共表達(dá)膜結(jié)合型與可溶性H9N2亞型禽流感病毒HA蛋白的重組基因Ⅶ型新城疫病毒的構(gòu)建及免疫效果評(píng)價(jià)

摘 要： 旨在構(gòu)建能高效穩(wěn)定表達(dá)H9N2 AIV的HA蛋白的重組基因Ⅶ型新城疫病毒，有望開發(fā)抗新城疫和H9N2亞型禽流感病毒的二聯(lián)疫苗，為控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路，對(duì)NDV疫苗載體的構(gòu)建和優(yōu)化有重要的參考意義。利用反向遺傳技術(shù)，以rDHN3-mF為骨架，在病毒基因組的P和M之間的非編碼區(qū)插入全長(zhǎng)膜結(jié)合HA和另外一個(gè)帶有截短跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶性HA蛋白，獲得了能高效穩(wěn)定表達(dá)H9N2 AIV的HA蛋白的基因Ⅶ型NDV減毒株重組病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA。通過雞胚接種、Western blot、血凝效價(jià)（HA）及平均雞胚致死時(shí)間（MDT）等試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)重組病毒的穩(wěn)定性以及生物學(xué)特性，將重組病毒以106 EID50·只-1劑量免疫7日齡SPF雞并測(cè)定血凝抑制（HI）抗體，在免疫后28 d對(duì)各組進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。結(jié)果顯示：重組病毒在雞胚中連續(xù)傳至十五代后HA基因無(wú)突變發(fā)生；Western blot證明重組病毒可穩(wěn)定高效地表達(dá)特異性的HA蛋白；重組病毒的生長(zhǎng)曲線說(shuō)明了重組病毒與親本毒株具有相似的復(fù)制特性和低毒力特征；重組病毒免疫組的SPF雞均能產(chǎn)生針對(duì)NDV或者H9N2 AIV的特異性HI抗體；攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果：重組病毒均能對(duì)攻毒后的雞產(chǎn)生100%保護(hù)效果；喉、肛拭子檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明重組病毒可顯著減少NDV與H9N2 AIV的體外排毒；氣管與肺qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示攻毒后3 d，rDHN3mF-2HA較rDHN3mF-HA更顯著地降低了臟器中H9N2 AIV含量。本研究成功構(gòu)建了共表達(dá)膜結(jié)合型與可溶性H9N2亞型禽流感HA蛋白的基因Ⅶ型重組NDV，為H9N2 AIV和NDV的一種新型重組基因工程二聯(lián)活載體疫苗的研制與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： H9N2亞型禽流感病毒；HA蛋白；新城疫病毒；免疫原性；載體疫苗；免疫保護(hù)效率

中圖分類號(hào)：S858.315.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號(hào)：0366-6964（2024）05-2123-12

收稿日期：2023-08-10

基金項(xiàng)目：廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目，雞傳染性支氣管炎和禽流感病毒樣顆粒疫苗的研制及應(yīng)用（2021B0707010009）

作者簡(jiǎn)介：呂亞迪（1998-），女，河南商水人，碩士生，主要從事畜禽疫病防控研究，E-mail： 15716327913@163.com；Tel：0758-3626781

*通信作者：陳瑞愛，主要從事動(dòng)物疾病防控科研等，E-mail： chensa727@vip.126.com

Construction and Evaluation of the Immune Effect of Recombinant Genotype Ⅶ NDV

Strain Co-expressing Membrane-bound and Water-soluble HA Protein of Avian Influenza Virus H9N2

L Yadi1，2， YANG" Jie1，2， XIE" Wenting1，2， XU" Ting1，2， CHEN" Ruiai1，2，3，4*

（1.College of Veternary Medicine， South China Agricultural University，

Guangzhou 510642，" China; 2.Zhaoqing Branch Center of Guangdong Laboratory for

Lingnan modern Agricultural Science and Technology Co.，Ltd， Zhaoqing 526238，" China;

3.Zhaoqing Institute of Biological Medicine Co.， Ltd， Zhaoqing 526238，" China;

