廣西H9N2亞型禽流感病毒疫苗候選株的篩選

摘要：[目的】篩選出免疫原性更優(yōu)的H9N2亞型禽流感病毒（AIV）疫苗候選株用于新型疫苗研發(fā)，為加強對H9N2亞型AIV的防控提供技術支持?！痉椒ā恳?000—2020年廣西地區(qū)分離獲得的36株H9N2亞型AIV分離株為試驗材料，依據(jù)HA基因遺傳進化分析選擇12株不同年份、不同地域及不同宿主來源的H9N2亞型AIV代表株，與目前使用的商品化H9亞型AIV疫苗株（SS株）進行交叉血凝抑制試驗（HI）及抗原性分析，根據(jù)抗原分析結果選擇其中具有不同抗原差異的代表株制備油乳劑滅活疫苗，并分別與商品化H9亞型AIV疫苗（SS株）進行交叉免疫保護試驗?！窘Y果】在36株H9N2亞型AIV廣西分離株中有31株屬于Y280-Like（9.4.1），其中26株屬于分支I、5株屬于分支I，另外5株屬于G1-Like（h9.4.1），與我國常用疫苗株分屬于不同進化分支。12株H9N2亞型AIV廣西代表性分離株滅活后的HA效

價≥7log2，病毒滅活效果良好，可用于制備油乳劑滅活疫苗，且制備的油乳劑滅活疫苗穩(wěn)定性和安全性良好。根據(jù)交互HI抗體滴度計算出各毒株間的抗原相關值（R），結果發(fā)現(xiàn)A/chicken/Guangxi/C227/2015（H9N2）株（簡稱C227株）與其他毒株的抗原性無明顯差異，對應的R在0.72～0.93間波動；疫苗交叉保護試驗結果也表明，C227株制備的油乳劑滅活疫苗對不同毒株的免疫保護率均高于80%，且免疫保護效果優(yōu)于A/chicken/Guangxi/CX/2013（H9N2）株（簡稱CX13株），說明C227株更適合作為H9N2亞型AIV滅活疫苗的候選株?！窘Y論】基于抗原性分析和免疫原性測定篩選出的A/chicken/Guangxi/C227/2015（H9N2）株對廣西地區(qū)絕大部分H9N2亞型AIV流行株的免疫保護效果良好，可作為疫苗候選株用于研制新型H9N2亞型AIV疫苗。

關鍵詞：禽流感病毒（AIV）;H9N2亞型；油乳滅活疫苗；抗原相關性；疫苗交叉保護

中圖分類號：S852.659.5文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2024）01-0243-10

Screening of vaccine candidate strains of H9N2subtype avian influenza virus in Guangxi

LI Meng'，XIEZhi-xun'°，LI Dan'，XU Qian'，LUO Si-si1，ZHANG Min-xiu1，XIE Li-ji1，HUANG Chao2，SHEN Qian-cheng2，HUANG Jiao-ling1

（'Guangxi Veterinary Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology/Key Laboratory of China （Guangxi）-ASEAN Cross-border Animal Disease Prevention and Control，Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanning，Guangxi530001，China;2Guangxi Jinling Agriculture and Animal Husbandry Group Company Limited Nanning，Guangxi530049，China）

