猴痘病毒B20R蛋白原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備

摘要：【目的】構(gòu)建猴痘病毒B20R蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)，并評(píng)價(jià)原核表達(dá)獲得的融合蛋白免疫原性，為后續(xù)的猴痘病毒檢測及新型治療方法開發(fā)提供技術(shù)支撐?！痉椒ā繀⒄誈enBank已公布的猴痘病毒基因組序列，按照大腸桿菌密碼子偏好性對B20R基因DNA序列進(jìn)行優(yōu)化，人工合成B20R基因并將其分別克隆至表達(dá)載體pET-28a和pET-32a以構(gòu)建原核表達(dá)載體；以構(gòu)建的2種原核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后使用SDS-PAGE和Western blotting檢測融合蛋白B20R的表達(dá)情況。通過控制變量法優(yōu)化融合蛋白B20R的誘導(dǎo)表達(dá)條件，使用Ni柱親和層析進(jìn)行純化；以純化的融合蛋白B20R經(jīng)腹腔注射免疫昆明小鼠，定期采集昆明小鼠血樣，采用ELISA檢測血清抗體效價(jià)。【結(jié)果】將B20R基因克隆至表達(dá)載體pET-32a能成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-B20R，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，可在大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)出融合蛋白B20R，且主要以不可溶的包涵體形式進(jìn)行表達(dá)。融合蛋白B20R最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為37℃下以0.6mmol/L IPTG誘導(dǎo)12h，Ni柱親和層析純化的最佳咪唑洗脫濃度為40mmol/L。以純化的融合蛋白B20R接種免疫昆明小鼠，可在短時(shí)間內(nèi)引起昆明小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫，且至免疫第42d仍然維持較高的抗體水平，抗體效價(jià)高達(dá)1：409600?！窘Y(jié)論】構(gòu)建的猴痘病毒B20R蛋白原核表達(dá)載體可在大腸桿菌BL21細(xì)胞中以包涵體形式成功表達(dá)出融合蛋白B20R，且融合蛋白B20R具有良好的免疫原性，可在短時(shí)間內(nèi)引起昆明小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫。

關(guān)鍵詞：猴痘病毒；B20R蛋白；原核表達(dá)；免疫原性；抗體效價(jià)

中圖分類號(hào)：S852.659.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）01-0217-09

Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of monkeypox virus B20R protein

YANG Ling-di12，LI Xiao-mei1，LU Xiao-ou1，PENG Qi1-2，KONG Ling-bao'2*，WANG Yu1-2

（'College of Bioscience and Bioengineering，JiangxiAgricultural University，Nanchang，Jiangxi330045，China; 2Nanchang City Key Laboratory of Animal Virus and Genetic Engineering，Nanchang，Jiangxi330045，China）

Abstract：[Objective]To construct aprokaryotic expression system for monkeypox virus B20R protein and evaluate the immunogenicity of the fusion protein obtained from prokaryotic expression，to provide technical support for subse-quent monkeypox virus detection and the development of novel treatment methods.【Method]Refering to the monkeypox virus genome sequence publishedin GenBank，the DNAsequence of B20R gene was optimized according to codon preferen-ce of Escherichia coli.B20R gene was synthesized，and cloned to expression vectors pET-28a and pET-32a to construct prokaryotic expression vectors.The two constructed prokaryotic expression vectors were individually transformed into E.coli BL21competent cells.After IPTG induced expression，both SDS-PAGE and Westen blotting were performed to de-tect the expression of B20R fusion protein.The induced expression conditions of B20R fusion protein were optimized by the control variable method，and Ni-column affinity chromatography was used for purification.Kunming mice were im-munized with the purified B20R fusion protein through intraperitoneal injection.Blood samples were collected regularly from Kunming mice，and the serum antibody titers were detected using ELISA.【Result]JThe B20R gene was successfully cloned into the pET-32a expression vector resulting in the construction of prokaryotic expression vector pET-32a-B20R.After induction with IPTG，the B20R fusion protein could be expressed in the main form of insoluble inclusion bodies in E.coli BL21competent cells.The optimal induced expression conditions for B20R fusion protein were0.6mmol/L IPTG induction at37℃for12h，and the optimal imidazole elution concentration for Ni-column affinity chromatography purifi-cation was40mmol/L.Immunization of Kunming mice with purified B20R fusion protein could rapidly induce strong hu-moral immunity in Kunming mice，and the high antibody level could still be maintained on the42day after immuniza-tion，with an antibody titer as high as1：409600.[Conclusion]The constructed prokaryotic expression vector of monkey-pox virus B20R protein can successfully express the B20R fusion protein in the form of inclusion bodies in E.coli BL21cells，and the B20R fusion protein has good immunogenicity，which can rapidly induce strong humoral immunity in Kun-ming mice.

