濃度下，SCP-SeNPs的O₂^-清除能力始終強于SCP，尤其是當(dāng)藥物濃度為400μg·mL^-1時，SCP-SeNPs的O₂^-清除率高出SCP一倍，達(dá)到47.82%。

2.2 SCP-SeNPs對小鼠生長性能的影響

如表1所示，經(jīng)過14d不同藥物處理后，SCP組和SCP-SeNPs組的末重及平均日增重均有所增長，但與BC組相比差異不顯著（Pgt;0.05）。臟器指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BC組、SCP-SeNPs組與SCP組小鼠的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均處于同一水平，沒有顯著性差異（Pgt;0.05）（圖6）。

2.3 SCP-SeNPs對小鼠腸道菌群的影響

2.3.1 OTU聚類分析

基于優(yōu)化后的clean tags進(jìn)行OTU聚類分析結(jié)果如圖7所示，BC組、SCP組以及SCP-SeNPs組共有1746個OTUs，相比于BC組特有的384個OTUs，SCP有565個特有OTUs，SCP-SeNPs有212個獨特OTUs。

2.3.2 SCP-SeNPs對小鼠腸道菌群α多樣性的影響

稀釋性曲線與Shannon-Wiener曲線主要反映樣本中微生物測序深度與多樣性。隨著隨機抽取測序數(shù)量的增加，新發(fā)現(xiàn)的OTU數(shù)目越多，稀釋性曲線也隨之上升，而后趨于平緩，說明本次測序數(shù)據(jù)量合理（圖8A）。Shannon-Wiener曲線（圖8B）不斷升高后趨于平坦，同樣可以說明本次測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以充分反映菌群的多樣性。

α多樣性指數(shù)反映了微生物群落的豐富度和多樣性。Chao1指數(shù)、observed-species指數(shù)與PD-whole-tree指數(shù)是反映微生物豐富度的指數(shù)，Shannon指數(shù)與simpson指數(shù)主要反映微生物多樣性，指數(shù)越大，說明OTU數(shù)目越多，樣本物種數(shù)越多，多樣性也越高。與BC組相比，SCP組和SCP-SeNPs組的Chao1指數(shù)（圖9A）、PD-whole-tree指數(shù)（圖9B）和simpson指數(shù)（圖9E）均有一定程度升高，但差異不顯著（Pgt;0.05）；對于observed-species指數(shù)（圖9C）和Shannon指數(shù)（圖9D）而言，SCP組顯著升高（Plt;0.05），SCP-SeNPs組也有一定程度升高，但差異不顯著（Pgt;0.05）。綜上所述，SCP和SCP-SeNPs處理均可以一定程度上提高小鼠腸道菌群的豐富度和多樣性。

2.3.3 SCP-SeNPs對小鼠腸道菌群β多樣性的影響

β多樣性分析主要用于反映不同樣本間腸道菌群組成的相似性。主坐標(biāo)分析（Principal co-ordinates analysis，PCoA）反映樣本群落組成的相似性或差異性，圖10A顯示，在PC2縱坐標(biāo)維度，SCP-SeNPs組與BC組和SCP組距離較遠(yuǎn)，表明SCP-SeNPs組與其他組群落組成存在差異，而SCP組和BC組之間差異較小。圖10B偏最小二乘法判別分析（Partial Least Squares Discrimination Analysis，PLS-DA）分析同樣顯示，同一組別的不同樣本距離較近，聚集在一起，不同組別明顯分布在PC1和PC2組成的二維平面圖的不同區(qū)域，表明SCP和SCP-SeNPs組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與BC組腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變（圖11）。

