磁性微球在循環(huán)腫瘤細胞和病毒以及核酸分離富集和檢測分析中的應(yīng)用進展

摘要 磁性微球是一種多用途復(fù)合材料，通常以纖維素、殼聚糖、二氧化硅以及聚苯乙烯等生物兼容性好的材料為包覆載體，通過表面的活性基團（—OH、—COOH、—NH2 和—SH 等）負載熒光分子、抗體和核酸等，可以特異性識別癌細胞、病毒和遺傳物質(zhì)。借助其自身優(yōu)異的磁響應(yīng)特性，磁性微球可實現(xiàn)快速分離和富集，在免疫分析、細胞分離以及環(huán)境檢測等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景；磁性微球還可與微流控芯片等結(jié)合，構(gòu)建高通量檢測平臺。本文介紹了近5 年來磁性微球在循環(huán)腫瘤細胞檢測、病毒抗原抗體和核酸檢測等前沿分析領(lǐng)域中的應(yīng)用進展，并討論了以磁性微球以及以其為載體開發(fā)的檢測分析試劑盒的商業(yè)化前景。

關(guān)鍵詞 磁性微球；循環(huán)腫瘤細胞；病毒抗原；核酸檢測；評述

磁性微球也稱磁珠（Magnetic beads， MB），是一種由纖維素、殼聚糖、聚苯乙烯或二氧化硅等材料包覆磁性納米顆粒（NPs）制備而成的復(fù)合材料。由于包覆的納米顆粒一般小于20 nm， 磁性微球具有超順磁性，磁響應(yīng)強且只在外界磁場下表現(xiàn)出磁性，避免了鐵磁性微球的不可逆聚集。磁性微球的商品化程度很高，較成功的案例是挪威Ugelstad 教授于1987 年開發(fā)的Dynal?系列[1-2]。該磁性微球制備涉及多步溶脹，通過添加制孔劑，制得單分散的多孔聚合物微球。然后，通過聚合物官能團（如環(huán)氧乙烷等）修飾，吸附Fe2+和Fe3+，最終實現(xiàn)Fe3O4 納米粒子（～8 nm）在聚合物微球孔中的原位沉降。通過該方法可制備含鐵量高達25%的單分散的磁珠[3]。然而，該方法步驟復(fù)雜，目前市面上尚無成功復(fù)現(xiàn)的產(chǎn)品。也可采用多層夾心結(jié)構(gòu)的Magnefy?制備磁珠，實現(xiàn)很高的磁負載量，但是微球尺寸偏差較大。

磁珠具有高比表面積，不僅可通過共聚、表面改性等方式引入多種活性基團（如—OH、—COOH、—NH2 和—SH 等），也可通過共價鍵結(jié)合大量熒光探針、生物抗體和適配體等方式，構(gòu)建生物分析載體，進而可以利用磁珠優(yōu)異的磁響應(yīng)特性，實現(xiàn)分離和富集，在細胞分離和標(biāo)記、蛋白質(zhì)和核酸分離提純以及免疫分析等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用用景。此外，磁珠還可與微流控芯片等裝置結(jié)合，進一步提高檢測的通量。因此，磁珠在循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）、抗體抗原、核酸檢測以及分離和提純等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本文主要總結(jié)了近5 年來磁珠在CTCs、病毒抗原抗體和核酸檢測方面的最新研究進展，并對其未來的發(fā)展前景進行了展望。

