基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究綠光影響鵝胚心臟早期發(fā)育的候選基因

摘 要： 旨在通過(guò)分析鵝胚心臟在綠光光照刺激下的基因表達(dá)差異，挖掘心臟發(fā)育的候選基因。本研究將512枚鵝種蛋，隨機(jī)均分在正常黑暗孵化以及補(bǔ)充綠光的兩臺(tái)孵化機(jī)中，每臺(tái)孵化機(jī)內(nèi)放置4層（64枚·層-1），綠光孵化機(jī)提供15 min開(kāi)燈和15 min關(guān)燈的間歇光照。在孵化第13、16、20、24、28和30天時(shí)，每組隨機(jī)挑選種蛋8枚，稱取胚胎重量，分離胚胎心臟組織并稱重；采集孵化第13天的胚胎心臟組織（每組各3），進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq），篩選差異表達(dá)基因（DEGs）并進(jìn)行功能富集分析，鑒定與綠光促進(jìn)心臟發(fā)育相關(guān)的候選基因。并通過(guò)熒光定量PCR（qRT-PCR方法）驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明：綠光顯著提高16和30胚齡胚重比例（胚胎重/入孵蛋重×100）（Plt;0.05），以及13和16胚齡心臟指數(shù)（心臟重/胚胎重×100）（Plt;0.05）。心臟轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析共篩選出1 643個(gè)DEGs。隨機(jī)選擇 7個(gè)DEGs 進(jìn)行 RT-qPCR 驗(yàn)證，表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致。功能富集分析表明，DEGs 主要涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路等通路，最終篩選出GATA4、GATA5、Smad4和GHR這4個(gè)候選基因。對(duì)它們?cè)诓煌啐g階段心臟組織中的mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析，其表達(dá)模式進(jìn)一步表明了其在綠光調(diào)控心臟發(fā)育過(guò)程中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，鵝蛋孵化期綠光處理促進(jìn)了胚胎和心臟發(fā)育，進(jìn)一步通過(guò)心臟組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，鑒定到了4個(gè)鵝胚心臟發(fā)育候選基因 GATA4、GATA5、Smad4和GHR，為鵝胚心臟組織發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供了線索，并為綠光應(yīng)用于鵝種蛋孵化提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 鵝；綠光；孵化；心臟；轉(zhuǎn)錄組；GATA4

中圖分類(lèi)號(hào)：S835.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號(hào)：0366-6964（2024）05-1978-11

收稿日期：2023-09-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-42-20）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（32202622）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX（21）2013）

作者簡(jiǎn)介：陳 哲（1982-），男，山東泰安人，副研究員，博士，主要從事動(dòng)物繁育與環(huán)境控制研究，E-mail：chenzzju@163.com

*通信作者：閆樂(lè)艷，主要從事家禽繁殖調(diào)控與健康養(yǎng)殖研究，E-mail：yanleyan198469@126.com

Study on Candidate Genes for Green Light Affecting Early Development of Goose Embryo Heart Based on Transcriptome Sequencing

CHEN" Zhe1，2， QU" Xiaolu3， GUO" Binbin1，2， SUN" Xuefeng1，2， YAN" Leyan1，2*

（1.Institute of Animal Science， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014，

China;

2.Key Laboratory for Crop and Animal Integrated Farming， Ministry of Agriculture

and Rural Affairs， Nanjing 210014，" China;

3.Agricultural Genomics Institute at Shenzhen，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Shenzhen 518100，" China）

