自體顱骨深低溫保存方案的探索性研究

【摘要】 目的 探索自體顱骨冷凍保存方案，包括保存溫度、保存時(shí)間、保存方法以及管理流程。方法回顧性分析2016年1月—2021年12月于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科行去骨瓣減壓術(shù)+自體顱骨回植術(shù)的325例患者的臨床資料，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行復(fù)習(xí)。依據(jù)探索性保存方案使用之前和使用之后，將2016—2018年的數(shù)據(jù)分為舊管理組，2019—2021年的數(shù)據(jù)分為新管理組，進(jìn)行兩組數(shù)據(jù)自體顱骨回植效果的評(píng)價(jià)研究。結(jié)果 自體顱骨冷凍保存平均時(shí)間122.9 d。行回植術(shù)后平均住院時(shí)間為12.3 d，經(jīng)過(guò)新保存方案和管理流程應(yīng)用之后，顱內(nèi)感染率由3.4%降低到1.7%。結(jié)論 -80 ℃深低溫保存自體顱骨效果良好，可有效減少顱內(nèi)感染發(fā)生率。

【關(guān)鍵詞】 自體顱骨；深低溫保存；管理方案；凍存架；顱內(nèi)感染

【中圖分類號(hào)】 R651 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 B 【文章編號(hào)】 1672-7770（2024）04-0424-06

Exploratory study on cryopreservation scheme of autologous skull ZHAO Fang， MA Jiaxiang， ZHAO Dan， ZHANG Qing， PAN Xiaoliang， CUI Peng. Tissue amp; Organ Bank， General Hospital of Ningxia Medical University， Yinchuan 750001， China

Corresponding author： CUI Peng

Abstract： Objective To explore autologous skull cryopreservation protocol， including storage temperature， storage time， storage method， and management process. Methods The clinical data of 325 patients who underwent decompressive craniectomy and autogenous skull transplantation in the Department of Neurosurgery， General Hospital of Ningxia Medical University from January 2016 to December 2021 were analyzed retrospectively. The relevant literature were reviewed. According to the exploratory preservation plan， the data from 2016 to 2018 were divided into the old management group and the data from 2019 to 2021 were divided into the new management group. The evaluation study on the effect of autologous skull transplantation was conducted for both groups of data. Results The average cryopreservation time of autogenous skull was 122.9 days. The average hospital stay after replantation was 12.3 days. After the application of the new preservation scheme and management process， the intracranial infection rate decreased from 3.4% to 1.7%. Conclusions Cryopreservation of autologous skull at -80 ℃ is effective and can reduce the incidence of intracranial infection.

Key words： autogenous skull; cryopreservation; management plan; freezer rack; intracranial infection

作者單位：750001 銀川，寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院組織器官庫(kù)（趙芳，馬佳祥，趙丹，張慶，潘小亮）；寧夏回族自治區(qū)健康教育所（崔鵬）