1 磁微球用于CTCs 檢測

CTCs 是從腫瘤邊緣脫落，進入外周血的各種腫瘤細胞的統(tǒng)稱。由于CTCs 可出現(xiàn)在癌癥早期，甚至早于實體瘤，可作為早期腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物[4-6]，因此， CTCs 計數(shù)和檢測對于評估腫瘤進展、預(yù)后以及個體化治療方案的制定和實施至關(guān)重要。CTCs 數(shù)量極少，在50 億個紅細胞和1000 萬個白細胞中只有幾個CTCs[7-8]，因此，需要利用其與正常細胞之間的物理特征、形態(tài)學(xué)（如大小、密度、變形性和電荷）或特定生物學(xué)特性（如腫瘤細胞表面標(biāo)志物表達）差異進行分離和富集。常見的分離和富集方法包括免疫捕獲法、生物物理特性富集法以及二次分離法等[9]。其中，生物物理特性富集法的富集效率較低，并且容易堵塞過濾裝置；二次分離方法的操作比較復(fù)雜，需要手動操作顯微鏡尋找染色的CTCs。其它方法，如微流控法，其優(yōu)點在于通量大，但存在層流， CTCs 與通道表面抗體的接觸不充分，捕獲效率低，因此需要采用更有效的通道設(shè)計方案；靜脈留置針采樣法是將留置針在血管中留置一段時間，彌補了傳統(tǒng)抽取外周血捕獲CTCs 時血液樣品量不足的缺點，而且原位采集能保證CTCs 維持原始特性，避免多次洗滌帶來的細胞活性損失，假陽率顯著降低，但是該方法操作復(fù)雜且檢測成本高。與上述方法相比，基于磁性顆粒的磁分離免疫捕獲法具有操作簡單、可與其它技術(shù)和鑒定方法耦合等優(yōu)點。

基于磁性顆粒的磁分離方法的主要機理是：磁性顆粒表面修飾的特異性識別分子與CTCs 結(jié)合后，在外部磁場的作用下可定向移動；去除磁場后，捕獲的CTCs 被釋放出來。磁分離技術(shù)易與其它技術(shù)聯(lián)用，如結(jié)合微流控器件的磁分離技術(shù)兼具微芯片和磁選的優(yōu)點，可高效捕獲CTCs；同時，利用外部磁場進行磁珠回收，成本大幅降低。不同形狀的磁性顆粒對細胞內(nèi)化和腫瘤積累的效果不同[ 10- 11]。Chang 等[12]設(shè)計了球狀和棒狀的磁性熒光微粒，并在表面修飾上皮細胞黏附分子（EpCAM）抗體，用于臨床血液樣本中CTCs 的分離和檢測。結(jié)果表明，棒狀顆粒比球狀顆粒具有更快的分離速度和更好的性能。傳統(tǒng)方法常采用免疫磁珠分離CTCs，需要機械攪拌混合磁珠和試樣，會導(dǎo)致細胞損傷。Yu 等[13]開發(fā)了一種免疫浮動微球（FIMMs）及其配套的操縱裝置（圖1A）用于CTCs 捕獲。該微球的密度較低，在常規(guī)樣品中可以懸浮，通過調(diào)控磁力實現(xiàn)其在血液樣本中的移動。在微球表面修飾特異性抗體能夠選擇性捕獲CTCs，借助旋轉(zhuǎn)磁力操縱裝置可以更有效地引導(dǎo)和操縱微球，提高捕獲效率。該設(shè)備捕獲CTCs 的效率最高可達到93%，檢出限低至5 cell/mL。

CTCs 通常可表達多種生物標(biāo)志物，因此，基于兩種或兩種以上抗體或靶向探針的多重識別方式可彌補單個抗體識別的不足，有效地增強其對罕見CTCs 的捕獲，如低EpCAM 表達的腫瘤細胞[14-15]。當(dāng)EpCAM 的表達在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中丟失或者下調(diào)時，可能會顯著降低CTCs 的檢測靈敏度?；贓pCAM 的CELL Search 平臺僅能在1/3 的Ⅳ期非小細胞肺癌患者中檢測到CTCs?；诖耍?Gao 等[16]開發(fā)了一種基于EpCAM、Ⅰ型跨膜糖蛋白（MUC1）和表皮生長因子受體（EGFR）3 種識別分子組合的免疫磁珠，用于回收來自血液樣品中93.35%的H446 細胞，并且在近90%的肺癌患者中檢測到CTCs。Chen 等[17]在Fe3O4 微球表面修飾EpCAM 和波形蛋白（Vimentin）的識別分子（圖1B），用于捕獲CTCs，在模擬血液環(huán)境中的捕獲效率高達90.85%，在肺癌患者中檢測到的平均CTCs 數(shù)量為12.47/7.5 mL， 明顯高于傳統(tǒng)的基于EpCAM 的CTCs 檢測值[18]。

