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    基于CRISPR/Cas的生物傳感器在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

    2024-08-30 00:00:00張孝淵姚志豪何開雨王洪梅徐霞紅吳祖芳王柳
    分析化學(xué) 2024年4期
    關(guān)鍵詞:生物傳感器評(píng)述

    關(guān)鍵詞 食源性病原菌;CRISPR/Cas;生物傳感器;評(píng)述

    食源性病原菌是可引起食物中毒或以食品為媒介傳播的細(xì)菌、病毒和真菌。食源性病原菌通過污染食品原材料(蔬菜、水果、牛奶和肉類等)和水源,或在食品生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)對(duì)食品造成污染。常見的食源性病原菌主要有沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、彎曲桿菌和大腸桿菌等[1]。人類直接食用或因接觸被病原菌污染的食品而間接攝入病原菌,可出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、頭痛、惡心等癥狀,嚴(yán)重時(shí)甚至可導(dǎo)致死亡[2]。因此,建立快速、準(zhǔn)確和靈敏的食源性病原菌檢測方法對(duì)保障食品安全和人類健康具有重要意義。

    傳統(tǒng)的菌落平板計(jì)數(shù)法結(jié)合生化鑒定被認(rèn)為是檢測食源性病原菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”。雖然這種方法準(zhǔn)確度很高,但檢測通常需要3~5d,并且難以實(shí)現(xiàn)高通量檢測[3]。為了克服檢測時(shí)間過長的問題,研究者開發(fā)了許多方法,如熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)和酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)等方法[4]。熒光定量PCR 方法的靈敏度較高,在病原菌檢測過程中被廣泛采用。但是, PCR 過程中產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增可能會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果,限制了PCR 的應(yīng)用[5]?;诳乖涂贵w之間的免疫反應(yīng)的ELISA 具有操作簡單和檢測時(shí)間短等優(yōu)勢,但是準(zhǔn)確性和靈敏度較低[6]。為滿足即時(shí)檢測食源性病原菌的需求,需要開發(fā)特異性好、準(zhǔn)確度和靈敏度更高的檢測方法。

    規(guī)則成簇的短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/CRISPR 相關(guān)系統(tǒng)(CRISPR-associated systems, Cas)是細(xì)菌及古細(xì)菌用于抵御病毒入侵的一種自我保護(hù)機(jī)制,通過引導(dǎo)RNA 與靶核酸的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則確保特異性,并借助Cas 蛋白實(shí)現(xiàn)基因剪切與修飾。隨著各種功能性Cas 蛋白的發(fā)現(xiàn)和改造,以及越來越多具有可設(shè)計(jì)和可編程特點(diǎn)的成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列核糖核酸(CRISPR RNA, crRNA)被發(fā)現(xiàn), CRISPR/Cas 系統(tǒng)在分子診斷領(lǐng)域的潛能被逐漸開發(fā),并被廣泛應(yīng)用[7-11]。將CRISPR/Cas 系統(tǒng)與不同種類的技術(shù)相結(jié)合,已構(gòu)建了多種用于食源性病原菌檢測的生物傳感器[12-16]。

    CRISPR/Cas 生物傳感器是在引導(dǎo)RNA 的作用下,使Cas 蛋白與RNA 形成核糖核酸復(fù)合體,對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行特異識(shí)別,并將分子間的化學(xué)反應(yīng)經(jīng)信號(hào)放大,最后轉(zhuǎn)化為可檢測的電信號(hào)、光學(xué)信號(hào)和色相信號(hào)等。CRISPR/Cas 由于其設(shè)計(jì)和使用靈活,在生物傳感的信號(hào)識(shí)別、放大和輸出過程中都發(fā)揮了重要作用(圖1)。本文介紹了CRISPR/Cas 系統(tǒng)的分類、作用機(jī)制及其在生物傳感中的作用,分別闡述了其在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用,總結(jié)了現(xiàn)有的基于CRISPR/Cas 的多重食源性病原菌檢測方法以及其近年來的研究進(jìn)展,分析了其在實(shí)際應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn),并對(duì)基于CRISPR/Cas 的生物傳感器在病原菌檢測研究和應(yīng)用中未來的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

    1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類及作用機(jī)制

    根據(jù)效應(yīng)蛋白數(shù)量的不同, CRISPR/Cas 系統(tǒng)可分為Ⅰ類和Ⅱ類。Ⅰ類是由多個(gè)亞基組成的效應(yīng)子模塊,Ⅱ類是具有多種功能的單個(gè)效應(yīng)蛋白[17]。Ⅱ類Cas 蛋白具有簡單和高效等特點(diǎn),被廣泛用于分子診斷領(lǐng)域。目前,基于CRISPR/Cas 的生物傳感器常用的Cas 效應(yīng)蛋白包括Cas9、Cas12 和Cas13a等[18-21],本文將分別介紹這3 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)的工作原理。

