印跡-解析電噴霧/光電離質(zhì)譜成像技術(shù)研究烤煙葉中化學成分的空間分布

摘要 利用印跡-解析電噴霧/光電離質(zhì)譜成像（IM-DESI/PI-MSI）技術(shù)對初烤后干煙葉不同部位化學成分的空間分布進行了研究，獲得了煙葉中不同化學成分的縱/橫向相對含量分布規(guī)律。采用印跡方法可將煙葉內(nèi)部化合物轉(zhuǎn)移至多孔聚四氟乙烯板的表面，實現(xiàn)對煙葉內(nèi)部物質(zhì)的檢測和可視化分析，并且經(jīng)解析電噴霧后，光電離質(zhì)譜成像技術(shù)具有對植物樣本的無極性歧視、軟電離和高電離效率等優(yōu)點，可同時檢測和成像煙葉樣本中豐富的化合物。基于高分辨質(zhì)譜共鑒定出40 種化學成分，包括植物堿、氨基酸、糖類、酸、酮和酚等。實驗結(jié)果表明，煙草的代表性化學成分如植物堿、氨基酸和糖類等，從縱向分析主要分布在近葉尖處，從橫向分析主要分布在煙葉左右邊緣；并檢測出Amadori 化合物（1-脫氧-1-L-脯氨酸-D-果糖），發(fā)現(xiàn)其含量變化與游離氨基酸（脯氨酸）的含量變化趨勢總體一致。此外，對煙草的氣候斑點病區(qū)域進行了成像研究，發(fā)現(xiàn)化合物在氣候斑區(qū)域呈特異性分布。本方法在煙葉生長應激研究方面具有優(yōu)勢。

關鍵詞 煙葉；質(zhì)譜成像；光電離；印跡；化學成分

煙草化學成分是煙草品質(zhì)形成的物質(zhì)基礎[1-3]。研究表明，煙草化學成分不僅與煙草的類型、產(chǎn)地氣候[4]、等級、成熟度[5]和部位（整顆植株上部、中部和下部）密切相關，而且在單片煙葉的不同區(qū)域內(nèi)化學成分的分布也存在較大差異。因此，在獲得整片煙葉化學成分信息的基礎上，進一步研究單片煙葉中化學成分的空間分布，對于理解煙草農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中煙草化學成分的遷移和合成，以及煙草工業(yè)中的復烤和葉組配方的精準設計都具有重要意義。

近年來，已有研究者對單片煙葉中化學成分的空間分布情況進行了研究。Thyssen 等[6]采用激光燒蝕電感耦合等離子體發(fā)射光譜方法研究了煙草莖和葉柄中Ca、Na 和K 的分布，并將分析結(jié)果與激光燒蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜法獲得的成像結(jié)果進行了比較；Wang 等[7]測量了烤煙單片煙葉中4 種常規(guī)化學成分（煙堿、糖、K+和Cl?）和28 種中性致香物質(zhì)在單片煙葉中的空間分布；Murakami 等[8]利用捆綁的針對煙草葉片進行微穿孔，并采用印跡法檢測煙草葉片中內(nèi)源性蛋白質(zhì)和病毒外殼的蛋白質(zhì)基因表達的空間分布。

質(zhì)譜成像（MSI）技術(shù)作為一種映射分子空間分布的新手段，近年來備受關注。其中，解析電噴霧電離質(zhì)譜成像（DESI-MSI）可在大氣壓環(huán)境下實施，已成為質(zhì)譜成像最常用的方法[9]。本研究組在前期工作中，基于DESI-MSI 技術(shù)構(gòu)建了一種印跡-解析電噴霧/二次光電離質(zhì)譜成像（IM-DESI/PI-MSI）方法，應用于新鮮植物葉片分子成像[10]。該方法通過對植物葉片施加壓力，將分析物從植物表面轉(zhuǎn)移到多孔聚四氟乙烯薄膜，保留了植物樣品的空間完整性。將真空紫外光電離與DESI 結(jié)合，可解決DESI 的電離極性歧視和復雜生物條件下的離子抑制問題[11]。