Abstract：" The aim of this study was to identify candidate genes for heart development in goose embryos by analyzing the gene expression differences in embryonic hearts tissue under green light stimulation. The 512 goose eggs were randomly divided equally into green light and dark incubators， with 4 layers and 64 eggs per layer placed in each incubator. During the entire incubation period， the green light incubator provided intermittent light regimen of 15 minutes on and 15 minutes off. On the 13， 16， 20， 24， 28， and 30 day of incubation， 8 eggs were randomly selected from each group， the embryo weight was measured， and the embryonic heart tissue was separated and weighed. The embryonic heart tissues were collected at day13 of incubation， and transcriptome sequencing （RNA-Seq） were performed. Differentially expressed genes （DEGs） were screened， and subjected to functional enrichment analysis to identify candidate genes related to green light promoting heart development. And the reliability of the sequencing results was validated using fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR）. The green light significantly increased the proportion of embryo weight at 16 and 30 embryonic ages （embryo weight/hatched egg weight×100） （Plt;0.05）， and the heart index （heart weight/embryo weight×100） at 13 and 16 embryonic ages in the green light group were significantly higher than individuals in the dark group （Plt;0.05）. A total of 1 643 DEGs were screened from the green light group and the dark group， 7 DEGs were randomly selected for RT-qPCR validation， and the expression trend was consistent with the sequencing results. Enrichment analysis showed that DEGs were mainly enriched in the PI3K-Akt signaling pathway， AMPK signaling pathway， and other pathways. Four candidate genes： GATA4， GATA5， Smad4 and GHR were ultimately screened out. Their expression in heart tissues at different embryonic ages were analyzed to further validated their regulatory role in heart development. Through the analysis of transcriptomic data of heart tissue， we identified GATA4， GATA5， Smad4 and GHR as candidate genes for goose embryonic heart development， which provide clues to the molecular regulatory mechanism of green light on embryonic heart development， and provide a theoretical basis for the application of green light in goose egg hatching.

Key words： goose; green light; incubation; heart; transcriptome; GATA4

*Corresponding author：YAN Leyan， E-mail：yanleyan198469@126.com

商業(yè)化生產(chǎn)中，禽蛋通常在閉燈黑暗環(huán)境下進(jìn)行孵化。但在自然孵化過(guò)程中，母禽會(huì)離巢采食和飲水，使得種蛋會(huì)接受一部分外界的光照刺激［1］。禽類(lèi)對(duì)光照敏感，因此在家禽生產(chǎn)中，光照調(diào)控逐漸成為調(diào)節(jié)家禽生產(chǎn)性能的重要手段［2］。在肉雞、蛋雞、鵪鶉和火雞上的研究表明，在孵化期給予禽蛋適宜的光照刺激可以影響胚胎肌肉發(fā)育、改變出雛窗口期，并對(duì)雛禽生長(zhǎng)等具有重要影響，且對(duì)家禽出殼后健康及福利生長(zhǎng)具有長(zhǎng)期效應(yīng)［3-8］。胚胎在孵化第2天便可以感受到光刺激［9-10］。進(jìn)一步研究表明，不同波長(zhǎng)的光線調(diào)控禽類(lèi)胚胎發(fā)育存在區(qū)別，而單色綠光是促進(jìn)胚胎發(fā)育的優(yōu)勢(shì)光色［11-12］。綠光改善禽蛋孵化效率的調(diào)控機(jī)制目前還不明確，本課題組最近的一項(xiàng)研究表明，綠光可能通過(guò)影響肝臟糖代謝從而促進(jìn)胚胎發(fā)育［13］，是否存在其它調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