    1.1 CRISPR/Cas9的作用機(jī)制

    CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理是通過crRNA 與具有crRNA 互補(bǔ)序列的反式激活RNA(Trans-activatingcrRNA,tracrRNA)序列形成RNA 雙鏈體, Cas9 蛋白在2 個(gè)RNA 的引導(dǎo)下識(shí)別帶有原間隔臨近基序(Protospacer adjacent motif, PAM)的(5′-NGG-3′)靶雙鏈DNA(Double strand DNA, dsDNA),在PAM 位點(diǎn)上游3 個(gè)堿基處切割靶dsDNA,形成雙鏈切口[22]。此外, crRNA 和tracrRNA 可合并為單一導(dǎo)向的RNA(Single-guide RNA, sgRNA)[23]?;趬A基互補(bǔ)配對(duì)原則, Cas9 會(huì)在sgRNA 引導(dǎo)下與靶dsDNA 結(jié)合。Cas9蛋白具有2個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域HNH 和RuvC,其中, HNH 區(qū)域引導(dǎo)切割與sgRNA 互補(bǔ)的模板鏈,RuvC 區(qū)域引導(dǎo)切割與模板鏈互補(bǔ)的鏈[24-26]。除此之外,當(dāng)Cas9 的1 個(gè)核酸酶活性區(qū)域失活后,會(huì)形成Cas9nickase(Cas9n)[27],可在dsDNA 上形成單鏈缺口[22]。當(dāng)HNH 和RuvC 都失活后,形成的DeactivatedCas9(dCas9)不具有核酸內(nèi)切酶活性,但仍可與靶DNA 結(jié)合[28-29]。

    1.2 CRISPR/Cas12的作用機(jī)制

    CRISPR/Cas12 系統(tǒng)在分子診斷領(lǐng)域中使用較廣泛的蛋白包括Cas12a 和Cas12b 蛋白。與SpCas9 相比, Cas12a 的分子量更?。s1274 個(gè)氨基酸)。此外, Cas12a 僅需crRNA 即可激活酶切活性,并且crRNA 結(jié)構(gòu)比sgRNA 更簡單[30]。Cas12a/crRNA 復(fù)合物可識(shí)別5′末端含有(5′-(T)TTN-3′、5′-TYCV-3′和5′-TATV-3′等)PAM 位點(diǎn)的靶dsDNA(不同來源的Cas12 對(duì)PAM 位點(diǎn)的偏好不同),切割dsDNA 并產(chǎn)生粘性末端[31-33]。此外, Cas12a 還可進(jìn)行反式切割(或被稱為“側(cè)切”),能夠在Cas12a/crRNA 復(fù)合物與靶dsDNA 結(jié)合后非特異性地切割游離的單鏈DNA(Single stranded DNA, ssDNA)[34]。與Cas12a 相比,Cas12b(約1129 個(gè)氨基酸)分子量更小,但Cas12b 需要雙RNA(crRNA 和tracrRNA)引導(dǎo),進(jìn)而識(shí)別以5′-TTN-3′為代表的PAM 序列。Cas12b 也具備反式切割活性[35]。通常, Cas12a 的最佳工作溫度約為37 ℃, 而Cas12b 的最佳切割溫度為48 ℃, 具備一定的嗜高溫特性[36]。

    1.3 CRISPR/Cas13a的作用機(jī)制

    與上述兩種CRISPR 系統(tǒng)相比, CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)并不具備識(shí)別DNA 的能力,只能識(shí)別帶有由A、U 或G 堿基組成的原間隔側(cè)翼序列(Protospacer flanking sequence, PFS)的RNA 靶標(biāo)。Cas13a 可在crRNA 引導(dǎo)下結(jié)合帶有PFS 序列的RNA,并特異性切割靶RNA。Cas13a 也具備反式切割非特異性單鏈RNA(Single stranded RNA, ssRNA)的能力。crRNA 與靶標(biāo)之間的單堿基錯(cuò)配對(duì)Cas13a 的活性影響很低,但2 個(gè)或2 個(gè)以上的堿基錯(cuò)配會(huì)嚴(yán)重降低蛋白活性[37-39]。