本研究利用IM-DESI/PI-MSI 技術(shù)對初烤后的干煙葉進行橫向和縱向的局部成像分析，獲得了烤煙中部分化合物的空間分布規(guī)律，進一步考察了IM-DESI/PI-MSI 對煙葉氣候斑點病區(qū)域的成像效果，為分析煙草化學成分在單片煙葉中的分布提供了一種直觀且準確的方法，有助于改進煙草生產(chǎn)加工工藝，提高煙草產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑和材料

Agilent 6224 精確質(zhì)量飛行時間質(zhì)譜（美國Agilent 公司）；HWS-80B 恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海坤天實驗室儀器有限公司）；MGC101H 2D 精密電控移動平臺（北京北光世紀儀器有限公司）；PKS 106 直流激發(fā)光離子化燈（英國Heraeus 公司）。

甲醇和甲苯（HPLC 級，德國Merk 公司）；三氟乙酸（優(yōu)級純，美國Sigma-Aldrich 公司）；霧化氣體氮氣（超高純，南京特種氣體廠有限公司）；

多孔聚四氟乙烯（PTFE）板（厚度1.6 mm，孔隙率36%，孔徑7 μm，德國Berghof 集團）。初烤煙葉片樣品（長度（60±3） cm；產(chǎn)地：云南文山，“云煙87”品種、B2F 等級，大田規(guī)范化栽培）。

1.2 實驗方法

1.2.1 印跡方法

煙葉葉片的光學圖像由數(shù)碼顯微鏡拍攝。圖1 是印跡多孔PTFE 板制作和DESI/PI-MSI 實驗流程圖。以煙葉樣本縱向的印跡過程為例，首先，將煙葉置于22 ℃和相對濕度為70%的恒溫恒箱中平衡6 h后，煙葉較濕潤且有韌性；將煙葉鋪展開，沿葉尖到葉基的縱向近等距離選取8 個區(qū)域，使用內(nèi)徑為3 mm 的圓形打孔器在各區(qū)域內(nèi)橫向截取3 個切片，共獲得24 個直徑為3 mm 的切片；將24 個切片置于上述恒溫恒濕箱中平衡12 h， 使所有煙葉圓片的濕度保持一致。平衡結(jié)束后，將樣品擺放在一塊多孔PTFE 板上，并在樣品上方覆蓋幾層薄紙，減少煙葉內(nèi)物質(zhì)離域；將兩塊鋁板分別放置在薄紙上方和PTFE 板下方，通過壓片機在鋁板上逐漸施加約4 MPa 的壓力，獲得煙葉在多孔PTFE 板表面的印跡。

1.2.2 質(zhì)譜成像方法

成像系統(tǒng)由DESI/PI 組件、2D 精密電控移動平臺和Agilent 6224 飛行時間質(zhì)譜組成，其中， DESI/PI組件包括DESI 噴霧器和二次光電離裝置。DESI 噴霧器由2 個同軸石英毛細管組成（內(nèi)部毛細管：i.d. 50 μm， o.d. 150 μm；外部毛細管：i.d. 250 μm， o.d. 350 μm）， 噴霧溶劑為甲醇-甲苯-三氟乙酸（70∶30∶0.1， V/V），噴霧電壓3500 V。實驗過程中，打開光電離源（氪直流放電燈），在1.3 MPa 霧化氣N2的輔助下，將霧化溶劑以53°入射角噴射（3 μL/min）到組織切片表面進行樣本解析。

印跡后的PTFE 板通過雙面膠粘于載玻片上，當DESI 噴霧針對PTFE 板上的印跡區(qū)域進行解析時，加熱傳輸管道（i.d. 0.5 mm， o.d. 0.16 mm， 250 ℃）， 以15°的傾斜角將解析的化合物吸入二次光電離裝置內(nèi)，未電離的中性分子在管狀光電離室中由真空紫外光進一步離子化，再進行質(zhì)譜檢測。成像時， X 方向電控移動平臺掃描速率為0.37 mm/s，質(zhì)譜的采樣頻率為2 spec/s， Y 方向行間距為0.2 mm。成像空間分辨率約為200 μm， 所有操作均由LabVIEW 自編程控制軟件控制。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理方法