在禽類(lèi)胚胎中，心臟是第一個(gè)發(fā)育的功能性器官［14］，孵化第2天可見(jiàn)發(fā)育成型并出現(xiàn)節(jié)律性泵動(dòng)；伴隨卵黃膜血管的發(fā)育，將血液分配到各種組織以滿足氧氣和營(yíng)養(yǎng)需求，維持胚胎體循環(huán)和能量代謝過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，孵化期1～18 d單色綠光照射（12L：12D）可極顯著提升初生肉種雞心臟相對(duì)重量［15］。此外，光照對(duì)胚胎心率水平也有潛在影響，暴露在光照條件下的體外心臟組織［16］以及光照條件下的雞胚胎心臟心率都有顯著增加［9］。因此推測(cè)，孵化期光照可以調(diào)節(jié)胚胎心臟發(fā)育，但具體的作用機(jī)制還不明確。且前期研究主要關(guān)注光照對(duì)孵化后期或出殼當(dāng)天心臟的影響［12，15］，但對(duì)心臟發(fā)育全程，尤其是胚胎早期心臟發(fā)育影響的研究較少。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）已經(jīng)在家禽研究領(lǐng)域成熟應(yīng)用，是挖掘特定環(huán)境下差異表達(dá)基因和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的有效工具［17］。我國(guó)肉鵝出欄量占世界總出欄量的94%。但鵝種蛋重量大、孵化時(shí)間長(zhǎng)、入孵操作程序繁瑣，相比于雞、鴨種蛋，鵝種蛋孵化率不高且不穩(wěn)定，因此開(kāi)發(fā)有效的孵化技術(shù)手段提高鵝種蛋孵化率非常重要。本研究擬分析綠光對(duì)鵝種蛋孵化的影響；同時(shí)，針對(duì)在鵝種蛋孵化期應(yīng)用綠光，采用轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)篩選差異表達(dá)基因，揭示綠光刺激誘導(dǎo)胚胎心臟發(fā)育的信號(hào)通路，發(fā)掘胚胎心臟發(fā)育關(guān)鍵候選基因，為綠光在鵝種蛋孵化中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

512枚泰州鵝種蛋（蛋重143.7～152.5 g，均重（147.6±0.15） g）購(gòu)自泰州金鵬鵝業(yè)專業(yè)合作社，被隨機(jī)分配到2個(gè)微電腦全自動(dòng)控制孵化機(jī)中（型號(hào)：HX-100，南京市恒信孵化設(shè)備有限公司）。對(duì)照組為正常的不補(bǔ)充光照的黑暗組（D組，256枚），試驗(yàn)組補(bǔ)充綠色光照（G組，256枚）。每臺(tái)孵化機(jī)內(nèi)放置4層蛋盤(pán)（設(shè)為4個(gè)重復(fù)），每層64枚。光源由LED燈帶（珠海雷士照明有限公司）提供，蛋殼表面光照強(qiáng)度約為36 W/m2。采用15 min開(kāi)燈和15 min關(guān)燈的間歇光照制度［18］。第1～28天每90 min翻蛋一次，第28天停止翻蛋并轉(zhuǎn)移到出雛機(jī)中。孵化第7和18天照蛋，剔除無(wú)精蛋和死胚蛋。孵化試驗(yàn)于2021年3月10日至4月9日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所孵化實(shí)驗(yàn)室完成。

在孵化第13（E13）、16（E16）、20（E20）、24（E24）、28（E28）和30天（E30）時(shí)，每組從每層的蛋盤(pán)中隨機(jī)挑選種蛋2枚，即每組共8枚，破殼后將胚胎表面的膜等剝離后稱取重量；解剖胚胎，分離心臟組織，排出心臟內(nèi)血液后稱重；采集心臟組織樣置于液氮中速凍，－80℃保存，用于后續(xù)的熒光定量PCR分析。對(duì)各時(shí)間段胚重比例（胚胎重/入孵蛋重×100）和心臟指數(shù)（心臟重/胚胎重×100）分析后，選取心臟指數(shù)差異最顯著時(shí)間段（E13）的心臟組織樣，每組各3個(gè)，－80℃保存用于開(kāi)展轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

1.2 主要試劑

Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑HiScript III RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）、熒光定量PCR試劑盒（ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix）均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR儀（Bio-Rad）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI 7500）購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3 鵝胚心臟組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

采用Trizol法提取E13階段鵝胚心臟總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，結(jié)合核酸分析儀測(cè)定總RNA的純度和濃度，選用OD值為1.8～2.0的RNA為模板，-80 ℃保存。整個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的制備和測(cè)序在Sangon Biotech（中國(guó)，上海）進(jìn)行。對(duì)測(cè)序合格的RNA使用NEBNext UltraTM RNA Library Pre Kit制備cDNA文庫(kù)，利用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)評(píng)估文庫(kù)質(zhì)量，基于Illumina Hiseq平臺(tái)，對(duì)質(zhì)檢合格的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，回收測(cè)序數(shù)據(jù)。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)的處理與分析