    2 CRISPR/Cas 生物傳感的原理及其在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用

    常規(guī)的生物傳感過程可分為3 個(gè)環(huán)節(jié),即生物信號(hào)的識(shí)別、放大和輸出。CRISPR/Cas 系統(tǒng)在生物傳感中可參與不同環(huán)節(jié),可輔助生物信號(hào)識(shí)別、放大和輸出。以下分別闡述Cas9、Cas12 和Cas13a 系統(tǒng)在生物傳感中的應(yīng)用。

    2.1 CRISPR/Cas9 生物傳感的原理及其在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用

    2.1.1 Cas9 輔助信號(hào)識(shí)別

    CRISPR/Cas9 系統(tǒng)參與生物傳感的信號(hào)識(shí)別環(huán)節(jié),進(jìn)而觸發(fā)下一步的信號(hào)放大環(huán)節(jié)。Zhou 等[40]開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas9 觸發(fā)識(shí)別、切割內(nèi)切酶介導(dǎo)的鏈置換擴(kuò)增(Strand displacement amplification,SDA)方法(CRISDA)。首先,通過Cas9-sgRNA識(shí)別靶標(biāo)DNA 并在非靶標(biāo)鏈上形成一個(gè)切口,便于引物與切口附近的模板鏈結(jié)合;然后,在聚合酶和切刻內(nèi)切酶輔助下進(jìn)行SDA擴(kuò)增,生成大量dsDNA 產(chǎn)物;最后,使用熒光-淬滅基團(tuán)標(biāo)記的肽核酸(PNA)侵襲擴(kuò)增產(chǎn)物,利用終點(diǎn)熒光分析對(duì)靶核酸進(jìn)行定量分析。該方法以人類基因組9 號(hào)染色體為靶標(biāo),檢出限可低至2.5 amol/L。

    由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)PAM序列存在高度依賴性,如何對(duì)無PAM 序列的核酸進(jìn)行檢測是較大的挑戰(zhàn)。PAM 遞呈寡核苷酸(PAM-mer)是一種含有PAM 區(qū)域的短單鏈DNA,可使Cas9 定向結(jié)合或切割無PAM 的靶標(biāo)。Wang 等[41]通過引入PAM-mer 序列“NGG”使Cas9 切割靶ssRNA/ssDNA,從而釋放特異性片段并觸發(fā)指數(shù)擴(kuò)增,生成大量富G擴(kuò)增產(chǎn)物,利用G-四鏈體與血紅素結(jié)合后具有類過氧化物酶活性的特性實(shí)現(xiàn)可視化檢測。該方法以單核細(xì)胞增生李斯特菌的ssDNA片段為靶標(biāo),檢出限低至100 amol/L。

    此外,單一的Cas9 系統(tǒng)也可直接檢測靶標(biāo)dsDNA。Zhang等[42]構(gòu)建了一種基于dCas9 檢測病原菌的檢測系統(tǒng)。如圖2A 所示,在靶標(biāo)DNA 上設(shè)計(jì)1 對(duì)PAM 位點(diǎn),可被2 個(gè)不同的sgRNA 分別識(shí)別,并導(dǎo)致2個(gè)dCas9 同時(shí)結(jié)合在同一個(gè)靶標(biāo)上。由于這2 個(gè)dCas9 分別修飾了分裂的熒光素酶,二者同時(shí)結(jié)合靶標(biāo)使得熒光素酶結(jié)構(gòu)完整,因而可產(chǎn)生生物發(fā)光信號(hào)。該方法以結(jié)核分岐桿菌為檢測對(duì)象,在沒有核酸擴(kuò)增時(shí)靈敏度為0.01 amol/L,在35 次PCR 循環(huán)下靈敏度可達(dá)到30 amol/L。

    盡管CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在信號(hào)識(shí)別環(huán)節(jié)中具有高特異性,但單一的CRISPR/Cas 系統(tǒng)檢測的靈敏度偏低[43]。利用Cas9 激活核酸擴(kuò)增提高靈敏度更適合低濃度的病原菌樣本檢測。