利用開源軟件MSConvert 和imzMLConverter 將多條掃描線獲取的數(shù)據(jù)文件合并為imzML 文件，然后由MSireader 軟件打開并讀取，以實現(xiàn)各種離子的可視化分析。不同物質(zhì)在特定區(qū)域的平均信號強度可通過成像軟件中手動定義感興趣的區(qū)域（ROI）功能進行定義，并導出用于分析。本研究利用ROI 功能對不同樣品圓區(qū)域分別進行化合物的平均信號強度提取，并計算出每個位置點裁剪的3 個樣品圓的平均信號強度，用于分析化合物在煙葉不同區(qū)域的含量分布規(guī)律。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜圖及質(zhì)譜峰的定性分析結(jié)果

在正離子模式下，利用IM-DESI/PI-MSI 方法獲得初烤干煙葉的質(zhì)譜圖見圖2，通過精確質(zhì)荷比（m/z）、同位素豐度、相關文獻和“中國煙草科學技術(shù)數(shù)據(jù)庫”（https：//sjk.ztri.com.cn/tobacco/index.jsp）等對檢測到的主要質(zhì)譜峰進行定性分析，共鑒別出40 種化合物，包括生物堿、氨基酸、糖類、醇、酮、酯、醛、酚、酸和胺等，基本涵蓋了大部分常見的煙草化學成分類別（見電子版文后支持信息表S1）。

2.2 煙葉化學成分強度縱向分布情況

圖3A 為煙葉葉片縱向取樣位置點示意圖，圖3B 為印記后12 種代表性化學物質(zhì)的質(zhì)譜成像圖，可以通過顏色差異直接觀察每種物質(zhì)從葉尖到葉基處的含量變化。相較于色譜-質(zhì)譜分析方法獲取上述化學物質(zhì)在不同部位的相對含量，質(zhì)譜成像可直觀展示化學成分在樣品表面的強度分布信息，從而實現(xiàn)樣本不同部位化學組分的半定量分析。

圖3C 是取樣點1～8 處5 種植物堿（煙堿烯、去氫新煙堿、煙堿、N′-甲?；禑焿A和（R，S）-N-乙基降煙堿/N′-甲基假木賊堿）在煙葉葉面的縱向強度分布圖（信號強度為每個取樣點3 個切片成像后的平均信號強度，下同）。植物堿含量是決定煙葉內(nèi)在品質(zhì)的要素，對煙葉的生理強度、吃味、刺激性和煙葉香氣都有重要影響[12]。煙草植物堿的主要成分包括煙堿和去氫新煙堿等，其含量過高或過低都會導致煙葉化學成分含量不協(xié)調(diào)，降低可用性。二烯煙堿是煙堿的代謝產(chǎn)物，是一種重要的次要煙草生物堿。煙草中只存在微量的N′-甲?；禑焿A和（R，S）-N-乙基降煙堿/N′-甲基假木賊堿，兩者是煙草和卷煙煙氣最重要的化學成分之一，影響卷煙的香氣量、濃度和刺激性，同時還是煙草特有亞硝胺（TSNAs）的前體物質(zhì)。煙堿在煙葉不同位置的含量不同，如圖3C 中藍色折線所示，煙堿在煙葉的近葉尖處含量最高，從葉尖到葉中處含量逐漸降低，在葉中和近葉基處煙堿含量變化較平緩。除煙堿外，其它植物堿含量相對較低，由葉尖至葉基方向變化整體趨勢與煙堿一致。

圖3D 是5 種氨基酸（L-脯氨酸、3-（N-亞硝基-N-甲氨基）丙酸/天門冬酰胺、5-氨基-羥基戊酸、谷氨酸和α-氨基己二酸）在煙葉葉面的縱向強度分布圖。氨基酸作為煙草中一類重要的含氮化合物，其組成和含量與煙葉的品質(zhì)密切相關，每種氨基酸對香味的貢獻值不同，常作為檢測煙葉品質(zhì)的重要指標[13]。有研究表明，煙葉經(jīng)烘烤后，其游離氨基酸的總量顯著增加，主要來自于脯氨酸的貢獻[14]，這與本研究觀察到的脯氨酸的含量遠高于其它游離氨基酸的現(xiàn)象一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)脯氨酸在近葉尖處含量最高，從葉中到近葉基處含量持續(xù)下降。5-氨基-羥基戊酸和谷氨酸從葉尖到葉基處的含量變化趨勢與脯氨酸相似。α-氨基己二酸在近葉尖處含量最高，從近葉尖到葉中處含量降低，從葉中到葉基處含量基本無變化。3-（N-亞硝基-N-甲氨基）丙酸/天門冬酰胺是另一種氨基酸成分，在煙葉中的整體含量較低，從葉尖到葉基處含量分布較均勻。