2.3.4 SCP-SeNPs對小鼠腸道菌群物種組成及相對豐度的影響

為進(jìn)一步明確各組之間的物種組成及豐度差異，通過從不同水平量化各組腸道微生物群的相對豐度，結(jié)果見圖11。在門水平上，擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）是各組小鼠腸道菌群的主要構(gòu)成（圖11A）。與BC組相比，SCP組與SCP-SeNPs組中擬桿菌相對豐度增加，占比從39.58%（BC組）增加到55.7%（SCP組）和55.8%（SCP-SeNPs組）；而厚壁桿菌相對豐度有所下降，占比從55.33%（BC組）下降到39.6%（SCP組）和39.73%（SCP-SeNPs組），但差異均不顯著（Pgt;0.05）（圖11B）。在屬水平上，展示了不同組別中相對豐度前20的物種信息（圖11C），與BC組相比，在SCP-SeNPs組中顯著增加的菌有5種，分別是：擬普雷沃氏菌屬（Alloprevotella）、杜波西氏菌屬（Dubosiella）、Muribaculum、棲糞桿菌屬（Faecalibaculum）、梭菌屬_UCG_014（Clostridia_UCG_014）（圖11D）。其中，SCP-SeNPs組擬普雷沃氏菌屬的豐度顯著增加（Plt;0.05），達(dá)到5.58%，同時明顯高于SCP組的1.1%。杜波西氏菌屬從1.21%（BC組）增加到3.96%（SCP-SeNPs組）；Muribaculum豐度從0.69%（BC組）增加到2.2%（SCP-SeNPs組）。棲糞桿菌屬豐度從0.07%（BC組）增加到2.2%（SCP-SeNPs組）。梭菌屬_UCG_014豐度從0.52%（BC組）增加到1.66%（SCP-SeNPs組）。

2.3.5 LefSe組間差異分析

為了鑒定各組間腸道微生物群的特定細(xì)菌類群，設(shè)定線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）閾值為3，利用線性判別分析效應(yīng)大?。╨inear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析各試驗組小鼠腸道菌群中所有分類水平的差異情況。由圖12A-B可知，SCP-SeNPs組在不同分類水平上出現(xiàn)了較多的優(yōu)勢菌群。在目水平上，丹毒菌目（Erysipelotrichales）、梭菌目_UCG_014（Clostridia_UCG_014）、雙歧桿菌目（Bifidobacteriales）在SCP-SeNPs組的相對豐度更高；在科水平上，丹毒菌科（Erysipelotrichales）、梭菌科_UCG_014（Clostridia_UCG_014）、雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）在SCP-SeNPs組的相對豐度更高；在屬水平上，棲糞桿菌屬（Faecalibaculum）、普雷沃氏菌屬NK3B31（Prevotellaceae_NK3B31_group）、Muribaculum、普雷沃氏菌屬UGG_001（Prevotellaceae_UGG_001）、梭菌屬_UCG_014（Clostridia_UCG_014）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）在SCP-SeNPs組的相對豐度更高；在種水平上，假長雙歧桿菌（Bifidobacterium_pseudolongum）在SCP-SeNPs組的相對豐度更高，而擬桿菌（Bacteroides_caecimuris）在BC組相對豐度更高。

2.3.6 Network及PICRUSt2功能預(yù)測分析

為了明確三組樣本中菌群之間的相關(guān)性以及功能的差異性，通過spearman檢驗，選取所有樣本屬水平絕對豐度前30的結(jié)果進(jìn)行Network相互關(guān)聯(lián)性分析，并通過PICRUSt2功能預(yù)測對代表性序列KEGG三級通路進(jìn)行功能預(yù)測。由圖13A可以發(fā)現(xiàn)，杜波西氏菌屬與Muribaculum、梭菌屬_UCG_014、棲糞桿菌屬成正相關(guān)，而與文肯菌屬（Rikenella）成負(fù)相關(guān)。脫硫弧菌（Desulfovibrio）與嗜木糖真桿菌屬（Eubacterium_xylanophilum_group）成正相關(guān)。擬普雷沃氏菌屬（Alloprevotella）與普雷沃氏菌屬UCG_001、普雷沃氏菌屬NK3B31成正相關(guān)，而與支原體屬（Mycoplasma）、毛螺菌屬_UCG_006（Lachnospiraceae_UGG_006）、毛螺菌屬_NK4A136（Lachnospiraceae_NK4A136_group）及腸桿菌屬（Enterorhabdus）成負(fù)相關(guān)。Candidatus_saccharimonas屬與梭菌屬_UGG_014、杜波西氏菌屬成正相關(guān)；與嗜木糖真桿菌屬成負(fù)相關(guān)。雙歧桿菌屬與杜波西氏菌屬、Muribaculum、梭菌屬_UCG_014、棲糞桿菌屬成正相關(guān)。幽門螺菌屬（Helicobacter）與擬桿菌門中紫單胞菌屬（Odoribacter）成正相關(guān)。圖13B顯示，BC組與SCP-SeNPs組存在顯著差異的功能通路共有5個（Plt;0.05），其中致病性大腸桿菌感染（Pathogenic Escherichia coli infections）在BC組顯著富集（Plt;0.05）；而蛋白酶體（Proteasome）、過氧化物酶體（Peroxisome）以及苯丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism）和托烷、哌啶、吡啶生物堿的生物合成（Tropane，piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis）主要富集在SCP-SeNPs組（Plt;0.05）。