    2.1.2 Cas9 輔助信號(hào)輸出

    在信號(hào)輸出環(huán)節(jié), CRISPR/Cas9 系統(tǒng)通過對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別將核酸靶標(biāo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為可讀取的化學(xué)信號(hào),從而減少非特異性靶標(biāo)的干擾[44]。Wang 等[45]開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas9 的側(cè)流核酸測定(CASLFA)方法。如圖2B所示,首先設(shè)計(jì)了聚腺嘌呤標(biāo)記的金納米顆粒(Au nanoparticles, AuNPs)-DNA探針并預(yù)包埋在結(jié)合墊上,使用生物素化的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增或等溫?cái)U(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物與Cas9/sgRNA 共同短暫孵育后滴在樣品墊上。AuNP-DNA 探針的聚A 序列會(huì)雜交sgRNA 莖環(huán),與Cas9/sgRNA-生物素化擴(kuò)增子形成復(fù)合物,在T 線被預(yù)包被的鏈霉親和素捕獲,多余的AuNP-DNA 探針則被雜交捕獲在C 線上。CASLFA 方法可有效區(qū)分核酸擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的非特異信號(hào)的干擾,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物信號(hào)準(zhǔn)確輸入。該方法可用于單增李斯特菌、轉(zhuǎn)基因35S 啟動(dòng)子和非洲豬瘟病毒的鑒定,其中單增李斯特菌的裸眼檢出限低至150拷貝。

    此外, dCas9介導(dǎo)的體系顏色變化也可作為輸出信號(hào)。Bengtson等[46]提出了一種CRISPR/dCas9介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增DNA 檢測策略。從血液/尿液中提取DNA 后,使用生物素化的引物進(jìn)行重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase polymerase amplification, RPA)。dCas9/sgRNA 與RPA 產(chǎn)物結(jié)合,被鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠固定。采用ssDNA 標(biāo)記dCas9蛋白, ssDNA 與環(huán)狀引物雜交,在連接酶和聚合酶作用下進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling circle amplification, RCA)。RCA 產(chǎn)物折疊形成G-四鏈體, G-四鏈體與血紅素基團(tuán)結(jié)合催化顯色反應(yīng)。該方法無需復(fù)雜的設(shè)備,室溫下即可檢測,在15 min 內(nèi)可檢測低至10 拷貝的DNA。

    2.1.3 基于CRISPR/Cas9 的生物傳感器在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用

    基于CRISPR/Cas9 的生物傳感器已初步應(yīng)用于食源性病原菌檢測。Wang 等[47]將Cas9 nickase 與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合開發(fā)了基于一鍋法的RNA 檢測方法,將其用于鼠傷寒沙門氏菌的檢測,最低可在20 μL的反應(yīng)體系中檢測到0.99 pmol/L 鼠傷寒沙門氏菌基因組DNA,并驗(yàn)證了該體系對(duì)靶標(biāo)序列具有單核苷酸特異性。Wang 等[48]將CRISPR/Cas9 和側(cè)流層析試紙條相結(jié)合,利用Cas9-gRNA 識(shí)別靶標(biāo)DNA 使試紙條發(fā)生的顏色變化,實(shí)現(xiàn)了對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測,檢出限為63 CFU/mL。

    Cas9 的特異性識(shí)別可有效減少非特異性靶標(biāo)的干擾,從而提高方法的特異性,相比于利用Cas12 和Cas13a 的反式切割活性進(jìn)行信號(hào)輸出的方式,簡化了切割的步驟[49-51]。但是, CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在信號(hào)輸出過程中形成的復(fù)合物較復(fù)雜,檢測低濃度樣品時(shí)易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象[52];此外, sgRNA 的合成步驟繁瑣,成本較高。

    2.2 CRISPR/Cas12生物傳感原理及其在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用

    2.2.1 Cas12 輔助信號(hào)放大

    Cas12a/crRNA 的反式切割活性是指Cas12a 與靶標(biāo)核酸特異性結(jié)合后具有非特異性切割ssDNA 的能力。由于Cas12a 具有高周轉(zhuǎn)活性,當(dāng)其與靶標(biāo)DNA 結(jié)合后可依次對(duì)熒光-淬滅基團(tuán)修飾的ssDNA 進(jìn)行多次切割[53]。

    在靶標(biāo)基因上可以設(shè)計(jì)多個(gè)檢測位點(diǎn),利用多crRNA共同識(shí)別同一基因的不同位點(diǎn)能進(jìn)一步提高識(shí)別靶標(biāo)的概率,放大生物信號(hào)。Zeng等[43]開發(fā)了一種無需擴(kuò)增的多crRNA聯(lián)用的CRISPR/Cas12a檢測方法。與傳統(tǒng)的單crRNA檢測系統(tǒng)相比,多位點(diǎn)同時(shí)識(shí)別方法的靈敏度提高了64倍,檢出限低至約1 pmol/L[43]。

    2.2.2 Cas12 輔助信號(hào)輸出

    通過對(duì)ssDNA 報(bào)告探針進(jìn)行不同的信號(hào)標(biāo)簽修飾,結(jié)合Cas12 的反式切割活性,可將待測物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為電信號(hào)[54]、熒光信號(hào)[55]和比色信號(hào)[56]等,實(shí)現(xiàn)信號(hào)的靈活輸出。例如,在ssDNA 上分別修飾熒光基團(tuán)和報(bào)告基團(tuán),當(dāng)Cas12a 或Cas12b 在靶基因的存在下被激活并發(fā)生反式切割時(shí),可將靶基因信號(hào)轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)輸出[57-59]。