Abstract：[Objective]The vaccine candidate strains of H9N2subtype avian influenza virus（AIV）with better immu-nogenicity were screened for new vaccine research and development，which provided technical support for strengthening the prevention and control of H9N2subtype AIV.【Method]A total of36H9N2subtype AIV strains isolated in Guangxi from2000to2020were used as experimental materials.Twelve representative H9N2subtype AIV strains from different years，different regions and different host sources were selected according to the HA genetic evolution analysis.The cross hemagglutination inhibition test（HI）and antigenicity analysis were carried out with the commercial H9N2subtype AIV vaccine strain（SS strain）currently used.According to the results of antigenicity analysis，the representative strains with different antigenic differences were selected to prepare oil emulsion inactivated vaccine and tested for cross-immunoprotection with the commercial H9subtype AIV vaccine strain（SS strain），respectively.【Result]Among36strains of H9N2subtype AIV in Guangxi，31strains belonged to Y280-Like（9.4.1），of which26strains belonged to branchI，5strains belonged tobranch I，and the other5strains belonged to G1-Like（h9.4.1），which were different from theevolutionary branchof the commonly used vaccine strains in China.The HAtiter of12H9N2subtype AIV representa-tive isolates in Guangxi after inactivation was≥7log2，and the virus inactivation effect was good，which could be used to prepare inactivated oil emulsion vaccine，and the prepared inactivated oil emulsion vaccine had good stability and safety The antigen correlation value（R）of each strain was calculated acording to the titers of cross-HI antibody.The results showed that there was no obvious difference in antigenicity between A/chicken/Guangxi/C227/2015（H9N2strain）（re-ferred to as C227strain）and otherstrains，and the corresponding Rfluctuated between0.72and0.93.The results of vac-cine croSS-protection test also showed that the immune protection rate of inactivated oil emulsion vaccine prepared by C227strain was higher than80%for different strains，and the immune protection effect was better than that of A/chicken/Guangxi/CX/2013（H9N2strain）（referred to as CX13strain），which indicated that C227strain was more suitable as acandidate strain for H9N2subtype AIV inactivated vaccine.【Conclusion]A/chicken/Guangxi/C227/2015（H9N2）strain screened based on antigenicity analysis and immunogenicity determination has agood immune protection effect on most H9N2subtype AIV epidemic strains in Guangxi，and can be used as acandidate vaccine strain to develop anew H9N2subypeAIV vaccine

Keywords：avian influenzavirus（AIV）;H9N2subtype;inactivated oil emulsion vaccine;antigen correlation;cross protectionof vaccine

Foundation items：Guangxi Key Research and Development Plan Project（GuikeAB21076004）;Guangxi Natural Science Foundation（2022GXNSFAA035445，2021GXNSFBA196031）;Guangxi Bagui Scholars Project（2019-A50）

0引言

【研究意義】禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）為單股負鏈RNA病毒，其基因組由8個獨立基因片段組成（Sun and Liu，2015;王艷文等，2022）。H9N2亞型屬于低致病性AIV（LPAIV）（Peacock et al.，2019），其感染后雖然不會造成禽類大量死亡，但由于傳播能力極強、存在范圍極廣，可引起家禽產(chǎn)蛋性能和機體免疫力下降，繼而可能與其他病原發(fā)生混合感染而造成死亡率上升，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失（李孟等，2022）。疫苗接種仍是預防禽流感（Avian influenza，AI）發(fā)生與傳播的最有效措施，但H9N2亞型AIV抗原不斷變異，導致原有疫苗已無法提供完全免疫保護（Cao et al.，2022;Zheng et al.， 2022）。因此，從當前流行毒株中篩選新的H9N2亞型AIV疫苗候選株用于新型疫苗研發(fā)，對有效防控AI具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】H9N2亞型AIV于1966年首次在美國威斯康星州的火雞群中分離獲得（Huang et al.，2022）;我國廣東省于1994年首次報道分離到H9N2亞型AIV（陳伯倫等，1997），此后迅速在各地區(qū)的雞群中傳播。HA基因不斷進化造成AIV抗原變異是導致原有疫苗無法提供完全免疫保護的主要原因（趙宇，2018;趙錦華，2020;王勛等，2022）。已有研究對我國2011—2021年間安徽（胡曉苗等，2015）、山東（袁小遠等，2018;高斌等，2019）、江蘇（孫王楊吉等，2019）、廣東（宋才良等，2020）和廣西（Dong et al.，2022）等多個省（區(qū)）分離鑒定的H9N2亞型AIV進行HA基因測序及系統(tǒng)進化分析，結果發(fā)現(xiàn)大部分毒株的基因序列已發(fā)生變異，與現(xiàn)有疫苗株分別處于不同的進化分支上。此外，宿春虎（2014）對2011—2013年華東地區(qū)H9N2亞型AIV抗原性進行分析，發(fā)現(xiàn)分離株與疫苗株的抗原性存在明顯差異；魏延迪（2016）研究證實，2009—2013年間分離獲得的H9N2亞型AIV與雞群商業(yè)疫苗的抗體反應很差；馬靜（2020）從2008—2019年間分離的H9N2亞型AIV中挑選57株毒株進行抗原性分析，結果表明分離株聚類為2個不同的抗原群，且與疫苗株存在明顯的抗原性差異。我國當前使用的H9N2亞型AI疫苗種類繁多，接種免疫后雖然都能促使雞體產(chǎn)生較高的抗體水平，但發(fā)生免疫失敗的案例也十分常見（張偉等，2015;何家輝等，2022）?！颈狙芯壳腥朦c】在我國野鳥和家禽中流行的絕對大多數(shù)H9N2亞型AIV，其HA基因遺傳進化顯示分別屬于不同亞系或分支（李玉磊，2020;李孟等，2022），毒株多樣性給H9N2亞型AI的防控增加了難度。近年來的H9N2亞型AIV監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，當前廣西流行的H9N2亞型AIV在遺傳進化方面已發(fā)生顯著變化，與現(xiàn)有疫苗株分屬于不同的進化分支（李丹，2017;李云燕，2020）;同時現(xiàn)有疫苗免疫產(chǎn)生的高抗體水平對雞源H9N2亞型AIV分離株的中和作用能力減弱，而AIV在免疫雞群體內(nèi)的復制速度和傳播水平逐漸增強（蘇海龍等，2019;張義冉等，2019），因此亟待篩選新的H9N2亞型AIV流行株用于新型疫苗研發(fā)?！緮M解決的關鍵問題】以2000—2020年從廣西地區(qū)分離獲得的36株H9N2亞型AIV分離株為試驗材料，綜合HA基因遺傳進化分析和抗原性分析，篩選出免疫原性更優(yōu)的H9N2亞型AIV疫苗候選株用于新型疫苗研發(fā)，為加強對H9N2亞型AIV的防控提供技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