4.Zhaoqing Dahuanong Biological Medicine Co.，Ltd， Zhaoqing 526238，" China）

Abstract： The purpose of this study was to construct a recombinant genotype Ⅶ Newcastle disease virus （NDV） that can efficiently and stably express H9N2 subtype avian influenza virus （AIV） HA protein. It is expected to develop a bivalent vaccine against NDV and H9N2 AIV to provide a new defense idea for the control of H9N2 AIV and NDV， and has important reference significance for the construction and optimization of NDV vaccine vector. A reverse genetic technique was used to insert the full-length membrane-bound HA and another soluble HA protein with truncated transmembrane domain gene into the non-coding region between the P and M genes of NDV using the genotype Ⅶ NDV-weakening strain rDHN3-mF as the backbone. The recombinant virus rDHN3mF-HA and rDHN3mF-2HA of gene type VII NDV attenuated virus which can express HA protein stably and efficiently was obtained. The stability and biological characteristics of recombinant virus were detected by chicken embryo inoculation， Western blot， HA， MDT and other experiments. Recombinant virus was immunized with 7 d SPF chickens and serum HI assay were measured. And the group was subjected to challenge protection experiments 28 d after immunization. The recombinant viruses were passed through fifteen generations in chicken embryos without mutations.Western blot results demonstrated that recombinant viruses can express specific HA proteins stably and efficiently; The growth curves illustrates the recombinant viruses have similar replication and low virulence characteristics to parental strains; Groups of SPF chickens immunized with recombinant virus produce specific HI antibodies against NDV or H9N2 AIV.The challenge protection test showed that the recombinant viruses can produce 100% protection against chickens after challenge， and the results of throat and swab detection indicate that recombinant virus can significantly reduce the amount of NDV and H9N2 AIV shedding. The results of tracheal and lung qPCR showed that rDHN3mF-2HA significantly reduced the shedding of H9N2 AIV in organs than rDHN3mF-HA 3 dpc. The results indicated that the recombinant NDV of genotype Ⅶ coexpressing membrane-bound and soluble H9N2 subtype avian influenza HA protein was successfully constructed， which laid a foundation for the development and application of a new type of recombinant genetic engineering live vector vaccine to prevent H9N2 AIV and NDV.

Key words： H9N2 subtype avian influenza; HA protein; Newcastle disease virus; immunogenicity; vector vaccines; immunoprotective efficacy

*Corresponding author：" CHEN Ruiai， E-mail： chensa727@vip.126.com

H9N2亞型禽流感病毒（avian influenza virus， AIV）于1966年首次從美國(guó)的火雞中分離出來(lái)［1］，現(xiàn)已在全球家禽中廣泛存在，并成為中國(guó)雞鴨群優(yōu)勢(shì)AIV亞型，給家禽生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2-3］。雖然H9N2 AIV是低致病性禽流感病毒，但與其他病原體混合感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床疾病和高死亡率［4-5］。此外，H9N2 AIV為新發(fā)的對(duì)人類致命的H5N1、H7N9、H10N8和H5N6重組病毒提供了部分甚至全部的內(nèi)部基因，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全［6］。2014—2016年中國(guó)部分省份禽類從業(yè)人員調(diào)查顯示H9N2血清抗體陽(yáng)性率達(dá)11.20%［7］，因此，無(wú)論是對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，還是對(duì)人類健康，控制H9N2病毒在禽類中的傳播都至關(guān)重要。

1998年，中國(guó)首次發(fā)布了雞H9N2滅活疫苗［8］，此后，用滅活疫苗免疫一直是預(yù)防雞H9N2的主要方法［9-10］。滅活疫苗雖然能誘導(dǎo)體液免疫，但細(xì)胞免疫反應(yīng)弱，只能提供有限的免疫原性［11］，盡管在流行地區(qū)大量使用了H9N2滅活疫苗，但由H9N2病毒引起的疫情仍未得到有效控制。目前使用的H9N2滅活疫苗還存在生產(chǎn)成本高、給藥費(fèi)力、免疫期短和不同譜系間缺乏交叉保護(hù)等缺點(diǎn)，因此，有必要開發(fā)一種有效的疫苗，能夠克服傳統(tǒng)滅活疫苗的一些缺點(diǎn)，并對(duì)不同譜系的H9N2病毒提供交叉保護(hù)。與滅活疫苗相比，以載體為基礎(chǔ)的活疫苗通常能提供體液、細(xì)胞和黏膜免疫［12-14］，而且病毒載體疫苗可促進(jìn)免疫程序，達(dá)到“一次免疫，多重保護(hù)”的目的。研究表明，表達(dá)H9N2病毒HA蛋白的載體疫苗是滅活疫苗的理想替代品［15］，禽痘病毒、新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV）、腺病毒、馬立克病病毒、火雞皰疹病毒等病毒載體常用于構(gòu)建禽重組病毒活疫苗［16-20］。