    通過切割熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)雙標(biāo)記的ssDNA 進(jìn)行信號(hào)輸出的成本較高。Wang 等[12]基于氧化石墨烯可吸附被FAM 修飾的長ssDNA(F-ssDNA)并淬滅其熒光的原理開發(fā)了一種單熒光基團(tuán)標(biāo)記信號(hào)探針的方法(圖3A)。Cas12a 反式切割F-ssDNA 使DNA 長度變短,導(dǎo)致氧化石墨烯對(duì)其的吸附能力降低,熒光淬滅效果變差。相比于雙標(biāo)記ssDNA,該方法可節(jié)約65%的成本。以沙門氏菌為檢測對(duì)象時(shí),檢出限低至50 拷貝。

    除了熒光和比色信號(hào)輸出的方式, CRISPR/Cas12系統(tǒng)還可將生物分子的信號(hào)轉(zhuǎn)化并輸出為電信號(hào)和表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)信號(hào),在定性分析的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)定量檢測。Liu 等[60]提出了一種由CRISPR/Cas12a 介導(dǎo)的基于SERS 的生物傳感器的核酸現(xiàn)場檢測策略。利用LAMP 擴(kuò)增靶DNA,在電極上修飾ssDNA,其中ssDNA 一端帶有脂質(zhì)體包裹的信號(hào)分子。Cas12a 識(shí)別靶DNA 后利用反式切割活性切割電極上的ssDNA,使得ssDNA 濃度降低。加入表面活性劑后,脂質(zhì)體破裂釋放出信號(hào)分子,可用于SERS 的檢測信號(hào)。該方法已成功應(yīng)用于鴨肉摻假分析,肉眼檢出限低至10 pmol/L。Suea-Ngam 等[61]提出了一種耦聯(lián)銀金屬化的無擴(kuò)增電化學(xué)CRISPR/Cas 生物傳感器(E-Si-CRISPR)。此傳感器的電極修飾了ssDNA 和CRISPR/Cas12a,當(dāng)存在靶基因時(shí), Cas12a 的反式切割活性被激活, ssDNA 報(bào)告子被裂解,ssDNA 表層電極被降解。在Cas12a 切割后對(duì)電極進(jìn)行銀金屬化,銀沉積的程度與剩余的ssDNA 報(bào)告子的量成正比。該方法以MRSA 基因?yàn)闄z測對(duì)象,檢出限為3.5 fmol/L,定量限為10 fmol/L。

    2.2.3 基于CRISPR/Cas12的生物傳感器在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用

    將CRISPR/Cas12 體系與等溫?cái)U(kuò)增聯(lián)用,利用Cas12 的反式切割活性對(duì)ssDNA 進(jìn)行切割,結(jié)合熒光信號(hào)變化或免疫層析試紙條等信號(hào)讀取方式實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測,在食源性病原菌檢測領(lǐng)域中已有較多應(yīng)用[62-67]。Cas12a 除了對(duì)ssDNA 具有反式切割活性外,還可以切割具有高級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA,如G-四鏈體DNA[68]。Wang 等[69]利用G-四鏈體增強(qiáng)特異性配體的熒光發(fā)射,而Cas12a 反式切割使G-四鏈體的高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞,從而無法增強(qiáng)熒光配體的發(fā)射信號(hào),基于此構(gòu)建了免標(biāo)記的熒光檢測方法,對(duì)副溶血弧菌的檢出限低至136拷貝。除此以外, G-四鏈體DNA 與血紅素結(jié)合的復(fù)合物具有類過氧化物酶活性,可催化顯色底物發(fā)生氧化反應(yīng)并產(chǎn)生顏色變化。當(dāng)Cas12a 的反式切割造成G 四鏈體結(jié)構(gòu)破壞時(shí),該催化活性喪失,無法發(fā)生顏色變化(圖3B)[21]。該方法可以檢測每反應(yīng)9.8 CFU的副溶血性弧菌。

    由于Cas12 對(duì)DNA 的靶向識(shí)別,使其能與大多數(shù)核酸擴(kuò)增方法結(jié)合,其反式切割活性可進(jìn)一步提高靈敏度,并實(shí)現(xiàn)信號(hào)的靈活轉(zhuǎn)換與輸出,因此已成為分子檢測領(lǐng)域中應(yīng)用最普遍的一種Cas 蛋白。