從36株已純化的H9N2亞型AIV廣西分離株（由廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室于2000—2020年分離獲得）中篩選出12株代表株。H9N2亞型AIV油乳劑滅活疫苗及其對應抗原購自肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司；Tween-80和Span-80購自生工生物工程（上海）股份有限公司；β-丙內(nèi)酯（β-propionolac-tone，BPL）購自德國Merck公司；SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司；4周齡SPF雞由廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室自行孵化并隔離飼養(yǎng)于負壓SPF雞隔離器。動物試驗由廣西獸醫(yī)研究所動物倫理委員會批準，批準號GVRI-202203021。

1.2代表株篩選及關鍵氨基酸分析

對2000—2020年間分離獲得的36株H9N2亞型AIV廣西分離株與我國常用疫苗株[A/chicken/Guangdong/SS/94（H9N2）（SS株）、A/chicken/Guangxi/10/99（H9N2）（Re-2株）、A/chicken/Shanghai/F/98（H9N2）（F株）和A/chicken/Shandong/6/96（H9N2）（SD696株）]，以及H9N2亞型AIV各分支代表株進行HA基因序列比對分析，基于推導氨基酸序列相似性構建遺傳進化樹，綜合考慮分離株的分離時間、地點、宿主和遺傳進化分析結果等因素，篩選出12株已純化的H9N2亞型AIV代表株，同時對H9N2亞型AIV代表株的HA蛋白關鍵氨基酸位點進行分析。

1.3油乳劑滅活疫苗制備

將12株H9N2亞型AIV代表株以無菌PBS倍比稀釋后，按0.2mL/枚的劑量接種至9～11日齡SPF雞胚尿囊腔，35℃培養(yǎng)96h，收集24h后死亡及未死亡的雞胚尿囊液，通過血凝試驗（HA）測定HA效價。按0.05%的劑量混入病毒滅活劑BPL進行滅活處理，以滅活后的尿囊液原液接種SPF雞胚進行安全性檢驗。然后參照謝芝勛等（2001）、韋悠等（2011）的方法制備油乳劑滅活疫苗。

1.4病毒抗原性分析

1.4.1多抗血清制備將篩選出的12株H9N2亞型AIV代表株制備成油乳滅活疫苗，然后與商品化H9亞型AIV疫苗（SS株）分別經(jīng)頸部皮下免疫注射28日齡SPF雞，免疫劑量1.0mL/羽，每組免疫5羽。免疫21d后采集血樣分離血清。