NDV是一種不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科新城疫樣病毒屬（Avulavirus）的禽副黏病毒Ⅰ型（APMV-1）。NDV編碼六種結(jié)構(gòu)蛋白，即核蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合糖蛋白（F）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN）和大聚合酶蛋白（L）［21］。反向遺傳技術(shù)的出現(xiàn)使NDV可以用作動(dòng)物和人類疫病的載體疫苗，尤其是針對(duì)流感病毒的疫苗［22］，表達(dá)HA蛋白的NDV載體疫苗可通過飲用水接種，誘導(dǎo)黏膜抗體和細(xì)胞免疫，可保護(hù)家禽免受AIV感染［23］。分子流行病學(xué)研究表明，基因Ⅶ型NDV是中國(guó)等亞洲國(guó)家流行的主要病毒，而目前普遍采用的基因Ⅱ型NDV疫苗株LaSota作為載體并不能產(chǎn)生有效的保護(hù)［24］。因此，本研究利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的一株能有效對(duì)抗基因Ⅶ型流行毒株的減毒株rDHN3-mF作為載體［25］，在rDHN3-mF病毒基因組的P基因和M基因之間的非編碼區(qū)表達(dá)全長(zhǎng)膜結(jié)合型HA和另外一個(gè)帶有截短跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶性HA蛋白，獲得能高效穩(wěn)定表達(dá)H9N2 AIV的HA蛋白的新城疫基因Ⅶ型減毒株重組病毒rDHN3mF-2HA，經(jīng)Western blot驗(yàn)證表明增加HA的可溶性表達(dá)與原HA基因相比，其表達(dá)效率更高，該重組病毒有望進(jìn)一步開發(fā)成抗新城疫和H9N2亞型禽流感病毒的二聯(lián)疫苗。

1 材料與方法

1.1 病毒、質(zhì)粒、細(xì)胞、蛋白與引物

pBR322-DHN3mF、pXJ40-NP、pXJ40-P、pXJ40-L、pXJ40-DE3、弱毒株rDHN3-mF均由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存［25］；NDV強(qiáng)毒株DHN3（GenBank登錄號(hào)：MT447874.1）、H9N2亞型禽流感病毒DA株、H9滅活苗均由肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司提供；BHK-21細(xì)胞、DF-1細(xì)胞由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存；根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的H9N2 AIV 的DA株HA基因序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成HA基因，并克隆至pXJ40質(zhì)粒中，命名為pXJ40-HA。本試驗(yàn)所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。

1.2 雞胚與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF雞胚購(gòu)自新興大華農(nóng)禽蛋有限公司，孵育至9～11 d使用。7 d SPF白羽肉雞購(gòu)自肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司。

1.3 主要試劑

Lipofectamine LTX and Plus Reagent （15338-100） 購(gòu)自Invitrogen；Premix-Taq （RR902A）及本文所有限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa；ClonExpress Multis One Step Cloning Kit （C113）購(gòu)自南京諾維贊生物制品有限公司; Goat Anti-Rabbit IgG Hamp;L （Cy2 ） preadsorbed （ab6940）購(gòu)自CST；兔抗雞IgG-HRP（SE235）購(gòu)自Solarbio；AIV-HA多抗與NDV高免血清由本實(shí)驗(yàn)室自制；ProteinFind Anti-β-Actin Mouse Monoclonal Antibody（HC201-01）購(gòu)自全式金公司。

1.4 利用反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救共表達(dá)膜結(jié)合型與可溶性HA蛋白的重組NDV