通信作者：崔鵬

去骨瓣減壓術(shù)（decompressive craniectomy，DC）是神經(jīng)外科常用的一種手術(shù)方式，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，顱骨修補(bǔ)術(shù)（cranioplasty，CP）的材料不斷更新改進(jìn)，自體顱骨被認(rèn)為是理想的修補(bǔ)材料^[1-2]。-80 ℃保存顱骨被認(rèn)為是保存組織生物活性的有效方法，不僅對(duì)顱骨的生物力學(xué)性能損傷最小，而且仍保持著骨誘導(dǎo)能力。-80 ℃保存簡(jiǎn)單、易操作、成本低，基層醫(yī)院易開(kāi)展，但如何有效地在-80 ℃保存和管理自體顱骨是神經(jīng)外科醫(yī)生長(zhǎng)期面臨的挑戰(zhàn)。為此，本研究納入2016年1月—2021年12月于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科行DC+自體顱骨回植術(shù)的325例患者，通過(guò)優(yōu)化自體顱骨保存方法和管理流程，對(duì)自體顱骨冷凍保存方案進(jìn)行探索性研究，最終優(yōu)化了一套自體顱骨冷凍保存的管理方案，擬在寧夏地區(qū)及周邊省份的醫(yī)療單位進(jìn)行推廣應(yīng)用，為更多的病患減輕就醫(yī)負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共納入325例行自體顱骨回植術(shù)患者，其中男232例（71.4%），女93例（28.6%）；年齡2～73歲，平均年齡43.6歲；自體顱骨冷凍保存（-80 ℃）時(shí)間20～390 d，平均保存時(shí)間122.9 d。年齡分組根據(jù)聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織提出的年齡新分段，未成年為0～17歲，青年人為18～65歲，中年人為66～79歲，老年人為80～99歲，長(zhǎng)壽老人為100歲以上。行自體顱骨回植術(shù)至出院時(shí)間間隔，即回植術(shù)后平均住院時(shí)間為12.3 d。車禍傷及其他外傷占比較大，分別為32.3%和16.6%。雙側(cè)顱骨缺陷病例較少，主要以右側(cè)或者左側(cè)為主，二者比例相當(dāng)。見(jiàn)表1。納入標(biāo)準(zhǔn)： （1）行DC并行自體顱骨回植術(shù)患者；（2）臨床資料完整，可追溯；（3）患者和家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）選擇鈦網(wǎng)或其他材料行CP的患者；（2）行DC后，頭皮切口愈合不佳或合并感染；（3）回植術(shù)前頭顱計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）檢查提示顱內(nèi)有器質(zhì)性病變的患者；（4）回植術(shù)后顱內(nèi)壓高于正常范圍或腦組織顯著膨出的患者；（5）合并有嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病而無(wú)法耐受手術(shù)者；（6）存在精神異常或無(wú)手術(shù)意愿的患者。

1.2 方法

1.2.1 新管理方案保存方法 （1）顱骨瓣從患者身上取下之后，刮除骨膜；（2）生理鹽水沖洗兩遍；（3）用雙層抗低溫?zé)o菌袋包裝，并進(jìn)行標(biāo)記；（4）用4 ℃冷藏轉(zhuǎn)運(yùn)箱轉(zhuǎn)運(yùn)至深低溫保存室；（5）登記入庫(kù)信息，簽署知情同意；（6）確定存儲(chǔ)位置信息；（7）將顱骨放在指定格子內(nèi)，并記錄；（8）24 h實(shí)時(shí)監(jiān)控溫度變化情況；（9）需要回植時(shí)，登記出庫(kù)；（10）轉(zhuǎn)運(yùn)箱轉(zhuǎn)運(yùn)至手術(shù)室；（11）經(jīng)過(guò)復(fù)溫、沖洗后行回植術(shù)。

1.2.2 新管理方案冰箱凍存架設(shè)置與管理 -80 ℃冰箱內(nèi)設(shè)置專用的顱骨凍存架（圖1），架子的儲(chǔ)存區(qū)域按照月份進(jìn)行分區(qū)，從上至下，第一層標(biāo)記備用層；第二層5個(gè)架子從左往右分別標(biāo)記為1～5月，第三層5個(gè)架子從左往右分別標(biāo)記為6～10月，第四層2個(gè)架子從左往右分別標(biāo)記為11月和12月。每一個(gè)架子共有3層，從上至下，分別編號(hào)為A、B、C；A、B、C三層每一層分別有5個(gè)格子；5個(gè)格子的順序從外向內(nèi)，分別是1、2、3、4、5；于是每一個(gè)架子共有15個(gè)格子。最終形成如5-B-3的存儲(chǔ)位置編號(hào)，其中5代表的是5月份架子，B代表的是5月份架子的第二層，3代表的是5月份架子的第二層里的第3號(hào)格子。工作人員根據(jù)存放日期選擇相應(yīng)月份的架子進(jìn)行存儲(chǔ)。

1.2.3 舊管理方案 2019年之前，自體顱骨瓣從患者身上取下，刮除骨膜，用生理鹽水沖洗兩遍后；直接用雙層無(wú)菌一次性手套包裝，標(biāo)記后置于-80 ℃冰箱；無(wú)凍存架。需要進(jìn)行回植時(shí)，登記出庫(kù)，經(jīng)過(guò)復(fù)溫、沖洗后行回植術(shù)。