美拉德反應是煙葉烘烤過程中香味物質(zhì)形成的主要途徑之一。Amadori 化合物是美拉德反應中醛糖和不同氨基酸通過縮合、脫水、重排而得到的一類穩(wěn)定產(chǎn)物，在香氣、風味和顏色的形成過程中發(fā)揮了核心作用[15-17]。研究烘烤后煙葉中Amadori 化合物的含量變化趨勢對提高煙葉的感官品質(zhì)具有重要意義。如圖3E 所示，作為脯氨酸與葡萄糖發(fā)生美拉德反應的Amadori 化合物， 1-脫氧-1-L-脯氨酸-D-果糖在烘烤后煙葉縱切的含量變化趨勢與脯氨酸的含量變化趨勢總體一致，即近葉尖處最高，近葉尖處到近葉基處含量持續(xù)下降，與文獻[18]的結(jié)果一致。Amadori 化合物是在烘烤過程中產(chǎn)生的，因烘烤過程中淀粉降解生成的葡萄糖含量充足，底物氨基酸含量差異是影響Amadori 化合物含量差異的主要因素，因此， Amadori 化合物含量變化與烤后煙葉中游離氨基酸含量變化的總體趨勢一致。

糖類物質(zhì)是煙草中一類重要物質(zhì)，是構(gòu)成植物骨架和網(wǎng)絡的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，也是影響煙氣醇和性的重要因素。糖類物質(zhì)含量在適宜范圍內(nèi)可降低煙氣吃味強度，減輕刺激性和苦味，改善余味，對卷煙產(chǎn)品的香氣與品質(zhì)有重要影響[19]， 1-[1′-（2′S）-降煙堿]-1-脫氧-β-D-呋喃果糖是煙草中重要的糖類物質(zhì)，分析此物質(zhì)在烘烤后煙葉中的含量變化對開發(fā)卷煙新配方以及卷煙加工具有指導意義。如圖3E 所示， 1-[1′-（2′S）-降煙堿]-1-脫氧-β-D-呋喃果糖在近葉尖處含量最高，從近葉尖到近葉基處含量緩慢降低后趨于平緩。

通過分析不同化合物從葉尖端到葉基端的分布趨勢可發(fā)現(xiàn)，植物堿類、氨基酸類和糖類等化學物質(zhì)在烤煙尖端的含量相對較高。

2.3 煙葉化學成分強度橫向分布情況

為探究煙葉成分橫向分布規(guī)律，沿煙葉橫向最寬葉腰部從左側(cè)外緣到右側(cè)外緣繞開主脈近等距離選取8 個區(qū)域（圖4A）。圖4B 展示了印記后12 種代表性化學物質(zhì)的質(zhì)譜成像圖。

圖4C 是橫向取樣位置點1～8 處5 種植物堿在煙葉葉面的強度分布圖。其中，煙堿從葉梗到左邊緣的含量逐漸增加，從葉梗到右邊緣的含量先減少后增加，并且在左右邊緣處含量最高。煙堿烯、去氫新煙堿、N′-甲酰基降煙堿和（R，S）-N-乙基降煙堿/N′-甲基假木賊堿等植物堿物質(zhì)雖整體含量較低，但從葉梗到葉邊緣的含量變化趨勢與煙堿基本一致。

圖4D 是橫向取樣位置點1～8 處5 種氨基酸在煙葉葉面的強度分布圖。其中，脯氨酸從葉梗到左邊緣的含量逐漸增加，從葉梗到右邊緣的含量先減少后增加，并且在左右邊緣處含量最高。5-氨基-羥基戊酸從葉尖到葉基處的變化趨勢與脯氨酸相似。3-（N-亞硝基-N-甲氨基）丙酸/天門冬酰胺、谷氨酸和α-氨基己二酸3 種物質(zhì)從左邊緣到葉梗的含量都逐漸降低，但從葉梗到右邊緣的含量表現(xiàn)出差異：3-（N-亞硝基-N-甲氨基）丙酸/天門冬酰胺含量先減少后增加；谷氨酸含量緩慢下降；α-氨基己二酸含量分布均勻?？傊?， 3 種物質(zhì)的含量在煙葉左右邊緣處最高。