根據(jù)圖1所示，以質(zhì)粒pXJ40-HA為模板，分別用引物2HA-F1/2HA-R1、2HA-F2/2HA-R2擴(kuò)增HA片段與刪減跨膜區(qū)與胞內(nèi)區(qū)的sHA片段。隨后，利用同源重組的方法將HA片段與sHA片段克隆至線性化載體pXJ40Flag上，將質(zhì)粒命名為pXJ40Flag-2HA。以pBR322-rDHN3 載體為模板，分別用引物rDHN3-F1/rDHN3-SmaI-R1、rDHN3- SmaI-F2/rDHN3-R2 擴(kuò)增F1（1 471 bp）和 F2片段（4 815 bp）。之后再以pXJ40flag-HA或pXJ40flag-2HA載體為模板用引物HA-F/HA-R擴(kuò)增F3（1 713 bp）與F3′（3 869 bp）片段。用SmaⅠ 酶切pBR322-DHN3mF［25］，通過膠回收純化DNA片段F4（13 399 bp）。將上述4個(gè)片段進(jìn)行同源重組，得到重組全長(zhǎng)質(zhì)粒 pBR322-DHN3mF-HA與pBR322-DHN3mF-2HA。

將重組全長(zhǎng)質(zhì)粒 pBR322-DHN3mF-HA與pBR322-DHN3mF-2HA分別與輔助質(zhì)粒pXJ40-NP、pXJ40-P、pXJ40-L、pXJ40-DE3共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，用反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救重組NDV，操作方法按照文獻(xiàn)所述［25］，簡(jiǎn)要流程為：轉(zhuǎn)染前1 d，將約 2.5×106個(gè)BHK-21細(xì)胞鋪種至6孔板中，細(xì)胞密度達(dá)到約80%時(shí)，將全長(zhǎng)質(zhì)粒 pBR322-DHN3mF-HA、 pBR322-DHN3mF-2HA分別與3個(gè)輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞，4 d后收獲轉(zhuǎn)染產(chǎn)物，于-80 ℃經(jīng)3次反復(fù)凍融后，接種10 d SPF雞胚，每胚0.2 mL，37 ℃孵育4 d，收獲尿囊液進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（hemagglutination test， HAT）驗(yàn)證病毒是否拯救成功。將HA≥6log2的雞胚尿囊液繼續(xù)在SPF雞胚中傳3代。以TRIzol法抽提尿囊液RNA，采用RT-PCR法擴(kuò)增插入的HA與2HA基因片段，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.5 重組病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA生物學(xué)特性的鑒定及毒力測(cè)定

通過測(cè)定rDHN3-mF、rDHN3mF-HA與rDHN3mF-2HA的血凝效價(jià)（HA）、雞胚半數(shù)感染量（median egg infectious dose， EID50）、組織細(xì)胞半數(shù)感染量（median tissue culture infective dose， TCID50）、最小致死量雞胚平均死亡時(shí)間（mean death time， MDT）及腦內(nèi)致病指數(shù)（intracerebral Pathogenicity Index，ICPI）等病毒毒力指數(shù)，評(píng)價(jià)HA基因的插入對(duì)病毒復(fù)制的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

通過間接免疫熒光試驗(yàn)（immunofluorescence assay，IFA）鑒定rDHN3mF-HA與rDHN3mF-2HA感染BHK-21細(xì)胞后HA蛋白的表達(dá)情況，將重組毒株rDHN3mF-HA、rDHN3mF-2HA尿囊液、親本毒株rDHN3-mF尿囊液和SPF雞尿囊液以MOI=2感染BHK-21細(xì)胞，24 h后進(jìn)行IFA試驗(yàn)。

為研究重組病毒和親本病毒在BHK-21細(xì)胞上的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，將約 2.5×106個(gè)BHK-21細(xì)胞鋪種至6孔板中，待BHK-21細(xì)胞在6孔板中長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，分別以MOI=1的比例感染BHK-21細(xì)胞，37 ℃溫箱孵育2 h后棄去病毒液，換成含有0.01% Trypsin的DMEM培養(yǎng)液。分別感染后4、8、16、24、36、48及60 h這7個(gè)時(shí)間點(diǎn)收獲感染病毒液，測(cè)定不同感染時(shí)間的病毒TCID50，繪制病毒生長(zhǎng)曲線。

通過Western blot試驗(yàn)鑒定重組毒rDHN3mF-HA與rDHN3mF-2HA的HA蛋白在DF-1細(xì)胞中的表達(dá)情況。將在SPF雞胚傳代至第15代的rDHN3mF-HA與rDHN3mF-2HA以MOI=2的比例感染DF-1細(xì)胞，感染48 h后收獲蛋白樣品并進(jìn)行Western blot試驗(yàn)。

1.6 重組病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA在雞中的免疫原性評(píng)價(jià)