對(duì)獲得的原始數(shù)據(jù)（Raw reads）通過(guò)FastQC軟件進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，使用Trimmomatic消除接頭和低質(zhì)量reads，得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)（clean reads）用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。并使用Trinity軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝拼接，完整 Reads 使用Bowtie2（-bowtie2-mismatch-rate）與鵝參考基因組進(jìn)行比對(duì)?；谏鲜霰葘?duì)結(jié)果，對(duì)各個(gè)樣本中比對(duì)到參考基因組的各unigene（非重復(fù)序列）上的Reads進(jìn)行定量，并進(jìn)行FPKM（fragments per kilo base of exon model per million mapped reads）值的轉(zhuǎn)換，從而獲取各條unigene的表達(dá)水平。基于定量得到的各unigene的FPKM值進(jìn)行樣品間差異基因比較，利用DEGSeq2進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，將qlt;0.05和log2（fold change）≥1設(shè)置為差異表達(dá)基因的閾值，獲得D組和G組的差異表達(dá)基因。

對(duì)獲得的顯著差異表達(dá)基因利用基因本體論分析（Gene Ontology）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能注釋。并導(dǎo)入KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集分析，確定顯著差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證

采用Trizol法提取不同胚齡階段心臟組織的總RNA。利用HiScript III RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）將純化的 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果，選取 GATA4、GATA5、生長(zhǎng)激素受體（growth hormone receptor，GHR）、Smad4、FOX3、CYP11B1、Lipocalin等7個(gè)差異表達(dá)基因，參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)鴻雁（Anser cygnoides）基因組中的相應(yīng)基因序列，使用Primer 5.0 軟件（www. ncbi. nlm. nih. gov/tools/Primer-blast/）Primer-BLAST軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/Primer-blast/）設(shè)計(jì)基因特異性引物，并以β-actin為內(nèi)參基因（表1）。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

使用 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒和ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Applied Biosystems， 美國(guó)）進(jìn)行熒光定量驗(yàn)證。反應(yīng)體系共 20 μL：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR 擴(kuò)增程序：預(yù)變性階段為 95 ℃ 30 s；循環(huán)反應(yīng)為 95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s（40個(gè)循環(huán)）；熔解曲線為 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個(gè)樣品進(jìn)行 3 次生物學(xué)重復(fù)。

除用E13的心臟組織總RNA作為模板驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性外，還提取不同胚齡心臟組織的RNA，對(duì)GATA4、GATA5、GHR、Smad4基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)樣本重復(fù)分析3次。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用2-ΔΔCt法對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。利用 SPSS 22.0 軟件對(duì)所得表達(dá)量進(jìn)行t檢驗(yàn)分析或單因素方差分析（One-way ANOVA），以*P＜0.05 表示差異顯著，**P＜0.01 表示差異極顯著。采用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 綠光光照對(duì)鵝胚及心臟重的影響

孵化期綠光處理對(duì)鵝胚胚胎及心臟重的影響見(jiàn)圖1。對(duì)孵化期不同胚齡鵝胚及其心臟稱重的結(jié)果顯示，綠光對(duì)鵝胚胚胎發(fā)育有明顯的促進(jìn)作用，尤其在種蛋孵化至16胚齡和30胚齡時(shí)，綠光組鵝胚的胚重比例顯著高于在黑暗條件下孵化的鵝胚的胚重比例（Plt;0.05，圖1A）；其它胚胎階段綠光對(duì)胚胎發(fā)育也有促進(jìn)作用，但與黑暗組的差異不顯著。而心臟指數(shù)在鵝胚孵化至13胚齡和16胚齡時(shí)均顯著高于黑暗組中孵化的鵝胚的心臟指數(shù)（Plt;0.05，圖1B）。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