1.2.4 分組 依據(jù)探索性保存方案使用之前和使用之后，將2019—2021年的數(shù)據(jù)分為新管理組。新管理組顱骨保存方案見(jiàn)圖2。將2016—2018年的數(shù)據(jù)分為舊管理組，舊管理組顱骨保存方法與新管理方案相比，直接用雙層無(wú)菌手套包裹后，置于-80 ℃冰箱，冰箱內(nèi)無(wú)凍存架。

1.3 隨訪 選取行去顱骨瓣減壓術(shù)+自體顱骨回植術(shù)患者，簽署知情同意書(shū)后，將患者自體顱骨分別存放在-80 ℃冰箱，保存時(shí)間分別選取≤3個(gè)月、4～6個(gè)月、7～9個(gè)月、10～12個(gè)月、＞12個(gè)月。行回植術(shù)后，于術(shù)后3個(gè)月、6個(gè)月、1年進(jìn)行隨訪，收集相關(guān)臨床數(shù)據(jù)對(duì)并發(fā)癥進(jìn)行回顧性分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)處理均采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用 χ²檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后并發(fā)癥 不同顱骨回植術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率見(jiàn)表2，自體CP患者共325例，62例并發(fā)癥患者；鈦網(wǎng)修補(bǔ)術(shù)患者44例，7例并發(fā)癥患者，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。自體CP患者中，有1例硬膜外血腫患者和2例硬膜下血腫患者，后期均采取保守治療。不同冷凍保存時(shí)間自體顱骨回植患者術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率見(jiàn)表3，不同顱骨保存時(shí)間回植后腦積水和其他并發(fā)癥（煩躁、失眠、易怒等）發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），顱骨保存時(shí)間低于6個(gè)月，回植后更易發(fā)生其他并發(fā)癥。

2.2 新管理方案和舊管理方案的對(duì)比分析 依據(jù)探索性保存方案使用之前和使用之后，將2016—2018年數(shù)據(jù)分為舊管理組，2019—2021年數(shù)據(jù)分為新管理組。舊管理組117例（50%），新管理組117例（50%）。對(duì)兩組患者病因發(fā)生率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)近年來(lái)顱內(nèi)腫瘤和腦梗的患者發(fā)生率增多，車禍傷發(fā)生率減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見(jiàn)表4；兩組患者顱骨回植術(shù)后主要并發(fā)癥比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)新方案應(yīng)用之后，顱內(nèi)感染率由3.4%降低到1.7%，腦脊液漏發(fā)生率由0.9%降低到0%，腦積水的發(fā)生率由2.6%降低到0%，頭痛的發(fā)生率沒(méi)有發(fā)生變化。但是術(shù)后癲癇的發(fā)生率由3.4%升高到5.1%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表5。

3 討 論

DC是神經(jīng)外科常用的一種手術(shù)方式，常見(jiàn)原因包括：創(chuàng)傷、感染、血管病變、腫瘤和先天畸形等^[3]，但需要隨后的手術(shù)來(lái)修復(fù)由此產(chǎn)生的骨缺損，稱為CP。CP的目的是恢復(fù)顱骨的完整性，為潛在的神經(jīng)組織提供機(jī)械保護(hù)，改善美容效果，減輕社會(huì)心理因素的干擾，并恢復(fù)與氣壓變化相關(guān)的腦脊液動(dòng)力學(xué)^[4-6]。目前可供選用的顱骨修補(bǔ)材料主要有自體顱骨、金屬材料（主要為鈦網(wǎng)）、各種高分子合成材料以及各種組織工程復(fù)合材料。但是，顱骨成形術(shù)最佳材料的選擇仍然存在爭(zhēng)議，因?yàn)闊o(wú)論選擇何種修補(bǔ)材料，都會(huì)使神經(jīng)外科醫(yī)生面臨如何保持骨瓣生物活性、如何提高生物相容性、抗菌性能以及如何降低厚度和成本的長(zhǎng)期挑戰(zhàn)^[7]，尤其是自體顱骨如何保存，如何降低回植后感染率。研究發(fā)現(xiàn)，使用自體移植骨瓣置換通常是減壓手術(shù)后顱骨成形術(shù)的第一個(gè)也是最常見(jiàn)的選擇，而且自體顱骨移植因其較低的感染率和成本以及可改善宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛使用并被認(rèn)為是黃金標(biāo)準(zhǔn)^[8]。