1.4.2交叉血凝抑制試驗（HI）及抗原性分析以1.4.1制備的免疫血清與12株H9N2亞型AIV代表株及商品化疫苗SS株進行交叉HI試驗，根據(jù)交叉HI試驗結果計算各毒株間的抗原相關值（R）;然后根據(jù)R排序篩選出5株代表株按常規(guī)方法制備油乳劑滅活疫苗。

1.5疫苗交叉保護試驗

根據(jù)抗原性分析結果，選擇5株不同抗原性差異的代表株與商品化疫苗SS株進行疫苗交叉保護試驗。將5株代表株分別制備油乳劑滅活疫苗，使用制備的油乳劑滅活疫苗和商品化H9亞型AIV疫苗（SS株）分別免疫6組21日齡的SPF雞，每組免疫5羽。免疫21d后，以篩選的5株代表株分別對各免疫組（5羽）及空白對照組（5羽）的SPF雞進行鼻腔感染，攻毒量為10°EID?/羽，觀察攻毒后14d內(nèi)各組試驗雞的臨床癥狀，并于攻毒后第1、3、5、7、10和14d采集咽喉腔及泄殖腔棉拭子，通過雞胚分離方法檢測所樣品的排毒情況。

1.6免疫后抗體維持水平監(jiān)測

以篩選的5株H9N2亞型AIV代表株制備油乳劑滅活疫苗，與商品化H9亞型AIV疫苗（SS株）分別免疫10羽21日齡的SPF雞，于免疫后第1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、20和24周采集各免疫組試驗雞血樣制備血清，通過對應的抗原測定血清抗體效價。

2結果與分析

2.1代表株篩選及HA蛋白關鍵氨基酸位點分析結果

基于HA氨基酸序列相似性構建包含36株H9N2亞型AIV廣西分離株、我國常用疫苗株及H9N2亞型AIV各分支代表株在內(nèi)的遺傳進化樹，結果（圖1）顯示，36株H9N2亞型AIV廣西分離株中有31株屬于Y280-Like（9.4.1），其中26株屬于分支I、5株屬于分支，另外5株屬于G1-Like（h9.4.1）。由于上述3個分支的毒株在廣西地區(qū)普遍流行，且與疫苗株間的親緣關系均較遠，因此從3個不同分支篩選12株廣西表代性分離株[A/duck/Guangxi/Lz071D5/2020（H9N2）簡稱Lz071D5、A/quail/Guangxi/241B5/2018（H9N2）簡稱241B5、A/sparrow/Guangxi/35B15/2013（H9N2）簡稱35B15、A/chicken/Guangxi/CWM/2019（H9N2）簡稱CWM、A/turtledove/Guangxi/191B5/2017（H9N2）簡稱191B5、A/chicken/Guangxi/CX/2013（H9N2）簡稱CX13、A/chicken/Guangxi/Fcg 01C3/2014（H9N2）簡稱Fcg01C3、A/dove/Guangi/33/2015（H9N2）簡稱210Q33]，與廣西地區(qū)應用69B17/2014（H9N2）簡稱69B17、A/chicken/Guangi/廣的商品化疫苗株A/chicken/Guangdong/SS/94C227/2015（H9N2）簡稱C227、A/chicken/GuangHi/9N2）（SS株）進行HA蛋白關鍵氨基酸位點分C228/2016（H9N2）簡稱C228、A/chicken/Guangi/，結果（表1）表明，35B15和241B5株的第145位C1228/2015（H9N2）簡稱C1228、A/quail/Guangxi/2氨10基酸發(fā)生漂變（145S→N），C227、191B5、CWM和Lz071D5株則表現(xiàn)為145s→D，145S是H9N2亞型AIV HA蛋白中具有血凝抑制特性的抗原位點，其發(fā)生漂變可能會導致毒株抗原性發(fā)生改變，但具體機理尚未明確（陳陸等，2011）。在部分代表株HA蛋白中還發(fā)現(xiàn)第198位氨基酸發(fā)生改變，其中，35B15、CX13和69B17株表現(xiàn)為198T→V，F(xiàn)cg01C3、C1228、C228和CWM株表現(xiàn)為198T→A，而CWM株表現(xiàn)為198T→K。