Keywords：monkeypox virus;B20R protein;prokaryotic expression;immunogenicity;antibody titer

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31860038，32360908）;Key Project of Jiangxi Natural Science Foundation（20224ACB205004）

0引言

【研究意義】猴痘（Monkeypox，MPX）是由猴痘病毒（Monkeypox virus，MPXV）感染引起的一種人獸共患傳染病，潛伏期通常為6～13d，感染發(fā)病后的臨床癥狀主要表現(xiàn)為高熱、局部淋巴結(jié)腫大及全身水皰膿包，少數(shù)病例由于出血性皰疹或其他并發(fā)癥導(dǎo)致病情加重，甚至死亡（Shchelkunov et al.，2001;Arndt et al.，2015;Petersen et al.，2019）。猴痘病毒此前主要流行于非洲中部和西部地區(qū)，2022年初歐美地區(qū)暴發(fā)猴痘疫情，同年9月我國出現(xiàn)首例猴痘病例（李婷婷等，2022）。猴痘病毒的傳染性極高，具有在全世界大面積暴發(fā)流行的潛在風(fēng)險(xiǎn)，已被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件（Kumar et al.，2022），但目前針對猴痘病毒的研究相對較少，其生物學(xué)特性、致病機(jī)理及病毒蛋白的免疫原性等尚未明確。因此，亟待對猴痘病毒蛋白進(jìn)行原核表達(dá)純化并檢測其免疫原性，為深入探究猴痘病毒蛋白生物學(xué)功能及其診斷試劑和疫苗研發(fā)提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】猴痘病毒于1958年首次從丹麥實(shí)驗(yàn)室的猴子皮膚皰疹（痘）中分離獲得，是一種雙鏈DNA病毒，其基因組全長197kb，具有190個(gè)開放閱讀框（ORF），隸屬于痘病毒科（Poxviridae）正痘病毒屬（Orthopoxvirus）（McCollum and Damon，2014;Sklenovska and van Ranst，2018;Al-Gburi and Namuq，2022;Laiton-Donato et al.，2022）。猴痘病毒與天花病毒和牛痘病毒同屬，三者間具有較高的同源性。猴痘病毒基因組的中心區(qū)域編碼必需酶和結(jié)構(gòu)蛋白，與天花病毒中心區(qū)域的相似性為96.3%，故早期采用接種牛痘天花疫苗來預(yù)防猴痘，其保護(hù)率可達(dá)85.0%（Nasir et al.，2018;Sklenovska and van Ranst，2018;Quarleri et al.，2022;Saxena et al.，2022）;但這種免疫接種辦法存在明顯的副作用，因此亟待開發(fā)出更安全高效的疫苗來預(yù)防和治療猴痘。2022年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）臨時(shí)批準(zhǔn)了Jynneos疫苗和ACAM2000疫苗可用于預(yù)防及治療猴痘。臨床統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，Jynneos疫苗的預(yù)防效果優(yōu)于ACAM2000疫苗，故Jynneos疫苗被批準(zhǔn)為預(yù)防猴痘的疫苗，是目前唯一獲批的猴痘疫苗，但至今尚未研發(fā)出防治猴痘病毒的特效藥（Brown and Leggat，2016;Karim et al.，2022;Meo et al.，2022;Saxena et al.，2022）。有研究證實(shí)，特考韋瑞ST-246是一種針對正痘病毒小分子的抑制劑，于2022年在歐洲獲批用于治療猴痘（Zhao et al.，2024）;病毒DNA聚合酶抑制劑西多福韋和布林西多福韋衍生物對正痘病毒具有較強(qiáng)的抗病毒活性（Baker et al.，2003;Stafford et al.，2023）;Nioch-14作為核苷類似物抑制劑也可用于治療猴痘（Mazurkov et al.，2016）;利巴韋林、噻唑呋喃、C-CA3-ADO、C3-NPC A、DNA聚合酶抑制劑HPMA和腺苷N1氧化物（ANO）等均具有良好的抗痘病毒活性（Baker et al.，2003）。雖然這些藥物對治療猴痘有一定療效（Baker et al.，2003;Delaune and Iseni，2020），但都不是針對猴痘病毒的特效抗病毒藥物。【本研究切入點(diǎn)】目前，市面上尚無猴痘病毒抗原檢測試劑盒，猴痘病毒診斷試劑也較匱乏。猴痘病毒蛋白B20R由190個(gè)氨基酸組成，蛋白大小21.5kD，具備作為抗原檢測蛋白的潛能（Shchelkunov et al.，2002），但天花病毒和痘苗病毒并無對應(yīng)的同源蛋白，導(dǎo)致其生物學(xué)功能完全未知?！緮M解決的關(guān)鍵問題】參照GenBank已公布的猴痘病毒基因組序列，對B20R基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化及人工合成，通過構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-B20R，利用原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白并優(yōu)化其表達(dá)條件，以純化的融合蛋白免疫接種昆明小鼠進(jìn)行免疫原性評(píng)價(jià)，以期為后續(xù)的猴痘病毒檢測及新型治療方法開發(fā)提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