陽性富集策略捕獲CTCs 時會被白細胞嚴重污染，采用洗滌步驟雖然可以減少污染，但是會導(dǎo)致CTCs 丟失或犧牲細胞活性，而CTCs 的陰性富集策略可以實現(xiàn)白細胞與CTCs 的有效分離。磁選方法結(jié)合微流控裝置可實現(xiàn)CTCs 更高通量的分離與富集。Karabacak 等[19]利用陰性富集策略設(shè)計了用于捕獲CTCs 的多級微流控裝置（CTC-iChip）（圖2A 和2B），包括：（1）專門設(shè)計的柱陣列，將血小板、紅細胞以及多余的磁珠分離出來；（2）蛇形通道，先利用慣性聚焦將細胞排成一排，隨后在偏轉(zhuǎn)區(qū)利用磁泳將CTCs 和白細胞分離，分別收集。實驗結(jié)果表明，該裝置每小時可以處理8 mL 全血，實現(xiàn)了97.0%±2.7%的CTCs 的收集效率。有研究者進一步改進了微流控芯片中的磁珠，提高了CTCs 的捕獲效率和捕獲速度。Yin 等[20]開發(fā)了一種新的快速捕獲CTCs 的方法，在微流控芯片中使用透明質(zhì)酸（HA）修飾的SiO2 磁珠（HA-SiO2@MBs），可以特異性結(jié)合過度表達CD44 受體的HeLa 細胞，并在外部磁場下分離。該微流控芯片對CTCs 的捕獲效率達到92%（圖2C），與其它微流控芯片相比，該芯片制備簡單且較容易實現(xiàn)，可快速、高效地分離CTCs，在癌癥診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

由于微通道中存在層流，微流控芯片微通道中的CTCs 通常遵循直線流線，大大降低了與捕獲配體涂層表面的相互作用，不利于有效捕獲CTCs。近年來，研究人員為了解決這些問題，開發(fā)了一系列新結(jié)構(gòu)的芯片（如3D 納米結(jié)構(gòu)[21]）提高CTCs 的捕獲效率。Zhang 等[22]開發(fā)了一種具有雙層人字槽的微流控芯片（圖2D 和2E）用于CTCs 捕獲。將修飾有CTCs 靶向抗體的磁珠固定在槽口通道的內(nèi)壁，樣品中的CTCs 在被動渦旋的作用下偏離到人字槽中，進而被磁珠捕獲。在常規(guī)病理細胞濃度（100 和50 cell/mL）下，腫瘤細胞捕獲效率分別為92.5%±2.7%和90.5%±5.0%；移去磁場后，超過90%捕獲的CTC 可以從芯片中釋放出來。

2 磁性微球在病毒抗原抗體檢測中的應(yīng)用

病毒等病原體檢測一般分為核酸檢測、抗原檢測和特異性抗體檢測。新型冠狀病毒感染的肺炎疫情期間，基于抗原檢測的快速診斷檢測試劑盒（RDT）已被廣泛用于居家即時檢測。然而，基于傳統(tǒng)膠體金和免疫熒光法的RDTs 經(jīng)常出現(xiàn)假陰性結(jié)果；磁性顆粒由于具有獨特的物理化學(xué)特性，已成為提高檢測靈敏度以及縮短傳統(tǒng)抗原檢測時間的理想介質(zhì)。