2.2油乳劑滅活疫苗制備效果

用于油乳劑滅活疫苗制備的12株H9N2亞型AIV廣西代表性分離株滅活前的HA效價≥9log2，由于病毒滅活會對其高級結構造成破壞，同時使病毒失去感染活性，病毒滅活的最佳效果為滅活前后HA效價下降1log2～2log2。12株H9N2亞型AIV廣西代表性分離株滅活后的HA效價≥7log2（表2），表明病毒滅活效果良好。將滅活后的雞胚尿囊原液接種至SPF雞胚盲傳2代后，經(jīng)HA試驗驗證病毒滅活完全，可用于制備油乳劑滅活疫苗，且制備的油乳劑滅活疫苗穩(wěn)定性和安全性良好。

2.3病毒抗原性分析結果

由表3可知，12株H9N2亞型AIV廣西代表性分離株及商品化疫苗SS株的交互HI抗體滴度集中在4log2～11log2。根據(jù)交互HI抗體滴度計算出各毒株間的R，結果（表4）顯示，C227株與其他毒株的抗原性無明顯差異，對應的R在0.72～0.93間波動，在13株毒株中其抗原性最高；Lz071D5株與其他毒株的抗原性差異較明顯，R的波動范圍在0.47～0.95;CWM株與商品疫苗SS株的R僅為0.49，是所有雞源H9N2亞型AIV分離株（CWM、CX13、Fcg01C3、C227、C228和C1228）中R最低的毒株；野鳥源H9N2亞型AIV分離株（241B5、35B15、191B5、69B17和210Q33）與其他毒株間的R也存在明顯差異。

2.4疫苗交叉保護試驗結果

依據(jù)病毒抗原性分析結果，選擇CX13、C227、C1228、C228和CWM等5株代表株與商品化疫苗SS株進行疫苗交叉保護試驗。以5株代表株制備的油乳劑滅活疫苗和商品化H9亞型AIV疫苗（SS株）分別免疫SPF雞，免疫21d后，以5株代表株的雞胚尿囊液按10?EID?/羽的劑量滴鼻感染免疫組和對照組試驗雞，其排毒情況如表5所示。對照組所有試驗雞在攻毒后第1d全部排毒，一直持續(xù)到攻毒后第5d，從攻毒后第7d起開始有所下降，且部分試驗雞開始停止排毒。商品化H9亞型AIV疫苗（SS株）免疫組試驗雞在5株代表株攻毒后7d內(nèi)均存在較高的排毒水平，C227和C1228株攻毒組甚至在攻毒后第3和5d仍有60%～80%的試驗雞存在排毒現(xiàn)象，說明商品化疫苗（SS株）對CX13、C227、C1228、C228和CWM等5株代表株的免疫保護效果不理想。C227和CX13株免疫組對其他毒株的攻毒免疫保護率在攻毒后第1d均在80%以上，且整個疫苗交叉保護試驗周期內(nèi)C227株免疫組對C1228、C228和CWM株的整體免疫保護效果優(yōu)于CX13株，表明C227株較CX13株更適宜作為疫苗候選株。

2.5免疫后抗體水平監(jiān)測結果

以5株代表株制備的油乳劑滅活疫苗和商品化H9亞型AIV疫苗（SS株）免疫SPF雞后的抗體水平變化趨勢如圖2所示。在免疫后第2周，各免疫組試驗雞的血清抗體效價均在6log2以上；至免疫后第4周，所有免疫試驗雞的血清抗體效價均達最大值，其中C227株油乳劑滅活疫苗免疫組的血清抗體效價達到12log2;從免疫后第10周開始，所有免疫試驗雞的血清抗體水平開始緩慢下降；至免疫后第24周，H9亞型AIV疫苗（SS株）及C227和CX13株油乳劑滅活疫苗免疫組試驗雞的血清抗體效價仍維持在9log2以上，其他代表株油乳劑滅活疫苗免疫組試驗雞的血清抗體效價維持在6log2以上。