表達(dá)載體pET-32a及大腸桿菌DH5α和BL21感受態(tài)細(xì)胞由南昌市動(dòng)物病毒與基因工程重點(diǎn)研究室保存提供；DL2000DNA Marker、DL15000DNA Marker、限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶及核酸染料購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、30%丙烯酰胺、IPTG、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、氨芐青霉素、卡那霉素及瓊脂糖購自北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物及過硫酸銨購自英國Oxoid公司；DNA純化回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司；ECL發(fā)光液和TMB顯色液購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司。主要儀器設(shè)備有梯度PCR儀（SimpliAmpThermal C）、凝膠成像分析系統(tǒng)（GelDox XR）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、瓊脂糖水平電泳儀（EPS-600）及培英2-1臺(tái)式恒溫?fù)u床等。

1.2B20R蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

參照NCBI已公布的猴痘病毒基因組序列（MPXV_USA_2022_MA001，登錄號(hào)ON563414.3），選擇B20R基因并翻譯成氨基酸序列，然后通過ExPASy、IEDB和TMHMM等在線軟件分別進(jìn)行B20R蛋白親/疏水性、抗原表位及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.3原核表達(dá)載體構(gòu)建

1.3.1原核表達(dá)載體pET-28a-B20R構(gòu)建參照NCBI已公布的猴痘病毒基因組序列（MPXV_USA_2022_MA001），委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司按照大腸桿菌密碼子偏好性對B20R基因進(jìn)行DNA序列優(yōu)化及人工合成，并將合成的目的基因插入載體pET-28a的BamHI與Hind III酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-B20R。

1.3.2原核表達(dá)載體pET-32a-B20R構(gòu)建以構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-28a-B20R為模板、B20R-F（5'-CGCGGATCCATGACCATTTATGGTC-3'）和B20R-R（5'-CGCTCGAGACCATCAACGCC-3'）為引物，使用高保真酶PCR擴(kuò)增B20R基因。通過BamHI和Xho I內(nèi)切酶分別雙酶切表達(dá)載體pET-32a及擴(kuò)增獲得的B20R基因片段，回收酶切產(chǎn)物并以T4DNA連接酶進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取DH5α菌株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定及雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Sanger測序。

