基于氧化聚合規(guī)律和特征質(zhì)譜信息鑒定云南紅茶中的新型茶黃素

摘要 茶黃素類化合物（TFs）是紅茶中決定感官品質(zhì)的一類重要物質(zhì)，具有顯著的生物活性。茶葉中除了存在4 種常見的TFs 外，還存在許多其它具有類似化學結(jié)構(gòu)的茶黃素類似物（TFAs）。針對TFs 及TFAs，本研究采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜（UPLC-HRMS）技術(shù)，結(jié)合該類成分的特征結(jié)構(gòu)及一、二級質(zhì)譜信息，提出了基于氧化聚合規(guī)律和特征質(zhì)譜信息的TFAs 識別和鑒定方法。通過分析現(xiàn)有TFs 的氧化聚合過程，總結(jié)形成TFs 的理論反應(yīng)模型，并基于此計算潛在成分的前體離子值；同時，根據(jù)標準品和文獻數(shù)據(jù)分析TFs的質(zhì)譜裂解規(guī)律，總結(jié)該類成分的特征碎片離子及中性丟失碎片。最終，基于計算獲得的前體離子值以及特征碎片離子或中性丟失信息，從原始的色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)中共鑒定出36 種TFAs，其中6 種為首次報道，并采用體外合成實驗進行了部分驗證?；?6 種成分的定性和定量分析結(jié)果，采用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）研究了這些成分在紅茶加工中的變化，結(jié)果表明， TFAs 可用于有效區(qū)分紅茶發(fā)酵前后的樣品。

關(guān)鍵詞 茶黃素；氧化縮合；質(zhì)譜；中性丟失；特征碎片離子

茶黃素類化合物（Theaflavins， TFs）是紅茶中一類具有苯并卓酚酮結(jié)構(gòu)的化合物總稱[1]。TFs 與茶葉和茶湯的顏色等感官品質(zhì)密切相關(guān)[2-3]， TFs 含量越高，茶湯湯色的感官品質(zhì)評價越高[4]。此外， TFs具有抗氧化和抗癌[5-8]等多種生物活性，這主要源于其中的苯并卓酚酮子結(jié)構(gòu)和該結(jié)構(gòu)上的多羥基官能團[9]。此結(jié)構(gòu)是在紅茶加工過程中反應(yīng)前體在內(nèi)源酶的催化下發(fā)生氧化和縮合反應(yīng)產(chǎn)生的[10-14]，其中，TFs 的反應(yīng)前體均具備鄰苯二酚和鄰苯三酚的子結(jié)構(gòu)[10-14]，例如，茶黃素（Theaflavin， TF）、茶黃素-3，3′-雙沒食子酸酯（Theaflavin-3，3′-di-O-gallate， TF-3，3′-G）、茶黃素-3′-沒食子酸酯（Theaflavin-3′-di-O-gallate，TF-3′-G）和茶黃素-3-沒食子酸酯（Theaflavin-3-di-O-gallate， TF-3-G）這4 種典型TFs 的前體物質(zhì)均為兒茶素類化合物[15-16]。除兒茶素類成分外，茶葉中還富含許多同樣具有鄰苯二酚或鄰苯三酚子結(jié)構(gòu)的化合物，例如綠原酸（Chlorogenic acid， CGA）、沒食子酸（Gallic acid， GA）、咖啡酸（Caffeic acid， CA）[17]和茶沒食子素（Theogallin， TG）[18]等，這些物質(zhì)同樣符合氧化聚合產(chǎn)生TFs 的基本化學結(jié)構(gòu)。然而，這些化合物是否能夠產(chǎn)生苯并卓酚酮結(jié)構(gòu)以及紅茶中是否存在以這些化合物為前體合成的物質(zhì)尚有待進一步研究。

近年的研究表明，茶葉中還存在由兒茶素類與非兒茶素類氧化聚合產(chǎn)生的且同樣具備苯并卓酚酮結(jié)構(gòu)和顯著生物活性的茶黃素類似物（Theaflavin analogues， TFAs）。Zhang 等[19]發(fā)現(xiàn)CGA 與表兒茶素沒食子酸酯（ECG）以及表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）生成的TFs 對人體結(jié)腸癌細胞具有顯著的抑制作用。Itoh 等[20]研究表明，由EGCG 與GA 氧化聚合產(chǎn)生的TFs 具有顯著的抗肥胖及抗牙周病等活性。然而，相比于4 種典型的TFs，針對這些具有潛在生物活性的TFAs 的研究較少。因此，建立一種TFAs 的高效識別和鑒定方法具有重要的意義。

超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜（UPLC-HRMS）作為一種強大的分析工具，已被廣泛應(yīng)用于茶葉中化合物的定性與定量分析[21-22]。與紫外-可見吸收光譜法和核磁共振等技術(shù)相比， UPLC-HRMS 分析茶葉等復雜體系中的化合物時具有高靈敏度、高通量、可獲得豐富的結(jié)構(gòu)信息和定性結(jié)果較準確等優(yōu)勢[23-24]。但是，利用UPLC-HRMS 針對茶葉中的TFAs 進行深度鑒定時也存在數(shù)據(jù)復雜、標準品缺失和數(shù)據(jù)庫不完善等問題。因此，在復雜數(shù)據(jù)的挖掘鑒定過程中不僅需要利用先驗信息作為線索[25]，還需要特征質(zhì)譜信息作為鑒定佐證[26]。

如前所述， TFs 的共性特征是前體成分均具有鄰苯二酚或鄰苯三酚的關(guān)鍵子結(jié)構(gòu)，并且都通過氧化聚合反應(yīng)而形成。因此，本研究針對茶葉中富含的鄰苯二酚或鄰苯三酚型化合物及其之間的氧化聚合反應(yīng)，結(jié)合特征質(zhì)譜信息，建立了一種高效識別和鑒定包括TFAs 在內(nèi)的TFs 的UPLC-HRMS 方法。一方面，根據(jù)現(xiàn)有TFs 的氧化聚合原理總結(jié)氧化聚合反應(yīng)的規(guī)律及相應(yīng)的反應(yīng)模型，并根據(jù)該模型總結(jié)茶葉中潛在的反應(yīng)前體，進而計算出潛在的TFs 的理論分子量，根據(jù)理論分子量和UPLC-HRMS 實驗信息（例如提取離子流圖（EICs））進行靶向提取，判斷茶葉中是否存在潛在的TFAs；另一方面，將總結(jié)TFs 的特征碎片離子和中性丟失等質(zhì)譜特征裂解規(guī)律用于未知TFAs 的篩選和結(jié)構(gòu)鑒定，基于鑒定結(jié)果，通過體外合成實驗獲取從紅茶中鑒定的部分TFs，采用UPLC-HRMS 檢測技術(shù)對其進行比對驗證，并采用多元統(tǒng)計分析方法針對紅茶加工階段中的TFs 化合物進行定量及代謝分析，以期深入了解TFAs 在紅茶中的存在及分布情況。