選取7日齡的SPF雞進(jìn)行重組病毒的免疫原性試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及免疫程序如表2所示，免疫后觀察各組動(dòng)物的臨床表現(xiàn)和死亡情況，連續(xù)觀察28 d。免疫后7 d，在各免疫組內(nèi)隨機(jī)選取3只進(jìn)行臨床剖檢觀察，對(duì)雞的肝、脾、氣管、腺胃和十二指腸等器官的病理變化進(jìn)行觀察。免疫后每隔7 d，每組隨機(jī)抽取10只SPF雞進(jìn)行翅下靜脈采血，連續(xù)采血4周，分離血清并檢測(cè)HI效價(jià)。

1.7 重組病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA的攻毒保護(hù)試驗(yàn)

上述各組免疫后28 d，對(duì)各免疫組內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通過點(diǎn)眼滴鼻的方式攻新城疫強(qiáng)毒株DHN3和H9N2 AIV，攻毒分組見表3，以此評(píng)價(jià)兩株重組毒株在新城疫強(qiáng)毒株DHN3和H9N2 AIV攻毒下的免疫保護(hù)效果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并用ImageJ進(jìn)行灰度值分析，*表示Plt;0.05; **表示Plt;0.01;*** 表示Plt;0.001;**** 表示Plt;0.000 1。

2 結(jié) 果

2.1 重組病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA的拯救與鑒定

分別將重組毒株rDHN3mF-HA、rDHN3mF-2HA尿囊液、親本毒株rDHN3-mF尿囊液和SPF尿囊液感染BHK-21細(xì)胞，感染24 h后做IFA試驗(yàn)，以1∶200兔源HA多克隆抗體為一抗，以1∶400稀釋的FITC標(biāo)記羊抗兔為二抗，然后用20×的熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。試驗(yàn)結(jié)果（圖2）表明重組病毒rDHN3mF-HA、rDHN3mF-2HA感染 BHK-21細(xì)胞后，能在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到HA蛋白的活性，說(shuō)明重組毒株 rDHN3mF-HA、rDHN3mF-2HA均能表達(dá)HA蛋白。

分別從重組病毒rDHN3mF-HA與rDHN3mF-2HA感染的F5、F10、F15代雞胚尿囊液中提取RNA，用引物M-F2/P-R2進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果顯示（圖3），重組病毒3個(gè)代次的樣本條帶大小與預(yù)期一致，HA基因大小為2 306 bp，2HA基因大小為4 046 bp。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列與目的基因序列一致，表明重組病毒的遺傳具有穩(wěn)定性，以上試驗(yàn)說(shuō)明救毒成功，成功獲得兩株重組NDV。

2.2 重組病毒rDHN3mF-HA與rDHN3mF-2HA的生物學(xué)特性及毒力分析

對(duì)重組病毒進(jìn)行生物學(xué)特性分析，結(jié)果顯示重組病毒在雞胚中的復(fù)制效率較高，HA達(dá)到8log2，重組病毒的EID50和TCID50均低于親本毒株（表4），這可能是由于插入外源基因所導(dǎo)致的。重組病毒的生長(zhǎng)曲線見圖4，結(jié)果顯示重組病毒與親本毒株具有相似的生長(zhǎng)曲線，均在感染BHK-21細(xì)胞后的4 h開始復(fù)制，且在36 h達(dá)到峰值后開始下降。對(duì)重組病毒進(jìn)行毒力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)MDT和ICPI均與親本毒株相似，說(shuō)明重組毒株符合典型的弱毒株特征，可以用于后續(xù)的免疫效果分析。

2.3 重組病毒rDHN3mF-HA與rDHN3mF-2HA的Western blot鑒定

通過Western blot試驗(yàn)鑒定重組毒rDHN3mF-HA與rDHN3mF-2HA的HA蛋白在DF-1細(xì)胞中的表達(dá)情況，并使用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以H9N2 DA 毒株作為陽(yáng)性對(duì)照，未接毒的DF-1細(xì)胞作為陰性對(duì)照。結(jié)果如圖5所示，重組病毒rDHN3mF-HA與rDHN3mF-2HA中HA蛋白均能正常表達(dá)，且rDHN3mF-2HA的HA蛋白量更高。

2.4 重組病毒rDHN3mF-HA與rDHN3mF-2HA對(duì)SPF雞的免疫原性評(píng)價(jià)

2.4.1 重組病毒的安全性檢測(cè)