1.4融合蛋白表達(dá)與驗(yàn)證

以原核表達(dá)載體pET-28a-B20R和pET-32a-B20R分別轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種至5.0mL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD?為0.6～0.8，即獲得種子液。將種子液按1%的接種量接種至5.0mL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至ODo為0.6～0.8，加入終濃度為1.0mmol/L的IPTG，37℃搖床誘導(dǎo)表達(dá)8h。取1.5mL誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，12000×g離心2min收集菌體，加入PBS重懸后與蛋白上樣緩沖液混勻，沸水浴20min，12000×g離心2min，棄上清液。取10μL菌體蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色分析融合蛋白表達(dá)情況；同時(shí)取10μL菌體蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，再通過Western blot-ting驗(yàn)證目的蛋白是否表達(dá)。

1.5融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

（1）誘導(dǎo)溫度優(yōu)化：將種子液接種至5.0mL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD?為0.6～0.8，加入終濃度為1.0mmol/L的IPTG，分別在18、22、27、32、37和42℃下誘導(dǎo)表達(dá)8h，以未添加IPTG的菌液為陰性對照。取等量菌液制備樣品，通過SDS-PAGE檢測融合蛋白表達(dá)效果。（2）誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化：將種子液接種至5.0mL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至ODo為0.6～0.8，加入終濃度為1.0mmol/L的IPTG，在37℃下分別誘導(dǎo)表達(dá)4、8、12、16、20和24h，以未添加IPTG的菌液為陰性對照。取等量菌液制備樣品，通過SDS-PAGE檢測融合蛋白表達(dá)效果。（3）IPTG濃度優(yōu)化：將種子液接種至5.0mL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至OD?o為0.6～0.8，分別加入終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mmol/L的IPTG，37℃下誘導(dǎo)表達(dá)8h，以未添加IPTG的菌液為陰性對照。取等量菌液制備樣品，通過SDS-PAGE檢測融合蛋白表達(dá)效果。

1.6融合蛋白表達(dá)形式驗(yàn)證

在最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件下大量誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白B20R，收集菌液，12000×g離心10min，棄上清液，加入PBS重懸后以超聲波破碎儀破碎菌體細(xì)胞，12000xg離心30min，分別收集上清液和沉淀物制備樣品，通過SDS-PAGE檢測融合蛋白B20R表達(dá)形式。

1.7融合蛋白純化

包涵體沉淀采用包涵體洗滌液I（2%Triton X-100，2mol/L Urea，50mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl）重懸，室溫?fù)u轉(zhuǎn)洗滌20min，12000×g離心10min，重復(fù)洗滌2次；再以包涵體洗滌液Ⅱ（1%Triton X-100，50mmol/L Tris-HC1，0.5mol/L NaCl）重懸，室溫?fù)u轉(zhuǎn)洗滌15min，12000×g離心10min，重復(fù)洗滌2次；最后以包涵體洗滌液Ⅲ（50mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaC1）重懸，搖轉(zhuǎn)洗滌20min，12000×g離心10min，重復(fù)洗滌2次。12000×g離心10min，棄上清液，用10.0mL包涵體溶解液（100mmol/LNaH?PO?，10mmol/L Tris-HCl，8mol/LUrea，0.3mol/L NaCl）進(jìn)行重懸，常溫下過夜搖轉(zhuǎn)溶解，次日20000×g離心30min，收集上清液，以0.45μm濾膜過濾備用。通過Ni柱親和層析純化融合蛋白，以10.0mL的20、40、60和80mmol/L梯度咪唑洗脫目的蛋白，分別取少量蛋白洗脫液制備樣品，以SDS-PAGE檢測目的蛋白濃度及純度。

1.8融合蛋白多克隆抗體效價(jià)測定及特異性分析

準(zhǔn)備8只6周齡雌性昆明小鼠，隨機(jī)分為2組，試驗(yàn)組（4只）腹腔注射純化后的融合蛋白B20R，對照組（4只）腹腔注射純化后的TrxA標(biāo)簽蛋白。首次免疫，將融合蛋白B20R或TrxA標(biāo)簽蛋白與弗式完全佐劑充分混勻，每只小鼠腹腔注射40μg蛋白；首免2周后，將融合蛋白B20R或TrxA標(biāo)簽蛋白與弗式不完全佐劑充分混勻，以相同方法加強(qiáng)免疫1次，之后隔1周實(shí)施第2次強(qiáng)化免疫，共免疫3次。于首免開始，每周采集小鼠尾部靜脈血1次，血樣37℃靜置1h后，4℃下16000×g離心30min，收集血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?dòng)物試驗(yàn)由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)JXAU20180072。

