溴氰菊酯酶聯(lián)免疫吸附分析和膠體金免疫層析分析方法的建立

摘要 制備了9 株分泌溴氰菊酯單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，選取靈敏度最高的單克隆抗體4D4E11 建立了間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法（ic-ELISA）和膠體金免疫層析分析方法（LFIA）用于檢測溴氰菊酯。ic-ELISA 的最優(yōu)工作溶液為0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（PB， NaH2PO4/Na2HPO4， pH 7.4），含20%甲醇和0.2 mol/L NaCl；LFIA 的最優(yōu)工作溶液為0.01 mol/L PB 緩沖溶液（pH 7.4），含5‰ Tween-20、10%甲醇和1 mol/L NaCl。在最優(yōu)條件下， ic-ELISA 對(duì)溴氰菊酯的半數(shù)抑制濃度（IC50）為10.60 ng/mL，檢出限（IC10）為1.43 ng/mL；LFIA 對(duì)溴氰菊酯的可視檢出限為0.5 μg/mL。特異性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， ic-ELISA 和LFIA 對(duì)溴氰菊酯的8 種結(jié)構(gòu)類似物無明顯交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)。采用Ic-ELISA 檢測番茄、結(jié)球甘藍(lán)和油麥菜添加樣品的平均回收率為79.8%～92.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～5.5%；采用LFIA 檢測番茄、油麥菜和結(jié)球甘藍(lán)添加樣品的結(jié)果與添加濃度相符。此外， ic-ELISA 和LFIA 對(duì)油麥菜盲樣中溴氰菊酯的檢測結(jié)果與高效液相色譜的檢測結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，建立的ic-ELISA 和LFIA 靈敏度高、準(zhǔn)確性好，為農(nóng)產(chǎn)品中溴氰菊酯殘留的快速檢測提供了新方法。

關(guān)鍵詞 溴氰菊酯；單克隆抗體；間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法；膠體金免疫層析法

溴氰菊酯（Deltamethrin）屬于Ⅱ型擬除蟲菊酯類殺蟲劑，被廣泛用于防治蔬菜、棉花和果樹上的甜菜夜蛾、棉鈴蟲和食心蟲等。由于有機(jī)磷等高毒農(nóng)藥逐漸被禁用或限用，溴氰菊酯在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的用量逐年增長[1]，在農(nóng)產(chǎn)品中常被檢出[2-4]，膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)大。研究表明，溴氰菊酯對(duì)鵪鶉、哥倫比亞搖蚊和斑馬魚等非靶標(biāo)生物具有發(fā)育毒性[5]、免疫毒性[6]、神經(jīng)毒性[7]、氧化毒性[8]和臟器毒性[9]。我國國標(biāo)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2763—2021）規(guī)定了溴氰菊酯在不同食品中的最大殘留限量（Maximum residue limit， MRL）為0.01～10 mg/kg[10]。因此，需加強(qiáng)對(duì)溴氰菊酯殘留的檢測，保障食品安全。

目前，檢測溴氰菊酯殘留的常用儀器分析方法包括氣相色譜-質(zhì)譜法[11-12]、高效液相色譜（HPLC）-紫外檢測法[13-14]和HPLC-質(zhì)譜法[15]等。雖然這些方法具有靈敏度高、重復(fù)性好的優(yōu)勢，但設(shè)備昂貴、樣品前處理時(shí)間長且需要專業(yè)操作人員，不能用于高通量的現(xiàn)場檢測，無法滿足農(nóng)殘現(xiàn)場快速檢測的實(shí)際需求。

基于抗原抗體識(shí)別的免疫檢測，如酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）和側(cè)流免疫層析法（Lateral flow immunoassay， LFIA）等，具有快速、簡便和經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于小分子農(nóng)藥殘留的檢測?？贵w作為免疫檢測的核心試劑，其性能影響分析方法的特異性和靈敏度?；阡迩杈挣ザ嗫寺】贵w的免疫檢測方法已有報(bào)道[16]，如Lee 等[17]制備了溴氰菊酯的多克隆抗體，并建立了ELISA 方法，其半數(shù)抑制濃度（IC50）為17.5 ng/mL， 但該方法與氯氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯和苯醚菊酯有較高的交叉反應(yīng)率（Cross-reactivity， CR），分別為37.3%、9.5%、8.5%和6.8%。與多克隆抗體相比，可針對(duì)特定表位進(jìn)行設(shè)計(jì)且來源于單個(gè)B 細(xì)胞的單克隆抗體通常具有較高的特異性[18-19]，同時(shí)具有可持續(xù)制備的優(yōu)勢。Queffelec 等[20]在溴氰菊酯芳香環(huán)上引入含有羧基的連接臂，合成了半抗原，制備出溴氰菊酯單克隆抗體，建立的間接競爭ELISA（ic-ELISA）方法的IC50 為500 ng/mL，與擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的CRlt;1%。ELISA 可同時(shí)定量檢測多個(gè)樣品，并能提供定量檢測結(jié)果。相比于ELISA， LFIA 通常只能提供半定量或定性的檢測結(jié)果，但其操作更簡單（一步法）、檢測時(shí)間更短（5～10 min），適合現(xiàn)場快速篩查[21]。目前，基于溴氰菊酯單克隆抗體的LFIA 尚未見報(bào)道。

本研究制備了溴氰菊酯的單克隆抗體，并建立了ic-ELISA 和LFIA 方法，優(yōu)化了兩種方法的檢測條件，并對(duì)其靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。此外，使用HPLC 對(duì)ic-ELISA 和LFIA 的可靠性進(jìn)行了驗(yàn)證。