SARS-CoV-2 的結(jié)構(gòu)蛋白（如刺突蛋白（SP）和核衣殼蛋白（NP）等）可用于診斷COVID-19[23]。NP 和SP 具有高抗原性，但N 基因比S 基因更保守和穩(wěn)定，突變更少[24-25]，因此， NP 是SARS-CoV-2 抗原檢測中更穩(wěn)定有效的靶標(biāo)。Li 等[26]開發(fā)了一種磁性免疫傳感器（圖3A 和3B），用于快速、高靈敏地檢測血清中的NP。該傳感器利用雙標(biāo)記的磁性納米珠進行免疫磁富集和信號放大，可在幾分鐘內(nèi)完成檢測，檢出限低至230 pg/mL。其中，陰性人群和陽性患者的電信號差異明顯，陽性患者臨床血清標(biāo)本的NP 濃度及S/B 比值均明顯高于陰性人群。此外，可將該傳感器與智能手機的傳感設(shè)備連接，實現(xiàn)用戶友好的即時定量檢測（圖3C 和3D）。

熒光標(biāo)記的磁性微球也可快速識別病毒[27-28]。Lyu 等[27]報道了一種自動無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫測定方法（圖3E）用于NP 檢測。采用商業(yè)化的磁珠，通過靜電作用將N-（4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾和Co2+接枝到羧基功能化的磁珠表面，制備出一種雙功能化學(xué)發(fā)光磁珠dfCL-MB；將巰基聚乙二醇包覆在dfCL-MB 表面，通過Au—S 鍵組裝dfCL-MB 和抗體偶聯(lián)的金納米顆粒；采用全自動化學(xué)發(fā)光分析儀進行化學(xué)發(fā)光強度檢測（圖3F），并根據(jù)化學(xué)發(fā)光強度和NP 蛋白的線性關(guān)系測定病毒含量。該方法的檢出限為21 fg/mL，利用其測定健康人血清和COVID-19 患者臨床血清中的NP 蛋白，回收率大于91%。

Li 等[ 29]開發(fā)了一種由Fe3O4-Au 納米復(fù)合材料和Au 納米針陣列組成的磁性SERS 生物傳感器（圖4A）。該傳感器采用磁性Fe3O4-Au 納米復(fù)合材料來捕獲和分離鼻腔和喉嚨拭子中的病毒，增強了SARS-CoV-2 的拉曼信號，可在15 min 內(nèi)完成檢測，檢出限為100 copies/mL（圖4B）。Huergo 等[30]將SARS-CoV-2 核衣殼蛋白修飾在MagneHis Ni 磁珠表面，開發(fā)了一種簡單的基于顯色磁珠的免疫測定方法（圖4C）。將微球與血清混合，磁珠表面的SARS-CoV-2 核衣殼蛋白與血清中的抗體形成復(fù)合物，通過操控磁場可迅速分離微球，同時通過測量熒光信號強度或化學(xué)發(fā)光強度間接測定血清樣本中的病毒含量。

除檢測SARS-CoV-2 病毒外，還可以將磁性微球與金納米顆粒結(jié)合檢測丙型肝炎（HCV）病毒[31]，以及將磁性微球和SERS 技術(shù)結(jié)合用于同時檢測多種病毒抗原[32]。此外，磁珠也被廣泛應(yīng)用于微生物抗原檢測。Wu 等[33]將磁性微球和側(cè)流免疫分析技術(shù)相結(jié)合開發(fā)了一系列細菌檢測策略， Shang 等[34]將磁性微球與微流控技術(shù)相結(jié)合開發(fā)了一系列檢測細菌的新技術(shù)。

3 磁性微球在核酸提純和檢測方面的應(yīng)用

核酸是最基本的生命物質(zhì)之一，具有極其重要的生物學(xué)功能，主要存儲和傳輸遺傳信息，核酸檢測有助于監(jiān)測與某些健康狀況相關(guān)的遺傳變化[35-36]。與抗原檢測方法相比，核酸檢測多為直接方法，靈敏度更高，核酸檢測試劑盒的制備耗時也更短[37]。其中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是核酸檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，然而PCR 檢測設(shè)備昂貴，需要專業(yè)人員操作。傳統(tǒng)的核酸提取和分離耗時長，需要經(jīng)過多個離心步驟，導(dǎo)致產(chǎn)量和純度較低[38]。因此，開發(fā)低成本的核酸檢測試劑盒以滿足居家檢測的需要，是解決傳染病大流行期間核酸檢測需求激增問題的有效方法。磁性顆粒是核酸純化的良好工具，與其它化學(xué)方法相比，磁性顆粒輔助核酸檢測方法是一種相對安全環(huán)保的方法[39]。研究人員可以根據(jù)樣品選擇不同類型和大小的磁性顆粒，有利于提高提取效率，降低成本[40]。此外，在磁場驅(qū)動下，磁性顆?？刹皇芤后w體積的限制，有利于集成、便攜和快速的核酸檢測[41]，有望實現(xiàn)核酸純化、擴增和檢測一體化[42]。目前，已開發(fā)出多種磁珠提取試劑盒，并已實現(xiàn)商品化[43]。