將重組毒株rDHN3mF-HA、rDHN3mF-2HA以106 EID50·只-1的免疫劑量接種7 d的SPF雞，接種后連續(xù)觀察28 d，與空白對(duì)照組相比，各組試驗(yàn)雞精神狀態(tài)良好，食欲正常，被毛整齊。

免疫后7 d，分別自H9滅活疫苗組、重組病毒組（rDHN3mF-HA、rDHN3mF-2HA）、親本毒組（rDHN3-mF）和空白對(duì)照組（PBS）各取3只雞，進(jìn)行剖檢觀察。結(jié)果見圖6和圖7，顯示肝、心、腎、脾、肌胃和腺胃等器官無(wú)肉眼可見的病理變化，說(shuō)明接種劑量為106 EID50·只-1時(shí)，重組毒株rDHN3mF-HA、rDHN3mF-2HA與親本毒株對(duì)SPF雞是安全的，可以用于后續(xù)的免疫效果分析。

2.4.2 血清中NDV特異性抗體及H9N2亞型AIV特異性抗體檢測(cè)

分別以H9N2 AIV為四單位抗原和NDV為四單位抗原進(jìn)行HI檢測(cè)，結(jié)果（圖8）顯示rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA均能誘導(dǎo)產(chǎn)生H9N2 AIV特異性抗體，抗體滴度從7 dpi提高到28 dpi，rDHN3mF-2HA誘導(dǎo)產(chǎn)生的H9N2 AIV特異性抗體在28 dpi顯著高于rDHN3mF-HA （Plt;0.05）；

與空白對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組在免疫后7 d開始產(chǎn)生NDV抗體，并在21 d達(dá)到最高峰，然而rDHN3mF-2HA組產(chǎn)生的抗體水平極顯著低于rDHN3-mF組 （Plt;0.001），可能是插入2HA影響NDV的復(fù)制，從而影響抗體的產(chǎn)生。

2.5 重組病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA的攻毒保護(hù)試驗(yàn)

2.5.1 攻毒后臨床表現(xiàn)與存活率情況

攻毒后連續(xù)9 d觀察全部雞的臨床表現(xiàn)與存活情況，并計(jì)算攻毒保護(hù)率。結(jié)果如表5所示：攻DHN3后，攻毒對(duì)照組SPF雞3 d后均出現(xiàn)嗜睡，垂頭，精神萎靡，排黃綠色稀糞等癥狀，攻毒后5 d開始有雞死亡，攻毒后7 d雞全部死亡，而所有免疫組均能對(duì)雞只產(chǎn)生100%的保護(hù)作用；H9N2 AIV攻毒后，攻毒對(duì)照組與免疫組的SPF雞的精神食欲無(wú)明顯差異，肉眼觀察無(wú)明顯發(fā)病癥狀，并未出現(xiàn)死亡情況。

2.5.2 攻毒后拭子排毒情況

利用HA的試驗(yàn)

方法檢測(cè)各組雞的喉拭子與泄殖腔拭子，DHN3攻毒后，攻毒對(duì)照組的喉部、泄殖腔在3、6 d均全部排毒，而各免疫組在攻毒后3 d即可以有效抑制NDV排毒，攻毒后6 d則完全抑制NDV排毒（表6）。H9N2 AIV攻毒后，攻毒對(duì)照組的喉部、泄殖腔在3、6、9 d均全部排毒，而免疫各組均能有效抑制AIV排毒，與H9滅活疫苗組相比，rDHN3mF-HA組與rDHN3mF-2HA組在攻毒后6 d即可完全抑制AIV排毒（表7），說(shuō)明rDHN3mF-HA與rDHN3mF-2HA有較好的攻毒保護(hù)效果。

2.5.3 H9N2亞型AIV攻毒后臟器排毒檢測(cè)

H9N2亞型AIV攻毒后，各免疫組的肺和氣管病毒含量均隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降（圖9），在攻毒后3、6和9 d的肺中，各免疫組的病毒含量均顯著低于攻毒對(duì)照組（Plt;0.01）；其中，rDHN3mF-2HA組的肺病毒含量顯著低于H9滅活疫苗組（Plt;0.01）；攻毒3、6和9 d后的氣管，各免疫組的病毒含量均顯著低于攻毒對(duì)照組（Plt;0.01），6 d后的H9滅活疫苗組除外，rDHN3mF-2HA組的氣管病毒含量均顯著低于H9滅活疫苗組（Plt;0.05），這說(shuō)明H9滅活疫苗、rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA均能有效抑制H9N2亞型AIV在肺和氣管中的病毒復(fù)制，其中rDHN3mF-2HA效果更佳。