3 討 論

自由基是一類具有未成對電子的原子、原子團(tuán)或者分子的極度活潑物質(zhì)，適量的自由基對機體多種生理活動的調(diào)節(jié)起著重要作用。但大量研究也發(fā)現(xiàn)，過量自由基的生成與疾病的發(fā)生密切相關(guān)，因此清除過量的自由基對機體健康具有重要意義^[12]。體外自由基清除試驗是一種通過體外化學(xué)試驗?zāi)M化合物對自由基直接清除作用的試驗方法，因具有重復(fù)性好、方法可靠等優(yōu)點在氧化應(yīng)激生物學(xué)研究中得到廣泛使用。本研究選用了最經(jīng)典的幾類自由基清除試驗（ABTS^＋、DPPH、OH^-、O₂^-和還原力測試）作為代表系統(tǒng)評價了SCP-SeNPs的體外自由基清除活性。總體上，SCP-SeNPs在上述試驗中均表現(xiàn)出了良好的抗氧化作用。尤其是對于OH^-和O₂^-，SCP-SeNPs顯示出比SCP更強的OH^-、O₂^-清除能力，并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，這可能與SCP-SeNPs具有高度活性的表面，以及其表面上的未飽和鍵和不飽和位點使其能夠與這些自由基物質(zhì)高效發(fā)生反應(yīng)有關(guān)。而對于ABTS^＋和還原力而言，在相同濃度下，SCP-SeNPs與SCP對ABTS^＋清除能力和還原力沒有明顯差異，這表明硒納米粒的引入并沒有改善SCP對ABTS^＋的清除效力和還原力。在DPPH自由基清除試驗中，SCP-SeNPs對DPPH自由基的清除能力卻不如SCP，這可能是由于反應(yīng)體系中乙醇的引入導(dǎo)致SCP-SeNPs大量團(tuán)聚析出而降低了其反應(yīng)活性。

在動物試驗中，SCP-SeNPs的添加能夠在一定程度上提高小鼠體重，增加其平均日增重，但變化不顯著（Pgt;0.05）。臟器指數(shù)在一定程度上能夠間接反映機體的器官功能和生理狀態(tài)，肝臟指數(shù)的增加往往與肝病理損傷密切相關(guān)，而脾臟指數(shù)上升則可以反映機體免疫功能的增強^[13]。在本研究中，SCP-SeNPs組和SCP組小鼠的肝臟指數(shù)并沒有明顯變化，而脾臟指數(shù)略有升高，但差異不顯著（Pgt;0.05），說明SCP和SCP-SeNPs對小鼠肝功能并未造成明顯影響，但可能對小鼠機體免疫功能有一定的促進(jìn)作用。