Boom 等[44-45]利用SiO2 顆粒回收高濃度異硫氰酸胍（GTC）中的核酸，用于提取血清中乙型肝炎病毒（HBV）的DNA。基于此， Sun 等[46]制備了一種SiO2 包被的Fe3O4 磁珠，當(dāng)硫氰酸胍存在時，采用鮭精DNA 和大腸桿菌JM109 菌株的RNA 評估其吸附能力，結(jié)果表明，在pH=5.5 的條件下， SiO2 包覆的磁性顆粒對DNA 和RNA 的最大吸附量分別高達10.6 和7.7 mg/g。與商業(yè)化試劑盒對比， SiO2 包被的磁性顆?？稍?0 min 內(nèi)快速、簡便地從血清中分離出病毒核酸，具有大規(guī)模商用的前景。Adams 等[40]采用不同磁珠選擇性地提取核酸（圖5A 和5B），評估了SiO2 包被、寡核苷酸包被和特異性寡核苷酸序列包被的磁性顆粒的分析性能，用于實際樣品檢測，回收率分別為75%、71%和7%（圖5C）；當(dāng)孵育時間延長至180 min 時，特異性寡核苷酸序列包被磁性顆粒對靶標(biāo)的回收率達到77%。

傳統(tǒng)磁珠具有可逆吸附性，其核酸脫附效率欠佳。Fei 等[47]開發(fā)了一種響應(yīng)型Fe3O4 磁珠（圖5D），其表面涂有一層碳氟化合物表面活性劑，這使得羧基基團在磁珠表面具有反轉(zhuǎn)屬性，降低了核酸的可逆吸附性。該磁珠對RNA 和DNA 的解吸率分別達到94.0%和93.5%，高于商業(yè)磁珠約10%（圖5E）。將響應(yīng)型磁珠的實時生物發(fā)光（BART）與逆轉(zhuǎn)錄酶環(huán)介導(dǎo)擴增（RT-LAMP）相結(jié)合，其檢測結(jié)果優(yōu)于商業(yè)磁珠（圖5F 和5G），對SARS-CoV-2 病毒的檢出限低至5 copies/mL。

磁性微球可用于高效純化核酸。Huang 等[48]制備了一種表面電性可調(diào)的氨基化Fe3O4@SiO2 微球，通過靜電吸附作用實現(xiàn)了基因組DNA 的選擇性捕獲，將之用于人體血液中基因組DNA 的提取，提取率高達70%。Cui 等[49]提出了一種基于順磁磁珠和油水界面的平臺，用于快速提取臨床樣本中的核酸。此平臺利用順磁磁珠、油水界面、小型永久磁鐵和微流控通道分離和純化裂解液中的核酸，省略了多個洗滌步驟，簡化了純化流程，縮短了純化時間。結(jié)果表明，此裝置不僅能夠能從臨床鼻咽拭子樣本中高效分離流感病毒RNA，并能保持病毒基因組的高度完整性。與Ambion MagMAX 試劑盒相比，此平臺提取RNA 的時間顯著減少，僅為原時間的1/3，但檢測效果幾乎相同，在臨床和高通量檢測方面具有很大的應(yīng)用潛力。