3 討 論

雖然已在流行地區(qū)大量使用H9N2 AIV滅活疫苗，但從雞中分離出的H9N2病毒比例在中國(guó)所有亞型AIV中排名第一，這表明H9N2滅活疫苗的有效性不足，主要原因是疫苗的生產(chǎn)無(wú)法跟上流感病毒的變異，導(dǎo)致疫苗株與當(dāng)?shù)亓餍兄瓴黄ヅ洌徊粌H如此，H9N2 AIV滅活疫苗必須通過肌肉注射，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且多次肌肉注射還會(huì)引起應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致雞生長(zhǎng)緩慢和產(chǎn)蛋量下降。因此，迫切需要一種能夠在不同H9譜系之間提供有效交叉保護(hù)的新型疫苗。

隨著反向遺傳技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究?jī)A向于將NDV作為病毒載體表達(dá)其他病毒的外源基因，與馬立克病病毒、腺病毒等其他病毒載體相比，NDV的基因組較小，僅編碼6種蛋白（NP-P-M-F-HN-L），因此對(duì)外源蛋白的表達(dá)和免疫影響較小［26］。例如，以NDV為載體表達(dá)人獲得性免疫缺陷病毒I型（HIV-I）的表面糖蛋白gp160，并在豚鼠中誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的黏膜和血清抗體反應(yīng)［27］。在以NDV作為病毒載體表達(dá)ASFV p72蛋白時(shí)，重組NDV-p72病毒不僅能夠順利表達(dá)ASFV p72蛋白，誘導(dǎo)高滴度的p72特異性IgG抗體，而且還能誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和IFN-γ的分泌，表明NDV可以同時(shí)激活體液免疫和細(xì)胞免疫［28］。此外，多項(xiàng)研究還以NDV為病毒載體來(lái)表達(dá)H9N2 AIV的HA基因，結(jié)果顯示重組病毒能同時(shí)抵抗NDV和H9N2 AIV的感染，有良好的保護(hù)作用［29］。

因此，本研究對(duì)H9N2 AIV的HA基因經(jīng)過跨膜區(qū)分析預(yù)測(cè)，將全長(zhǎng)膜結(jié)合HA和另外一個(gè)帶有截短跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶性HA蛋白插進(jìn)新城疫基因Ⅶ型DHN3-mF 弱毒株的P和M基因之間，有研究表明P與M基因之間是外源基因插入的優(yōu)勢(shì)位點(diǎn)，且該位點(diǎn)與NDV基因組中所有其他位置相比，產(chǎn)生的表達(dá)信號(hào)較強(qiáng)，對(duì)重組病毒的復(fù)制影響較?。?0］，成功構(gòu)建了rDHN3mF-HA、rDHN3mF-2HA，2HA基因的長(zhǎng)度約為3.4 kb，Western blot檢測(cè)結(jié)果證明2HA蛋白的表達(dá)量比單基因HA的表達(dá)量更高，且在細(xì)胞和雞胚中的復(fù)制水平無(wú)明顯差別。

疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)是疫苗研制中需要考慮的重要因素之一。與rDHN3mF-HA相比，用rDHN3mF-2HA免疫28 d后能產(chǎn)生更多的特異性H9N2 HI抗體水平且有顯著差異，但NDV的特異性抗體檢測(cè)卻與母源毒株相差接近2 log2，可能是插入3.4 kb左右的2HA基因會(huì)影響重組NDV在動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制，導(dǎo)致NDV HI抗體水平較低。有研究表明，在插入約2 kb左右的外源基因?qū)DV復(fù)制無(wú)明顯影響，插入外源基因長(zhǎng)度增加到3 126 bp或3 894 bp時(shí)，重組病毒在細(xì)胞中的復(fù)制無(wú)明顯變化，但是在動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制下降十分之一左右［31］。