如圖4E 所示， Amadori 化合物1-脫氧-1-L-脯氨酸-D-果糖在烘烤后煙葉中的含量橫向分布變化趨勢與脯氨酸的含量變化趨勢總體一致，從葉梗到左邊緣的含量逐漸增加，從葉梗到右邊緣的含量先減少后增加，在左右邊緣處的含量最高。1-[1′-（2′S）-降煙堿]-1-脫氧-β-D-呋喃果糖在煙葉橫向的分布規(guī)律為從葉梗到左邊緣的含量逐漸增加，從葉梗到右邊緣的含量先減少后增加，在左右邊緣處的含量最高。

圖4C、4D 和4E 中化合物含量變化趨勢不是完全以葉梗左右對稱的，有很多影響因素，包括煙草的栽培環(huán)境、自身生長發(fā)育和形態(tài)特征，以及煙葉的烘烤條件（溫度、時間、濕度和烤架位置）等，這些因素可導致烤煙中物質(zhì)的分布出現(xiàn)某些偏離。此外，在實驗操作中裁剪的樣品區(qū)域應盡量避開煙葉的脈絡，導致位置點1～4 與位置點8～5 的選取并不是嚴格關于葉梗左右對稱的，這也會影響折線圖中化合物的含量關于葉梗的對稱性。分析典型化合物在煙葉橫向的含量趨勢變化發(fā)現(xiàn)，植物堿類、氨基酸類和糖類等化學物質(zhì)在烤煙葉的左右邊緣處的含量相對較高。

2.4 煙葉氣候斑的IM-DESI/PI-MSI結(jié)果

煙草氣候斑點?。═obacco weather fleck）是一種由空中臭氧引起的非侵染性病害，易發(fā)生在煙葉生長發(fā)育的旺盛階段，通常表現(xiàn)為煙葉上出現(xiàn)不規(guī)則的黑斑、黃斑或棕斑，嚴重影響煙葉的質(zhì)量和產(chǎn)量[20-22]。本研究采用IM-DESI/PI-MSI 對煙草氣候斑點病區(qū)域化學成分分布進行了研究。

圖5A 是煙葉氣候斑位置示意圖，圖5B 是圖5A 中煙葉氣候斑點區(qū)域的放大光學圖像，圖5C～圖5U是正離子模式下在氣候斑附近檢測到的代表性化合物的成像圖。由成像圖可見，大多數(shù)化合物在氣候斑區(qū)域分布很少，甚至無分布，這是因為在烤后煙葉中，氣候斑點處的總氮、煙堿、鉀離子、總糖和游離氨基酸含量均下降[ 22]。植物堿類物質(zhì)如煙堿烯（m/z 159.09）、去氫新煙堿（m/z 161.11）、煙堿（m/z 163.12）、N′-甲?；禑焿A（m/z 177.10）、（R，S）-N-乙基降煙堿/N′-甲基假木賊堿（m/z 177.14），以及氨基酸類物質(zhì)如L-脯氨酸（m/z 116.07）、5-氨基-羥基戊酸（m/z 134.08）、谷氨酸（m/z 148.06）和α-氨基己二酸（m/z 162.08）等的分布十分相似，即氣候斑區(qū)域物質(zhì)含量少，周圍以及正常煙葉局部區(qū)域分布較多。Amadori 化合物如1-脫氧-1-L-脯氨酸-D-果糖（m/z 260.11）和1-[1′-（2′S）-降煙堿]-1-脫氧-β-D-呋喃果糖（m/z 293.15）除在中間氣候斑區(qū)域基本無信號外，在其余煙葉區(qū)域信號分布比較均勻。此外，還發(fā)現(xiàn)了其它化合物的特異性分布，如物質(zhì)m/z 193.05 主要分布在氣候斑一圈， m/z 203.15、217.16 和291.22 等物質(zhì)在氣候斑外一圈和周圍區(qū)域呈點狀分布，這可能與植物應激引起的代謝異常有關。研究這些化合物在氣候斑區(qū)域的特異性分布，可為進一步探究病害機理、深入了解發(fā)病規(guī)律以及制定防治措施等提供科學依據(jù)。