通過ELISA檢測多克隆抗體效價(jià)：純化后的融合蛋白B20R稀釋至2μg/mL，接種至96孔細(xì)胞板中，每孔加入50μL稀釋后的融合蛋白，4℃包被過夜；次日，以PBST洗滌5次，每次1min;然后每孔加入100μ L10%脫脂牛奶，37℃封閉1h;PBST洗滌6次后每孔加入50μL免疫小鼠血清（一抗），37℃孵育2h;PBST洗滌7次，每孔加入50μL HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG（二抗），37℃孵育1h;PBST洗滌8次，每孔加入100μL TMB顯色液，37℃避光孵育30min，再每孔加入50μL的2mol/L H?SO?終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測量吸光值，并計(jì)算多克隆抗體效價(jià)。

2結(jié)果與分析

2.1B20R蛋白結(jié)構(gòu)特性預(yù)測結(jié)果

猴痘病毒B20R蛋白由190個(gè)氨基酸組成，其分子量為21.5kD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.48。ExPASy預(yù)測結(jié)果（圖1-A）顯示，B20R蛋白N端疏水性較高，其余部分親水性較高，平均親水性系數(shù)（GRAVY）為-0.097，屬于親水性蛋白。通過IEDB預(yù)測B20R蛋白抗原表位，設(shè)閾值為0.50（對應(yīng)于75%的特異性截止值），結(jié)果顯示，B20R蛋白存在多個(gè)B細(xì)胞抗原表位和非B細(xì)胞抗原表位（圖1-B）。采用TMHMM預(yù)測B20R蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B20R蛋白N端含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖1-C），與ExPASy預(yù)測顯示N端疏水性較高及IEDB預(yù)測顯示N端有1個(gè)較大的非B細(xì)胞抗原表位相符合。

2.2原核表達(dá)載體pET-32a-B20R構(gòu)建及鑒定結(jié)果

隨機(jī)挑取5個(gè)含原核表達(dá)載體pET-32a-B20R的DH5α菌株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，均能擴(kuò)增出明亮單一且大小在500～750bp的目的條帶（圖2-A），與預(yù)期結(jié)果相符；經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切鑒定，同樣獲得與預(yù)期結(jié)果相符的目的條帶（圖2-B）。將陽性質(zhì)粒送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Sanger測序，結(jié)果表明，B20R基因已成功克隆至表達(dá)載體pET-32a，且序列完全正確，即原核表達(dá)載體pET-32a-B20R構(gòu)建成功。

2.3融合蛋白B20R誘導(dǎo)表達(dá)及驗(yàn)證結(jié)果

以原核表達(dá)載體pET-28a-B20R和pET-32a-B20R分別轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，分別采用SDS-PAGE分析融合蛋白表達(dá)情況，結(jié)果表明：（1）以原核表達(dá)載體pET-28a-B20R轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，與未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的泳道1和泳道3相比，IPTG誘導(dǎo)的泳道2和泳道4均可觀察到約26.8kD的蛋白條帶（圖3-A），與預(yù)期的B20R蛋白分子量大小相符；通過His標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blotting檢測，結(jié)果顯示蛋白條帶位置正確（圖3-B），說明原核表達(dá)載體pET-28a-B20R可在BL21感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)出融合蛋白B20R，但表達(dá)量相對較低。（2）以原核表達(dá)載體pET-32a-B20R轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，與未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的泳道1相比，IPTG誘導(dǎo)后的泳道2～泳道7均可觀察到預(yù)期大小的目的蛋白條帶（圖3-C）;使用His標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blotting檢測，檢測結(jié)果（圖3-D）進(jìn)一步證實(shí)獲得的目的條帶即為融合蛋白B20R?？梢姡瑯?gòu)建的原核表達(dá)載體pET-28a-B20R和pET-32a-B20R均能通過BL21感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)出融合蛋白B20R，但以原核表達(dá)載體pET-32a-B20R的表達(dá)量更高，故選擇原核表達(dá)載體pET-32a-B20R進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果