    2.3 CRISPR/Cas13a生物傳感原理及在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用

    2.3.1 Cas13a輔助信號(hào)放大

    與Cas12 類似,利用Cas13a 的反式切割活性可以放大生物信號(hào),提高靈敏度。多個(gè)Cas13a/crRNA 共同識(shí)別可以增強(qiáng)信號(hào)放大能力,進(jìn)一步提高靈敏度,檢測到豐度更低的靶標(biāo)[70]。Li 等[71]在還原氧化石墨烯-場效應(yīng)晶體管(rGO-FET)芯片上通過ssRNA 修飾AuNPs,利用多組串聯(lián)的Cas13a/crRNA 同時(shí)識(shí)別靶標(biāo)RNA 并激發(fā)反式切割活性,使rGO-FET 芯片表面修飾的AuNPs-RNA 報(bào)告子被Cas13a 裂解,引起電流信號(hào)變化,實(shí)現(xiàn)了靶標(biāo)RNA 的檢測。該方法檢測新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的檢出限為1.56 amol/L。SARS-CoV-2主要通過氣溶膠傳播,但新冠病毒疫情爆發(fā)時(shí)在食品中也檢出SARS-CoV-2。Lopez-Valls等[72]利用Cas13a-crRNA 識(shí)別靶標(biāo)RNA,觸發(fā)Cas13a 反式切割,裂解與AuNPs 偶聯(lián)的ssRNA,誘導(dǎo)膠體金聚集,實(shí)現(xiàn)可視化檢測(圖4A);將其與等溫?cái)U(kuò)增級(jí)聯(lián),可在30 min 內(nèi)完成SARS-CoV-2 的檢測。

    2.3.2 Cas13a 輔助信號(hào)輸出

    Cas13a 可以通過反式切割熒光-淬滅基團(tuán)修飾的ssRNA 輔助信號(hào)輸出,將生物信號(hào)轉(zhuǎn)化成易檢測的熒光信號(hào)。Gootenberg 等[7]開發(fā)了SHERLOCK 平臺(tái),利用Cas13a 識(shí)別RPA 擴(kuò)增產(chǎn)物,反式切割報(bào)告子釋放的熒光信號(hào)(圖4B),在1 h 內(nèi)即可完成檢測。該方法可用于寨卡病毒、登革熱病毒和大腸桿菌等目標(biāo)菌的檢測,以寨卡病毒為例,檢出限低至20 amol/L。此外, An 等[73]將RPA 與CRISPR/Cas13a 聯(lián)用,建立了針對(duì)沙門氏菌的檢測方法。將Cas13a 試劑與RPA 試劑混合, Cas13a 識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物,反式切割熒光報(bào)告子,釋放熒光信號(hào)。單管RPA-Cas13a 法的檢測時(shí)間少于20 min, 檢出限為102 拷貝,與PCR 法相當(dāng)。為滿足現(xiàn)場檢測的需求,研究人員開發(fā)了一些自動(dòng)化的檢測裝置。Chandrasekaran 等[74]研發(fā)了一種DISCoVER(一種無RNA 提取、CRISPR/Cas13a 介導(dǎo)的微流體檢測平臺(tái))檢測平臺(tái)。樣品在裂解緩沖液中熱失活后,加入重力微流體盒中,在對(duì)靶標(biāo)LAMP 擴(kuò)增后進(jìn)行T7 轉(zhuǎn)錄, Cas13a 非特異性切割熒光報(bào)告子, DISCoVER 可在60 min 內(nèi)自動(dòng)運(yùn)行測定和讀取熒光,對(duì)SARS-CoV-2 的靈敏度為40 copy/μL。

    2.3.3 基于CRISPR/Cas13a的生物傳感器在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用

    將CRISPR/Cas13a 與核酸擴(kuò)增聯(lián)用,利用T7 RNA 聚合酶將核酸擴(kuò)增生成的DNA 產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄成RNA,結(jié)合Cas13a 對(duì)RNA 的靶向識(shí)別功能,也可用于食源性病原菌的檢測。Liu 等[75]開發(fā)了基于PCR-Cas13a的生物傳感器,用于檢測食源性病原菌,對(duì)金黃色葡萄球菌的檢出限低至1.5 copy/μL。該傳感器被用于水樣和牛奶樣品中金黃色葡萄球菌的檢測,準(zhǔn)確率分別為99.44%和99.00%,檢測成本(0.497 美元)低于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法(0.670 美元)。與該傳感器類似, Zhou 等[76]設(shè)計(jì)的基于CRISPR/Cas13a 的細(xì)菌檢測平臺(tái)可在4 h 內(nèi)檢出低至1 CFU/mL 的金黃色葡萄球菌。相比于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法,該方法的靈敏度更高;與菌落平板計(jì)數(shù)法相比,檢測時(shí)間更短。