3 結(jié)論

采用IM-DESI/PI-MSI 在敞開環(huán)境下對初烤干煙葉進行局部成像，同時獲得多種化合物在煙葉不同位置的濃度梯度，研究了烤煙葉片中一些代表性化學成分的空間分布規(guī)律。采用印跡方法可將煙葉內(nèi)部化合物轉(zhuǎn)移至印跡板的表面，可實現(xiàn)對煙葉內(nèi)部物質(zhì)的檢測和分析，并且DESI/PI-MSI 技術(shù)具有對植物樣本無極性歧視、軟電離和高電離效率等優(yōu)點，可同時檢測和成像煙葉樣本中豐富的化合物，包括植物堿、氨基酸、糖類、酸、酮和酚等?？疾炝藷煵葜参镏写硇曰衔镌谌~片縱向和橫向的化學成分空間分布，對于煙葉中的植物堿、氨基酸和糖類等物質(zhì)，縱向分析表明其主要分布在葉尖端，橫向分析表明其主要分布在煙葉的左右邊緣。最后，對煙葉氣候斑點病區(qū)域進行了成像研究，發(fā)現(xiàn)化合物在氣候斑區(qū)域呈特異性分布。研究結(jié)果表明， IM-DESI/PI-MSI 技術(shù)可為分析煙草化學成分在單片煙葉中的分布提供一種直觀且準確的方法，為煙草種植和加工提供更加科學的指導，有助于優(yōu)化煙草的生產(chǎn)流程和質(zhì)量控制。

References

[1] MO Min， LIANG Hai-Ling， YANG Fang， MAN Jie， HAN Wei. Chem. Eng. Manage. ， 2020， 27： 53-54.

莫敏， 梁海玲， 楊芳， 滿杰， 韓偉. 化工管理， 2020， 27： 53-54.

[2] YANG Yang， PENG Qian-Rong， ZHANG Xiao-Min， LIU Su-Can， WU You-Xiang， LV Da-Shu， XU Hong-Qing， ZHANG Ya-Heng， OU Ming-Yi. J. Food Saf. Qual. ， 2018， 9（20）： 5416-5422.

楊洋， 彭黔榮， 張曉敏， 劉素參， 吳有祥， 呂大樹， 許洪慶， 張亞恒， 歐明毅. 食品安全質(zhì)量檢測學報， 2018， 9（20）： 5416-5422.

[3] PENG Y H， BI Y M， DAI L， LI H F， CAO D P， QI Q J， LIAO F， ZHANG K， SHEN Y D， DU F Q， WANG H. ACS Omega，2022， 7（30）： 26407-26415.

[4] YANG Jun-Jie， SHI Hong-Zhi， WANG Hong-Li， WEI Yue-Hui， Xu Dong-Ya， ZHAO Yi-Duo. J. Henan Agric. Univ. ， 2015，49（2）： 158-165.

楊軍杰， 史宏志， 王紅麗， 危月輝， 許東亞， 趙藝多. 河南農(nóng)業(yè)大學學報， 2015， 49（2）： 158-165.

[5] LIU A M， YUAN K L， LI Q， LIU S Z， LI Y H， TAO M L， XU H Q， TIAN J K， GUAN S S， ZHU W. Plant Physiol. Biochem. ，2022， 192： 308-319.

[6] THYSSEN G M， HOLTKAMP M， KAULFUERST-SOBOLL H， WEHE C A， SPERLING M， VON SCHAEWEN A， KARSTU. Metallomics， 2017， 9（6）： 676-684.

[7] WANG J A， YANG G H， LI C X. Phytochem. Lett. ， 2018， 24： 125-130.

[8] MURAKAMI T， TAYAMA R， NAKAHARA K S. J. Gen. Plant Pathol. ， 2016， 82（5）： 254-260.

[9] YANG Peng-Yuan， LIU Ying-Chao， ZHAO He-Yu， LI Shun-Xiang. Sci. China Life Sci. ， 2020， 50（11）： 1237-1255.

楊芃原， 劉穎超， 趙和玉， 李順祥. 中國科學： 生命科學， 2020， 50（11）： 1237-1255.

[10] WU L T， QI K K， LIU C Y， HU Y H， XU M G， PAN Y. Anal. Chem. ， 2022， 94（43）： 15108-15116.