腸道微生物在調(diào)節(jié)宿主營養(yǎng)吸收、免疫調(diào)控和能量代謝等方面發(fā)揮著重要生理功能。腸道微生物與宿主之間以及腸道內(nèi)菌群與菌群之間的相互平衡，構(gòu)成了復(fù)雜多變的腸道微生物系統(tǒng)，該系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的變化對機體腸道和整體健康都起著重要作用?，F(xiàn)有的研究已證明，無機硒和有機硒在調(diào)節(jié)動物腸道菌群方面發(fā)揮了重要作用，但關(guān)于SCP-SeNPs對動物腸道微生態(tài)系統(tǒng)的影響的研究還缺乏報道。因此，本研究通過16S rRNA測序技術(shù)系統(tǒng)探究了SCP-SeNPs對小鼠腸道菌群的多樣性與豐富度的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，SCP-SeNPs對健康小鼠腸道菌群造成了明顯影響，提高了菌群豐度和多樣性。在門水平上，擬桿菌與厚壁桿菌是主要的兩個門。擬桿菌與機體各種代謝活動、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，并且可以促進(jìn)短鏈脂肪酸（Short Chain Fatty Acids，SCFAs）的產(chǎn)生，維持腸道正常功能^[14]。本研究結(jié)果顯示，SCP-SeNPs組小鼠擬桿菌比例增加，厚壁桿菌減少，提示SCP-SeNPs對腸道健康可能具有有益作用。在屬水平上，擬普雷沃氏菌屬^[15]、Muribaculum^[16]均有助于SCFAs的產(chǎn)生，而梭菌屬_UCG_014^[17-18]不僅可以產(chǎn)生SCFAs，同時也可以促進(jìn)色氨酸代謝物的生成來改善腸上皮屏障功能障礙并減輕炎癥反應(yīng)。另外，有研究還發(fā)現(xiàn)，杜波西氏菌具有顯著抗炎作用，是治療小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的潛在有益菌^[18]。本研究中，SCP-SeNPs組中擬普雷沃氏菌屬、杜波西氏菌屬、Muribaculum、棲糞桿菌屬和梭菌屬_UCG_014豐度均顯著升高（Plt;0.05），說明SCP-SeNPs可以增加腸道中有益菌的豐度，對保持腸道健康具有有益作用^[19]。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，杜波西氏菌屬與Muribaculum、梭菌屬_UCG_014、棲糞桿菌屬成正相關(guān)關(guān)系，而擬普雷沃氏菌屬與支原體屬、腸桿菌屬等有害菌成負(fù)相關(guān)關(guān)系。SCP-SeNPs組擬普雷沃氏菌屬豐度在SCP-SeNPs組顯著上升（Plt;0.05），由此推測SCP-SeNPs可以通過增加小鼠腸道有益菌的豐度，從而降低支原體屬、腸桿菌屬等有害菌的豐度實現(xiàn)小鼠腸道的保護(hù)作用。PICRUSt2功能預(yù)測分析是一個基因家族的預(yù)測模型，通過將已知的微生物基因組數(shù)據(jù)與16S rRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，從而推斷出微生物群落的功能潛力。KEGG三級通路功能預(yù)測結(jié)果顯示，蛋白酶體、過氧化物酶體以及苯丙氨酸代謝、托烷哌啶和吡啶生物堿的生物合成這4個通路顯著富集在SCP-SeNPs組。蛋白酶體是細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)降解蛋白質(zhì)的復(fù)合體，發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解和廢棄物清除的作用，對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要意義^[20]。腸道黏膜細(xì)胞的生命周期較短，因此對于蛋白質(zhì)降解和廢物清除的需求很高，SCP-SeNPs組中顯著富集蛋白酶體通路可能暗示SCP-SeNPs組微生物對細(xì)胞中廢棄物清除具有重要意義，有助于保持腸道黏膜屏障的完整性和正常功能，維護(hù)腸道健康。過氧化物酶體是重要的代謝細(xì)胞器，涉及氧化代謝和抗氧化保護(hù)，在脂質(zhì)、活性離子以及免疫代謝中顯示出重要作用^[21-22]。在SCP-SeNPs組中顯著富集過氧化物酶體通路可能暗示這些微生物可能在維持腸道黏膜屏障所需的氧化還原平衡方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。苯丙氨酸是一種氨基酸，參與多種生物化學(xué)途徑，對減輕炎癥，維持機體健康意義重大^[23-24]。富集苯丙氨酸代謝可能表明在SCP-SeNPs組中，這些微生物可能更活躍地參與這一氨基酸的代謝過程，緩解機體炎癥反應(yīng)。生物堿在腸道健康中具有抗炎、抗氧化、抗菌等作用^[25-27]。托烷、哌啶、吡啶生物堿的生物合成途徑富集在SCP-SeNPs組中，提示這些微生物對腸道炎性損傷、氧化損傷和抵御病原微生物入侵具有重要意義。綜上所述，SCP-SeNPs可能是通過調(diào)控腸道微生物介導(dǎo)的物質(zhì)代謝發(fā)揮腸道保護(hù)作用。

4 結(jié) 論

綜上，SCP-SeNPs具有一定的抗氧化活性，且對OH^-、O₂^-的清除能力強于SCP。SCP-SeNPs可以增加腸道菌群的多樣性和豐富度，提高擬桿菌門、普雷沃氏菌屬、Muribaculum、杜波西氏菌屬、棲糞桿菌屬和梭菌屬_UCG_014等有益菌的豐度，并可能通過蛋白酶體、過氧化物酶體以及苯丙氨酸代謝和托烷、哌啶、吡啶生物堿的生物合成途徑調(diào)節(jié)腸道微生物的物質(zhì)代謝發(fā)揮腸道保護(hù)作用。

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（編輯 范子娟）