在SPF雞的免疫試驗(yàn)中，NDV抗體水平的檢測(cè)結(jié)果表明用rDHN3mF-HA或rDHN3mF-2HA重組病毒免疫14 d后均能在受試動(dòng)物血清中檢測(cè)到較高水平的NDV HI抗體。攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫雞群經(jīng)NDV強(qiáng)毒攻毒后的存活率均為100%，表明雖然接種rDHN3mF-2HA的SPF雞血清中的NDV抗體水平較另外三者低，但rDHN3mF-2HA仍能提供足夠的保護(hù)作用。NDV體外排毒檢測(cè)結(jié)果也證明兩株重組病毒均能有效抑制NDV的排毒，達(dá)到與親本毒株相當(dāng)?shù)囊种芅DV排毒能力。

H9N2 AIV抗體水平的檢測(cè)結(jié)果表明構(gòu)建的重組病毒能產(chǎn)生H9N2 AIV特異性HI抗體，但H9商品化滅活疫苗組所產(chǎn)生的HI抗體水平比重組病毒高出一半以上，表明重組弱毒AIV疫苗刺激機(jī)體抗AIV的體液免疫反應(yīng)較H9商品化全病毒滅活疫苗弱，但是攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組弱毒疫苗對(duì)攻毒后各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的保護(hù)率是100%，且能有效抑制攻毒后各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喉嚨和泄殖腔排放量，這提示接種重組弱毒疫苗的雞群存在特異性免疫記憶細(xì)胞。當(dāng)這些雞群攻毒后它們能識(shí)別入侵的病原并迅速地被激活，從而產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫反應(yīng)。與rDHN3mF-HA組相比，在免疫后28 d，rDHN3mF-2HA組的HI抗體水平滴度顯著提高，證明經(jīng)過優(yōu)化的HA基因通過NDV載體能刺激更好的特異性體液免疫。

在H9N2 AIV攻毒后，上述免疫雞群均無(wú)明顯眼觀病癥或死亡。從喉、肛拭子的排毒情況來(lái)看，攻毒后6 d，重組弱毒疫苗組檢測(cè)不到排毒情況但H9滅活疫苗組仍能檢測(cè)到排毒，說(shuō)明表達(dá)H9N2 AIV HA蛋白的重組NDV可有效減少H9N2 AIV在氣管和泄殖腔中的繁殖，這與以往的研究結(jié)果一致［32-34］。從臟器病毒含量檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，攻毒后3與6 d，重組弱毒疫苗組肺與氣管的病毒含量均比H9滅活疫苗組更低，這可能是由于重組病毒相較于滅活疫苗有更好的誘導(dǎo)黏膜免疫與細(xì)胞免疫的能力［35］。rDHN3mF-2HA組在攻毒后3 d能顯著降低肺與氣管的病毒含量，但rDHN3mF-HA組在攻毒后6 d才出現(xiàn)，說(shuō)明2HA比HA有更強(qiáng)的免疫保護(hù)作用，這可能與2HA能提供更多特異性抗原有關(guān)。

綜上，本研究以基因Ⅶ型流行毒株的減毒株rDHN3-mF作為載體，表達(dá)全長(zhǎng)膜結(jié)合型HA和另外一個(gè)帶有截短跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶性HA蛋白，獲得能高效穩(wěn)定表達(dá)H9N2 AIV的HA蛋白的新城疫基因Ⅶ型減毒株重組病毒rDHN3mF-HA、rDHN3mF-2HA。重組病毒rDHN3mF-2HA的可溶性HA蛋白表達(dá)量顯著提高，但是因?yàn)椴《据d體攜帶了較大的外源基因，降低了其在雞體內(nèi)的復(fù)制水平。本研究有望開發(fā)出抗禽流感和抗新城疫二聯(lián)疫苗，為控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路，并且對(duì)NDV疫苗載體的構(gòu)建和優(yōu)化有重要的參考意義。

4 結(jié) 論

（1）利用反向遺傳技術(shù)，在NDV基因組P基因與M基因之間插入不同形式的H9N2亞型AIV HA基因，成功拯救出重組病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA。

（2）兩株重組病毒均可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)特異性HA蛋白，保持了親本株的低毒力、遺傳穩(wěn)定、良好的雞胚和細(xì)胞適應(yīng)性特征。

（3）兩株重組病毒免疫SPF雞群后可以有效得保護(hù)雞群免受基因Ⅶ型的NDV毒株和H9N2亞型AIV的攻擊，且rDHN3mF-2HA的免疫效果優(yōu)于rDHN3mF-HA和H9亞型禽流感滅活苗。

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（編輯 白永平）