3討論

由于AIV是由8個不同的獨立基因片段構成，不僅在轉錄復制過程中可能產(chǎn)生高頻率錯配形成變異株，不同亞型AIV基因節(jié)段相互交換（基因重排）時也極易產(chǎn)生新的變異株（譚偉等，2014;趙聰慧等，2019;鄭麗榮等，2019）。此外，疫苗免疫壓力使得AIV更易發(fā)生抗原漂移，導致H9N2亞型AIV在全世界范圍內(nèi)分布極廣泛，且具有頻繁變異的特點（張婷鈺，2019）。我國于1999年首次批準并使用H9N2亞型AIV滅活苗，此后H9N2亞型AIV單苗和聯(lián)苗陸續(xù)被批準生產(chǎn)和上市（Dong et al.，2022）。但近年來經(jīng)常在已免疫H9N2亞型AIV疫苗的家禽中分離出H9N2亞型AIV，且其抗原性也發(fā)生明顯變化（Li et al.，2005;邢燕茹等，2021），說明現(xiàn)有疫苗對當前流行株的免疫保護效力在逐漸下降，已無法滿足養(yǎng)殖生產(chǎn)的需要，因此亟待篩選出新的H9N2疫苗候選株用于研制新型疫苗，以應對H9N2亞型AIV變異株的防控。

HA蛋白主要誘導保護性體液免疫應答，AIV變異與HA蛋白密切相關（黃艷艷等，2018）。疫苗株的HA基因突變及抗原性差異是影響AIV疫苗免疫效果的關鍵因素之一（許傳田等，2012;丁芳等，2022），而使用當前流行株研發(fā)疫苗是預防和控制AIV流行的最有效途徑。本研究從HA基因遺傳進化分析處于不同分支的H9N2亞型AIV廣西分離株中選取12株代表株，與商品化疫苗SS株進行抗原性分析及疫苗交叉保護試驗，以期從遺傳進化和抗原交叉保護角度入手，盡可能全面評價分離株與商品化疫苗株對不同進化分支毒株的交叉免疫保護效果，篩選出新的疫苗候選株?？乖苑治鼋Y果表明，CX13、C227株與商品化疫苗SS株的R分別為0.82和0.85，無明顯差異；免疫交叉保護試驗結果表明，商品化疫苗SS株對CX13、C227株的免疫保護率分別為60%和20%。由此可見，抗原性分析對于評價疫苗保護效率研究具有一定參考價值，但不能作為疫苗候選株篩選的唯一評判標準（萬曉朋，2010），進一步證實評價疫苗保護效果必須經(jīng)過大量動物免疫保護試驗，嚴格根據(jù)毒株的抗原性和交叉免疫保護作用等多方面綜合評價結果來篩選疫苗候選株。

本研究基于HA基因遺傳進化分析結果從37株H9N2亞型AIV廣西分離株中篩選出12株H9N2亞型AIV代表株，經(jīng)抗原性和免疫原性分析發(fā)現(xiàn)C227株對其他11株代表株的R在0.72～0.93，無明顯抗原性差異，且對C1228、C228和CWM株的免疫保護效果優(yōu)于本課題組前期篩選出的CX13株（徐倩，2015），故推測C227株更適合作為H9N2亞型AIV滅活疫苗的候選株。此外，本研究發(fā)現(xiàn)野鳥源H9N2亞型AIV分離株（241B5、35B15、191B5、69B17和210Q33）與廣西地區(qū)流行的禽源H9N2亞型AIV分離株存在明顯的抗原性差異，提示今后應繼續(xù)關注野鳥源H9N2亞型AIV的抗原性變化，及時從野鳥源H9N2亞型AIV分離株中篩選出新的疫苗候選株，與禽源H9N2亞型AIV分離株聯(lián)合研制多價疫苗以提高疫苗的免疫保護效果。

4結論

基于抗原性分析和免疫原性測定篩選出的A/chicken/Guangxi/C227/2015（H9N2）株對廣西地區(qū)絕大部分H9N2亞型AIV流行株的免疫保護效果良好，可作為疫苗候選株用于研制新型H9N2亞型AIV疫苗。

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（責任編輯 蘭宗寶）