    Cas13a 系統(tǒng)能直接識(shí)別RNA,在病毒檢測方面具有很大優(yōu)勢。但是,將Cas13a 用于DNA 檢測時(shí)需通過T7RNA 聚合酶將DNA 轉(zhuǎn)錄成RNA,步驟更繁瑣,并且作為信號(hào)報(bào)告子的RNA 的合成和修飾成本遠(yuǎn)高于DNA,因而Cas13a 的使用相較于Cas12 更少。

    3 基于CRISPR/Cas的多重生物傳感器及其在食源性病原菌檢測中的應(yīng)用

    目前CRISPR/Cas 用于單個(gè)種類病原菌檢測的應(yīng)用較多,但食品中常存在多病原菌混合污染的情況,而單重檢測方法難以滿足多病原菌同時(shí)分析的需求。通過多重檢測的方案對(duì)食品中混合污染的病原菌進(jìn)行檢測,可有效提高檢測效率,節(jié)省人工和試劑成本。由于Cas12 和Cas13a 的反式切割活性不具有核酸序列選擇性,因此采用單一的Cas 蛋白在單一反應(yīng)管中進(jìn)行多目標(biāo)同時(shí)檢測面臨較大的困難。為了解決該難題,研究人員進(jìn)行了諸多嘗試,主要解決方案包括兩類。(1)利用不同Cas 蛋白對(duì)序列切割的選擇性偏好同時(shí)檢測不同靶標(biāo)Su 等[77]開發(fā)了基于RPA 和Cas12a、Cas13a 雙通道正交檢測的方法(圖5A)。利用Cas12a 和Cas13a 分別識(shí)別和切割DNA 和RNA 靶標(biāo),通過對(duì)RNA 和DNA 報(bào)告探針進(jìn)行不同的抗體修飾使其被試紙條上相應(yīng)的抗體捕獲,從而實(shí)現(xiàn)雙靶標(biāo)同時(shí)檢測。利用該方法檢測SARS-CoV-2 基因組的ORF1ab 和N 基因,檢出限為10 拷貝。(2)單一的Cas 蛋白結(jié)合微流體、機(jī)器學(xué)習(xí)和空間編碼等技術(shù)實(shí)現(xiàn)不同信號(hào)區(qū)分Bruch 等[78]開發(fā)了CRISPR/Cas13a 介導(dǎo)的微流體多重電化學(xué)傳感器。靶RNA 存在時(shí)會(huì)激活Cas13a/crRNA 的反式切割活性,裂解報(bào)告RNA 鏈。通過在微流體上設(shè)計(jì)多個(gè)通道實(shí)現(xiàn)不同靶標(biāo)的區(qū)分,從而實(shí)現(xiàn)多重檢測。該方法可用于檢測miR-19b 和miR-20a,檢出限均為10 nmol/L。Ackerman 等[79]開發(fā)了用于核酸多重評(píng)估的組合陣列反應(yīng)(CARMEN)。CARMEN 將針對(duì)不同靶標(biāo)的CRISPR 試劑分別包封在不同的納升液滴內(nèi),然后分散在微孔陣列中。當(dāng)多重核酸擴(kuò)增產(chǎn)物加入到微陣列中時(shí),對(duì)應(yīng)相同靶標(biāo)的CRISPR 試劑與擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生匹配,使Cas13a 切割報(bào)告子RNA,產(chǎn)生熒光信號(hào)。CARMEN 可同時(shí)區(qū)分169 種人類相關(guān)病毒,同時(shí)還能對(duì)甲型流感毒株全面分型。除此之外,利用空間編碼的水凝膠微粒(HMP)和機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)也能構(gòu)建多重檢測系統(tǒng)(Cas-loaded annotated micro-particles,CLAMP)[80]。如圖5B 所示,首先將Cas 蛋白固定在空間編碼的HMP 中,將每個(gè)HMP 變成可用于核酸檢測的離散容器。每種帶有空間代碼的HMP 都對(duì)應(yīng)唯一的靶標(biāo),在識(shí)別預(yù)期的核酸靶標(biāo)后, Cas12a/crRNA 復(fù)合物切割ssDNA-FQ 探針,釋放HMP 內(nèi)部的熒光信號(hào),在單個(gè)反應(yīng)罐中實(shí)現(xiàn)多重核酸檢測。