[11] LIU C Y， QI K K， YAO L， XIONG Y， ZHANG X， ZANG J Y， TIAN C L， XU M G， YANG J Z， LIN Z K， LV Y M， XIONGW， PAN Y. Anal. Chem. ， 2019， 91（10）： 6616-6623.

[12] HE Chun-Rong， YANG Yu-Hong， LI Jun-Hui， LAO Cai-Lian. Spectrosc. Spectral Anal. ， 2017， 37（10）： 3088-3093.

何春榮， 楊宇虹， 李軍會， 勞彩蓮. 光譜學與光譜分析， 2017， 37（10）： 3088-3093.

[13] WANG Ai-Hua， WANG Song-Feng， XU Yong-Xing， SUN Shuai-Shuai， HU Xi-Hao， TAI Zhen-Yi， KAN Jing-Jun， WANG Quan-Ming， LIU Zhi-Qiang， LIU Guo， LI Xin-Quan， XU Gang， FU Shun， SUN Fu-Shan， FENG Jun-Xi. Chin. Tob. Sci. ，2014， 35（3）： 67-73.

王愛華， 王松峰， 許永幸， 孫帥帥， 胡希好， 邰振益， 闞京軍， 王全明， 劉志強， 劉國， 李新全， 徐剛， 付順， 孫福山， 馮俊喜. 中國煙草科學， 2014， 35（3）： 67-73.

[14] DONG Hong-Xu， YUAN Shuai， XU Lei， LIU Wei， SONG Ji-Zhen. J. Henan Sci. Technol. ， 2020， （13）： 41-44.

董洪旭， 袁帥， 徐磊， 劉偉， 宋紀真. 河南科技， 2020， （13）： 41-44.

[15] WEI Xiao-Kai， LUO Xiao-Bing， ZHAO Jie， YAO Zhong-Hu. Botanical Res. ， 2023， 12（2）： 103-112.

魏曉凱， 羅小兵， 趙杰， 姚忠虎. 植物學研究， 2023， 12（2）： 103-112.

[16] SU Yu， WANG Yu-Ping， YANG Hong-Qi， YANG Jia-Mei， CHEN Yi， WU You-Xiang. Chin. Agric. Sci. Bull. ， 2016， 32（7）：179-184.

蘇宇， 王玉平， 楊虹琦， 楊佳玫， 陳頤， 吳有祥. 中國農(nóng)學通報， 2016， 32（7）： 179-184.

[17] WANG Rong-Hao， LI Lin-Lin， CHEN Dong， JIA Bao-Shun， LI Meng， SHI Xiang-Dong. Sci. Technol. Food Ind. ， 2019，40（3）： 345-350， 356.

王榮浩， 李林林， 陳棟， 賈寶順， 李猛， 時向東. 食品工業(yè)科技， 2019， 40（3）： 345-350， 356.

[18] ZHANG Jie， ZHAO Hui-Na， ZHU Wen-Jing， WU Sheng-Jiang， YANG Hui， SU Xian-Kun， ZHANG Xiao-Lian， XU Dong-Qing， LEI Bo. Tob. Sci. Technol. ， 2021， 54（11）： 25-31.

張婕， 趙會納， 朱文靜， 武圣江， 楊慧， 蘇賢坤， 張孝廉， 許冬青， 雷波. 煙草科技， 2021， 54（11）： 25-31.

[19] BANO?I? M， JOKI? S， A?KAR ?， BLA?I? M， ?UBARI? D. Molecules， 2020， 25（7）： 1734.

[20] XU S S， LIU X R， ZHANG J， XIAO L Y， ZHAO L J， LI C Y， DONG W H， YANG G H. J. Basic Microbiol. ， 2023， 63（2）：200-209.

[21] SUN M L， SHI C H， HUANG Y， WANG H C， LI J J， CAI L T， LUO F， XIANG L G， WANG F. Front. Microbiol. ， 2023， 13：1081576.

[22] ZHANG Shu-Ting， DONG Quan-Xiong， WU Xian-Hua， DING Wei. Plant Doctor， 2015， 28（4）： 50-51.

張淑婷， 董全雄， 吳先華， 丁偉. 植物醫(yī)生， 2015， 28（4）： 50-51.