為實(shí)現(xiàn)原核表達(dá)載體pET-32a-B20R最大量表達(dá)出融合蛋白B20R，對其誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。首先，在IPTG終濃度為1.0mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間為8h的條件下，設(shè)6個(gè)不同的誘導(dǎo)溫度（18、22、27、32、37和42℃），結(jié)果（圖4-A）顯示，融合蛋白B20R在18～42℃下均有表達(dá)且表達(dá)量差異較小，表明誘導(dǎo)溫度對其表達(dá)量的影響不明顯。綜合考慮大腸桿菌的最適生長溫度，故選擇37℃為最佳誘導(dǎo)溫度。然后，在IPTG終濃度為1.0mmol/L、誘導(dǎo)溫度為37℃的條件下，設(shè)6個(gè)不同的誘導(dǎo)時(shí)間（4、8、12、16、20和24h），結(jié)果（圖4-B）發(fā)現(xiàn)，融合蛋白B20R在誘導(dǎo)4～24h內(nèi)均有表達(dá)，且隨誘導(dǎo)時(shí)間的推移其表達(dá)量呈先增加后降低的變化趨勢，誘導(dǎo)時(shí)間為12h時(shí)可獲得最大的表達(dá)量。最后，在誘導(dǎo)溫度為37℃、誘導(dǎo)時(shí)間為12h的條件下，設(shè)6個(gè)不同的IPTG終濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mmol/L），結(jié)果（圖4-C）顯示，融合蛋白B20R在IPTG終濃度為0.2～1.2mmol/L的條件下均有表達(dá)，且表達(dá)趨勢隨IPTG終濃度的增加呈先增加后降低趨勢，IPTG終濃度為0.6mmol/L時(shí)表達(dá)量達(dá)峰值。綜上所述，融合蛋白B20R最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為37℃下以0.6mmol/LIPTG誘導(dǎo)12h。2.5融合蛋白可溶性分析結(jié)果為確定融合蛋白B20R的表達(dá)方式及其存在形式，分別取超聲波破碎后的全菌液、沉淀物和上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果（圖5）顯示，融合蛋白B20R主要存在于沉淀物中，上清液中基本不存在融合蛋白B20R，表明融合蛋白B20R在菌體中不可溶，主要以包涵體形式存在。

2.6融合蛋白純化效果

由于融合蛋白B20R的N端含有6×His標(biāo)簽，因此選用Ni柱親和層析進(jìn)行純化，以不同濃度梯度（20、40、60和80mmol/L）咪唑進(jìn)行洗脫，SDS-PAGE分析結(jié)果（圖6）顯示，融合蛋白B20R的最佳咪唑洗脫濃度為40mmol/L。

2.7B20R多克隆抗體效價(jià)測定及特異性分析結(jié)果

將純化的融合蛋白B20R通過腹腔注射形式免疫昆明小鼠，并定期采血檢測血清抗體效價(jià)，具體免疫程序及采血方案如圖7所示。通過ELISA檢測免疫小鼠血清抗體效價(jià)，結(jié)果（圖8）顯示，融合蛋白B20R首次免疫后即誘導(dǎo)昆明小鼠產(chǎn)生明顯的體液免疫，第1次加強(qiáng)免疫后血清抗體效價(jià)顯著提升（Plt;0.05），但第2次加強(qiáng)免疫后血清抗體效價(jià)無顯著變化（Pgt;0.05）。綜上所述，融合蛋白B20R可在短時(shí)間內(nèi)引起昆明小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫，且至免疫第42d仍然維持較高的抗體水平，抗體效價(jià)高達(dá)1：409600。

3討論

猴痘是一種由猴痘病毒感染所致的人獸共患傳染病，此前主要流行于非洲中部和西部地區(qū)，但從2022年起猴痘疫情開始在世界各地不斷涌現(xiàn)，已成為嚴(yán)重危害人類健康的重大公共衛(wèi)生事件。據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心官網(wǎng)（https：//www.chinacdc.cn/）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2023年6月2—30日，我國內(nèi)地（不含港澳臺(tái)）就新增報(bào)告106例猴痘確診病例，表明了當(dāng)前猴痘病毒診斷和治療的重要性及緊迫性。至今，國內(nèi)外尚缺乏安全有效的猴痘疫苗及抗猴痘病毒的特效藥物，究其原因是對猴痘病毒的了解不夠深入，尚未明確其致病機(jī)理及宿主免疫反應(yīng)等（Karim et al.，2022;Meo et al.，2022;Saxena et al.，2022）。因此，亟待開展猴痘病毒蛋白功能及其免疫原性研究，以應(yīng)對猴痘疫情的暴發(fā)流行。