兩個(gè)組分別取孵化期E13心臟組織樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如表2所示，平均每個(gè)樣品產(chǎn)出8 872 758 550 bp原始數(shù)據(jù)（Raw reads），經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制，質(zhì)控率均在90.08%，Q30堿基百分比都在94%以上。將clean reads與鵝參考基因組（Anser cygnoides）基因組進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)率為82.66%～85.01%，表明測(cè)序數(shù)據(jù)滿足后續(xù)分析的要求。

2.3 差異表達(dá)基因及功能分析

按照顯著性qlt;0.05，表達(dá)差異倍數(shù)log2Fold Change≥1.0標(biāo)準(zhǔn)，綠光處理組和對(duì)照黑暗組鵝胚心臟組織中共篩選得到1 643個(gè)差異基因（DEGs），其中842個(gè)顯著上調(diào)基因，801個(gè)顯著下調(diào)基因（圖2）。

由圖3可知，上調(diào)差異基因主要富集到在發(fā)育過(guò)程（developmental process）、細(xì)胞進(jìn)程（cellular process）、代謝進(jìn)程（metabolic process）、對(duì)刺激的反應(yīng)（response to stimulus）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）、催化活性（catalytic activity）等GO條目。而下調(diào)差異基因富集分析結(jié)果見(jiàn)圖4，主要集中在代謝進(jìn)程（metabolic process）、生物學(xué)過(guò)程（biological process）、發(fā)育過(guò)程（developmental process）、催化活性（catalytic activity）等GO條目。

KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因共富集到240個(gè)通路。圖5列出了前30個(gè)顯著富集到的通路，主要包括PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、AMPK信號(hào)通路（AMPK signaling pathway）、黏著斑（focal adhesion）、軸突導(dǎo)向（axon guidance）、胰島素信號(hào)通路（insulin signaling pathway）、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)（regulation of actin cytoskeleton）等。包含差異基因較多的通路與心臟發(fā)育和細(xì)胞發(fā)育密切相關(guān)。

2.4 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

隨機(jī)選取出GATA4、GATA5、GHR、Smad4、FOX3、CYP11B1、Lipocalin等7個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。如圖6所示，E13階段GATA4、GATA5、GHR、Smad4、FOX3等5個(gè)基因在綠光組鵝胚胎心臟中的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于黑暗組的胚胎中的表達(dá)量（Plt;0.05），而CYP11B1、""""" Lipocalin在E13階段綠光組胚胎心臟中的表達(dá)量均顯著低于黑暗組胚胎（Plt;0.05）。qRT-PCR 結(jié)果與 RNA-Seq 測(cè)序結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)一致，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的真實(shí)性和準(zhǔn)確性。

2.5 候選基因在不同胚齡心臟組織中相關(guān)基因表達(dá)量的分析

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋、通路富集和特異性篩選，篩選出GATA4、GATA5、Smad4和GHR這4個(gè)調(diào)控心臟發(fā)育的候選基因。對(duì)候選基因在黑暗組孵化期6個(gè)階段的mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)GATA4的mRNA表達(dá)量在E16、E20、E28和E30階段鵝胚心臟組織中均顯著性高于E13階段（Plt;0.05），而在E24階段表達(dá)有一個(gè)明顯的下降（Pgt;0.05）（圖7A）。從圖7B可以看出，GATA5的mRNA表達(dá)量與GATA4表達(dá)量在趨勢(shì)基本一致，在E16、E20、E28階段心臟組織中表達(dá)量均顯著性高于E13階段（Plt;0.05）。與13胚齡的鵝胚心臟組織相比，Smad4的表達(dá)量在20和24胚齡顯著升高（Plt;0.05），在28和30胚齡時(shí)表達(dá)量略有下降，但仍明顯高于13胚齡（Plt;0.05）（圖7C）。

此外，對(duì)GHR在各胚齡心臟組織中的相對(duì)表達(dá)量也進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示：GHR基因的mRNA表達(dá)量隨著胚齡的增加而顯著增加（Plt;0.05），但在出殼前即30胚齡時(shí)有明顯的下降（圖7D）。