    將CRISPR/Cas 用于多種食源性病原菌的同時(shí)檢測已經(jīng)有了初步的嘗試。Qian 等[81]研發(fā)了一種基于Cas12a 的滑閥輔助微流控芯片。將設(shè)計(jì)的Cas12a 檢測試劑分裝于兩個(gè)檢測室中,利用滑閥和注射器將雙重LAMP 擴(kuò)增子與CRISPR/Cas12a 檢測體系混合,在紫外燈照射下可肉眼觀察結(jié)果。該方法最低可檢出20 拷貝的沙門氏菌DNA 和30 拷貝的副溶血弧菌DNA。Xing 等[82]開發(fā)了一種手指驅(qū)動(dòng)的微流體傳感器,在不同檢測室中置入針對(duì)不同病原菌的CRISPR/Cas12a 試劑,通過手指按壓使得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入檢測室,靶標(biāo)存在時(shí)對(duì)應(yīng)的檢測室即可顯出熒光。該方法可同時(shí)檢測7 種食源性病原菌,檢出限低至500 CFU/mL??傮w而言,由于CRISPR/Cas 多重傳感器的構(gòu)建具有較大困難,在多種食源性病原菌同時(shí)檢測中的應(yīng)用還不成熟,但是, CRISPR/Cas傳感器在其它靶標(biāo)中的應(yīng)用可為食源性病原菌多重檢測提供思路和參考。

    4 總結(jié)與展望

    基于CRISPR/Cas 的生物傳感器具有良好的通用性和可編程性,可用于檢測多種食源性病原菌。經(jīng)過巧妙的設(shè)計(jì),許多CRISPR/Cas 耦聯(lián)核酸擴(kuò)增的方法可檢出低至amol/L 的靶標(biāo)核酸,具有極高的靈敏度。將CRISPR/Cas 與SERS、側(cè)流免疫層析、顯色和熒光等信號(hào)輸出方式結(jié)合,可在不使用專門儀器的條件下實(shí)現(xiàn)食源性病原菌的檢測,便于現(xiàn)場測定[83]。

    然而,基于CRISPR/Cas 的檢測技術(shù)仍然存在一些挑戰(zhàn)。(1)Cas效應(yīng)子對(duì)PAM或PFS的識(shí)別要求使某些序列檢測受到限制[84]。盡管已開發(fā)了無需PAM 序列的檢測方法,但這些方法的靈敏度和特異性較差,需進(jìn)一步研究Cas 蛋白的作用機(jī)制,獲取一些人工改造的Cas 蛋白,增加Cas 蛋白的種類或其PAM 序列的選擇性,使其能用于非傳統(tǒng)PAM序列依賴的核酸序列檢測。(2)雖然優(yōu)化的crRNA可減少CRISPR/Cas測定中的脫靶效應(yīng),但脫靶現(xiàn)象在實(shí)際測定中難以避免,并且可能導(dǎo)致結(jié)果誤判。因此,加強(qiáng)計(jì)算機(jī)算法對(duì)脫靶效應(yīng)的評(píng)估以及crRNA 序列設(shè)計(jì),提高CRISPR/Cas 的靶向識(shí)別作用,將是一個(gè)重要的研究方向。(3)Cas蛋白的非特異性反式切割能力使得多重檢測中不同靶標(biāo)的信號(hào)難以區(qū)分,多重檢測仍面臨較大挑戰(zhàn)。開發(fā)并普及微流控芯片,降低芯片和儀器成本,將極大地促進(jìn)多重檢測方法的推廣應(yīng)用。(4)目前,核酸擴(kuò)增與CRISPR/Cas結(jié)合只可定性分析病原菌,定量檢測性能仍需提高。探究核酸擴(kuò)增和CRISPR/Cas切割反應(yīng)過程的動(dòng)力學(xué)機(jī)理,研究二者的互作機(jī)制,減少CRISPR/Cas 與核酸擴(kuò)增的相互抑制,是實(shí)現(xiàn)定量檢測的重要途徑。(5)上述部分檢測方法還未拓展應(yīng)用于檢測食源性致病菌,但對(duì)開發(fā)食源性致病菌傳感器具有借鑒意義。

    綜上, CRISPR/Cas檢測技術(shù)目前還不能取代熒光定量qPCR 在病原菌檢測領(lǐng)域的地位。另外,關(guān)于CRISPR/Cas傳感器的使用標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)規(guī)范仍需要大力完善。隨著各種相關(guān)技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步,基于CRISPR/Cas的生物傳感器在食源性病原菌現(xiàn)場檢測中將發(fā)揮越來越重要的作用。

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