本研究根據(jù)蛋白抗原表位多及種屬特異性強(qiáng)等標(biāo)準(zhǔn)篩選出猴痘病毒B20R蛋白，該蛋白是猴痘病毒的特有蛋白，其生物學(xué)功能和免疫原性尚不清楚。蛋白功能及免疫學(xué)研究離不開對目的蛋白的大量表達(dá)與純化（牛錚等，2021;王毅豪等，2023）。本研究將猴痘病毒B20R蛋白編碼基因按照大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行全基因合成，并將合成的B20R基因分別克隆至表達(dá)載體pET-28a和pET-32a，成功構(gòu)建了B20R蛋白原核表達(dá)載體pET-28a-B20R和pET-32a-B20R。Western blotting檢測結(jié)果顯示，構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-28a-B20R和pET-32a-B20R均可在大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中成功誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白B20R，表達(dá)形式以包涵體為主，且原核表達(dá)載體pET-32a-B20R的融合蛋白表達(dá)量更高，故選擇pET-32a-B20R作為B20R蛋白后續(xù)研究的原核表達(dá)載體。融合蛋白B20R最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為37℃下以

0.6mmol/L IPTG誘導(dǎo)12h。在此條件下大量表達(dá)獲得的融合蛋白B20R經(jīng)Ni柱親和層析純化后，免疫接種昆明小鼠并定期采集小鼠血樣檢測血清抗體效價(jià)，結(jié)果顯示，融合蛋白B20R可在短時(shí)間內(nèi)引起昆明小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫，且至免疫第42d仍然維持較高的抗體水平，抗體效價(jià)高達(dá)1：409600，說明原核表達(dá)獲得的融合蛋白B20R具有良好的免疫原性。該結(jié)論為后續(xù)解析B20R蛋白生物學(xué)功能及開發(fā)基于B20R蛋白的新型診斷試劑和疫苗等打下了基礎(chǔ)。

與利用昆蟲細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)病毒蛋白相比，本研究選用大腸桿菌BL21菌株為宿主細(xì)胞的原核表達(dá)系統(tǒng)具有培養(yǎng)成本低、表達(dá)水平高、操作相對簡單、易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，且有研究證實(shí)以原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的抗原蛋白制備抗體具有良好的反應(yīng)活性和特異性（方劍玉等，2023;賈夢樂等，2023）。可見，本研究建立的猴痘病毒B20R蛋白原核表達(dá)體系可有效降低融合蛋白B20R生產(chǎn)成本，有利于后續(xù)開展B20R蛋白生物學(xué)功能及免疫原性研究。此外，選用昆明小鼠制備B20R多克隆抗體，具有飼養(yǎng)成本低、制備時(shí)間短、可重復(fù)性好及適合大規(guī)模制備等優(yōu)點(diǎn)，能在短時(shí)間內(nèi)大量制備出B20R多克隆抗體。融合蛋白B20R在大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中主要以不可溶的包涵體形式表達(dá)，但表達(dá)量不高，即使在最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件下的表達(dá)量也不足細(xì)胞總蛋白的20%，可能與B20R蛋白N端存在1個(gè)高疏水性的跨膜結(jié)構(gòu)域有關(guān)。因此，后續(xù)研究擬嘗試去除B20R蛋白N端跨膜結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建B20R蛋白截短體，進(jìn)一步驗(yàn)證其表達(dá)量、表達(dá)形式及其免疫原性的變化。

4結(jié)論

構(gòu)建的猴痘病毒B20R蛋白原核表達(dá)載體可在大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中以包涵體形式成功表達(dá)出融合蛋白B20R，且融合蛋白B20R具有良好的免疫原性，可在短時(shí)間內(nèi)引起昆明小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）