2.6 綠光處理對(duì)候選基因在30胚齡心臟組織中相關(guān)基因表達(dá)量的影響

此外，孵化期綠光處理，對(duì)30胚齡階段鵝胚心臟組織中GATA4、GATA5、Smad4以及GHR mRNA表達(dá)也進(jìn)行檢測(cè)。如圖8所示，與對(duì)照的黑暗條件下孵化相比，綠光孵化的鵝胚心臟組織中GATA4、GATA5、Smad4以及GHR的表達(dá)量均無(wú)顯著差異（Pgt;0.05）。這也與綠光處理對(duì)該胚齡時(shí)心臟發(fā)育指數(shù)無(wú)明顯影響的結(jié)果一致。

3 討 論

光照是影響家禽繁殖性能的重要環(huán)境因素之一，已經(jīng)在鵝的各個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)中廣泛應(yīng)用并明顯提高了鵝的產(chǎn)蛋性能［19-20］，但對(duì)于鵝種蛋孵化這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)，人工光照的應(yīng)用還十分缺乏。僅有前期的研究結(jié)果表明，孵化期綠光處理可能通過(guò)調(diào)控肝臟組織的糖代謝而促進(jìn)胚胎發(fā)育和提高出雛性能［13］。胚胎期是心臟發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，很容易受到自身基因表達(dá)變化和外界環(huán)境因素的影響而發(fā)育異常［21］。在其它禽類(lèi)上的研究指出，孵化期光照處理可以調(diào)節(jié)胚胎心臟發(fā)育［15］，但具體的作用機(jī)制還不明確。

本研究對(duì)孵化期鵝蛋綠光處理后的胚胎重量和心臟重量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)綠光促進(jìn)胚胎發(fā)育，胚重比例高于在黑暗條件下孵化的胚重比例。綠光對(duì)心臟的發(fā)育也起到促進(jìn)作用，尤其是在孵化至13胚齡和16胚齡時(shí)，心臟指數(shù)均顯著高于黑暗組中孵化鵝胚的心臟指數(shù)；但在孵化后期，對(duì)心臟指數(shù)并沒(méi)有顯著性影響。這與在肉種雞上的研究結(jié)果有些類(lèi)似，即孵化期1～18 d單色綠光照射（12L：12D）顯著提升16和21胚齡雞胚心臟的重量［15］。

進(jìn)一步對(duì)綠光孵化和黑暗中孵化第13天的鵝胚心臟組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組對(duì)比分析，篩選出1 643個(gè)差異基因，結(jié)合GO基因功能分析以及 KEGG富集分析，篩選出了GATA4、GATA5、Smad4和GHR這幾個(gè)差異表達(dá)候選基因，這些基因富集在與心臟發(fā)育和細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路上。對(duì)不同胚齡階段心臟組織中這幾個(gè)候選基因的mRNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著胚齡的增加，GATA4、GATA5、Smad4和GHR的表達(dá)都呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。而在30胚齡時(shí)，綠光組心臟組織中這幾個(gè)基因的表達(dá)量與黑暗組并沒(méi)有明顯差異，這與綠光對(duì)于這一階段心臟指數(shù)沒(méi)有明顯影響的結(jié)果一致。這些結(jié)果表明，鑒定到的差異基因可能參與胚胎心血管發(fā)育和功能，是研究綠光調(diào)控鵝胚心臟發(fā)育的候選基因。

GATA4和GATA5（GATA結(jié)合蛋白4和5）是一類(lèi)含鋅指的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)正常心臟發(fā)育和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要［22-23］。尤其是GATA4在胚胎期的作用更為重要，GATA4是心臟前體細(xì)胞出現(xiàn)的最早期標(biāo)志之一［24］，在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中表達(dá)，也在成年機(jī)體心臟中表達(dá)，缺乏GATA4的小鼠胚胎心臟形態(tài)發(fā)生缺陷，并在胚胎第8.5天死亡［25］。其基因突變可導(dǎo)致先天性心肌病［26-28］。本研究發(fā)現(xiàn)，GATA4和GATA5在各胚胎時(shí)期心臟中均有表達(dá)，且表達(dá)量呈現(xiàn)整體逐漸上升的趨勢(shì)，暗示其在鵝胚胎期心臟發(fā)育過(guò)程中均具有較為重要的作用。孵化期綠光處理后，在13胚齡時(shí)胚胎心臟指數(shù)增加的同時(shí)伴隨著GATA4和GATA5表達(dá)的增加，而在30胚齡時(shí)綠光對(duì)心臟指數(shù)以及GATA4和GATA5的表達(dá)均無(wú)明顯影響，證明GATA4和GATA5在胚胎期的心臟發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