以上方案是基于核酸的化學(xué)性質(zhì)提取總核酸，為了更好地分離、提純和檢測核酸，有時需要同時純化RNA 和DNA。傳統(tǒng)的核酸提取技術(shù)操作復(fù)雜，并需要使用有毒化學(xué)試劑。為解決此問題， Strotman 等[50]開發(fā)了一種SNARE（Selective nucleic acid removal via exclusion）核酸提取技術(shù)（圖6A 和6B）。SNARE 無需稀釋性洗滌和離心過程，可重復(fù)使用，可從極少的樣本中分離純化mRNA 和DNA，用于下游分析。與商業(yè)化磁珠Qiagen 試劑盒相比， SNARE 提取DNA 效果更好，提取RNA 效果相近。SNARE 裝置具有靈敏度高、檢測成本低以及可用于快速檢測等優(yōu)勢，與其它微流控設(shè)備結(jié)合，在疾病早期檢測、監(jiān)測治療反應(yīng)和靶向治療等領(lǐng)域擁有巨大的應(yīng)用潛力。

通過靶向指定的基因位點可分離特定核酸，但是基于PCR的檢測平臺成本高且操作復(fù)雜。Zayani等[51]基于磁性微球技術(shù)，結(jié)合核酸雜交和熒光檢測原理，設(shè)計了多重?zé)晒馍锲脚_（圖6C 和6D），用于無核酸擴增情況下SARS-CoV-2 病毒RNA 檢測。該方法通過特異性的DNA 探針分子與目標(biāo)SARS-CoV-2 病毒RNA 的互補序列雜交，形成DNA-RNA 復(fù)合物，固定在磁性微球表面。隨后將病毒RNA 與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的探針分子雜交，加入H2O2 和鄰苯二胺溶液產(chǎn)生熒光信號，通過分析熒光信號實現(xiàn)對SARS-CoV-2 病毒RNA 的定量檢測。BEAMing 技術(shù)是一種磁珠和PCR 流式技術(shù)相結(jié)合的數(shù)字PCR 流式技術(shù)，該技術(shù)先將修飾有鏈霉親和素的磁珠和生物素標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合，然后利用PCR 技術(shù)將單個靶標(biāo)DNA 在單個磁珠上擴增，最后通過統(tǒng)計磁珠的數(shù)量實現(xiàn)DNA 的測定[52-53]。Cabezas-Camarero[54]等首次將BEAMing 技術(shù)用于膠質(zhì)瘤患者血漿中循環(huán)腫瘤DNA 的檢測。Garrido 等[55]在臨床研究中使用高靈敏的BEAMing 方法檢測和定量分析循環(huán)腫瘤DNA 中的表皮生長因子受體突變，在優(yōu)化晚期非小細胞肺癌患者的治療方案中具有應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論與展望

磁性微球具有良好的磁性和生物相容性，可用于CTCs 的檢測，通過與腫瘤細胞的某些分子標(biāo)記物結(jié)合，實現(xiàn)對血液中CTCs 的高效捕獲和分離，在腫瘤的早期診斷、治療和監(jiān)測等領(lǐng)域極具應(yīng)用潛力。磁性微球在抗病毒檢測方面也具有重要的應(yīng)用價值。通過在微球表面修飾具有高特異性病毒抗體，實現(xiàn)對SARS-CoV-2 捕獲，而微球的磁性使檢測過程中的分離和洗滌過程更加高效。同時，磁性微球可用于核酸提純和檢測，主要通過在磁性表面修飾具有高特異性的核酸探針捕獲目標(biāo)核酸。此外，磁性微球具有較大的表面積和較高的結(jié)合容量，可以提供更多的結(jié)合位點，提高檢測靈敏度，并可利用外部磁場提高檢測效率。目前，磁性微球已經(jīng)商業(yè)化，在抗體抗原檢測、核酸檢測和純化以及CTCs 富集檢測等領(lǐng)域已實現(xiàn)臨床應(yīng)用，并已研發(fā)出基于磁性微球的商業(yè)化檢測工具。未來，磁性微球與人工智能技術(shù)、納米技術(shù)和微流控技術(shù)等新興技術(shù)相結(jié)合，可為疾病的診斷和治療帶來全新的解決方案。

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