Smads蛋白是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）超家族受體的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。Smad4是通用型的Smads，與激活的其它Smads形成異源的多聚復(fù)合物，從而發(fā)揮作用。TGF-β1/Smad4信號(hào)通路在SD大鼠胚胎心臟發(fā)育不同時(shí)期發(fā)揮著不同的作用［29］。缺失Smad4將導(dǎo)致心臟α肌動(dòng)蛋白、α肌球蛋白重鏈等表達(dá)下調(diào)，心臟表現(xiàn)為小梁結(jié)構(gòu)破壞、室間隔缺損［30］，甚至導(dǎo)致胚胎死亡［31］。本研究發(fā)現(xiàn)，Smad4基因表達(dá)量在孵化期綠光處理引起的心臟發(fā)育變化過(guò)程中存在差異，且隨著胚齡增加和心臟發(fā)育進(jìn)程，其表達(dá)量是上升的，均提示了Smad4在鵝胚心臟發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了作用。

生長(zhǎng)激素受體（GHR）是一種單鏈跨膜糖蛋白，位于動(dòng)物生長(zhǎng)軸中心位置的生長(zhǎng)激素（GH）主要通過(guò)和靶器官的GHR相結(jié)合發(fā)揮調(diào)控動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的作用［32］。在雞胚的器官發(fā)育過(guò)程中，GH和GHR均可以在胚胎的心臟中檢測(cè)到［33］。在雛鵝的心臟中也檢測(cè)到了GHR的表達(dá)，且GHR mRNA表達(dá)量的峰值出現(xiàn)在0～28 d階段，提示GHR mRNA可能主要在鵝早期生長(zhǎng)發(fā)育階段起調(diào)節(jié)作用［34］。在鵝胚階段檢測(cè)到GHR mRNA的持續(xù)表達(dá)，但在孵化后期顯著降低，這與在雞胚胎上的結(jié)果相似，即在孵化后期和出殼后的早期階段，GH下調(diào)GHR表達(dá)，使得GHR 表達(dá)急劇下降［35］。孵化期綠光刺激不僅可以增加肌肉中GHR的表達(dá)［36］，還可以增加肝臟中GHR的表達(dá)，從而加速肌肉發(fā)育并增加胚胎重量［11］。本試驗(yàn)中，在13胚齡時(shí)綠光組心臟中GHR表達(dá)高于對(duì)照的黑暗組，這與綠光促進(jìn)心臟發(fā)育的結(jié)果是相符的；而在30胚齡時(shí)，綠光對(duì)心臟發(fā)育無(wú)明顯促進(jìn)作用的同時(shí)對(duì)GHR mRNA的表達(dá)也無(wú)顯著影響。這些都證明了GHR對(duì)鵝胚的心臟發(fā)育也起到了重要的作用。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，鵝蛋孵化期綠光處理后，胚重比例和心臟指數(shù)在16胚齡時(shí)均顯著高于正常黑暗條件下孵化的鵝胚；而在30胚齡時(shí)，僅胚重比例存在顯著差異。進(jìn)一步結(jié)合RNA-Seq技術(shù)，篩選出GATA4、GATA5、Smad4、GHR可能與心臟發(fā)育相關(guān)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究種蛋孵化期綠光處理促進(jìn)鵝胚和心臟發(fā)育的分子機(jī)制提供了線索，并為綠光應(yīng)用于鵝種蛋孵化提供了理論基礎(chǔ)。

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（編輯 郭云雁）