近年各臨床中心關(guān)于顱骨修補(bǔ)材料的研究證實(shí)，冷凍低溫保存自體顱骨原位回植是解決患者顱骨缺損的最佳選擇^[9]，目前-80 ℃保存是保存組織生物活性的有效方法。-80 ℃低溫能夠抑制引起組織破壞的膠原酶活性和降低抗原性，對(duì)骨組織的機(jī)械強(qiáng)度影響也較小，因此臨床采用-80 ℃保存自體顱骨時(shí)多未應(yīng)用凍存保護(hù)劑^[10]，這與本研究的保存方案達(dá)成一致。但是，對(duì)于低溫冷凍保存自體顱骨原位回植后臨床效果如何，目前缺乏相關(guān)臨床數(shù)據(jù)支持。各種保存方法以及組織病理學(xué)的對(duì)比資料有限，且對(duì)于術(shù)后并發(fā)癥及影像學(xué)的資料不足，目前仍不能明確證實(shí)哪一種儲(chǔ)存條件最佳，亦無(wú)法確定哪一種更經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、方便易行，能使顱骨瓣保持體外活性的方法。而且，DC后如何有效管理和保存自體顱骨目前業(yè)內(nèi)并沒(méi)有達(dá)成統(tǒng)一共識(shí)，因此迫切需要一個(gè)冷凍保存機(jī)構(gòu)，在不影響安全性的情況下提供具有較高臨床標(biāo)準(zhǔn)和指南的管理體系。

針對(duì)以上存在的問(wèn)題，本研究探索了一種自體顱骨冷凍保存方案，包括保存溫度、保存時(shí)間、保存方法以及管理流程。關(guān)于保存溫度的研究顯示，外植顱骨瓣的冷凍保存模式長(zhǎng)期以來(lái)一直是一個(gè)值得爭(zhēng)論的問(wèn)題，特別是適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存溫度。選擇自體骨在皮下儲(chǔ)存還是冷凍儲(chǔ)存的研究中，Dowlati等^[11]研究發(fā)現(xiàn)，與合成皮瓣相比，自體骨皮瓣可能是一種經(jīng)濟(jì)有效的選擇，但當(dāng)保存在腹部組織中時(shí)，隨著時(shí)間的推移，它們會(huì)增加腹部部位并發(fā)癥、再次手術(shù)和吸收的風(fēng)險(xiǎn)。Rosinski等^[12]首選冷凍儲(chǔ)存，但據(jù)Agrawal等^[13]研究顯示，迄今為止還沒(méi)有研究比較過(guò)在同一機(jī)構(gòu)以不同程度冷凍保存的用于神經(jīng)外科的顱骨皮瓣的微生物特征和感染潛力。在Agrawal等^[13]的研究中，由于樣本量的限制，未能識(shí)別儲(chǔ)存在-23 ℃或-80 ℃ 下顱骨瓣的不同感染行為。所以，未來(lái)仍需要進(jìn)行大型前瞻性研究來(lái)進(jìn)一步闡明這一結(jié)論。車東方等^[14]研究顯示，深低溫（-80 ℃）保存自體CP感染率低，能夠避免或推遲進(jìn)行人工材料二次修補(bǔ)。李斌等^[15]的研究顯示，于DC后12周內(nèi)（-80 ℃保存時(shí)間＜3個(gè)月）接受顱骨瓣修補(bǔ)術(shù)的并發(fā)癥總發(fā)生率低于12周后（-80 ℃保存時(shí)間＞3個(gè)月）的發(fā)生率。Chan等^[16]發(fā)現(xiàn)，冷凍超過(guò)4個(gè)月的顱骨瓣沒(méi)有成骨細(xì)胞存活，而且骨瓣細(xì)菌污染率為27.8%。本研究顯示，自體顱骨冷凍保存平均時(shí)間122.9 d，感染率為1.7%。Mirabet等^[17]發(fā)現(xiàn)，將自體顱骨儲(chǔ)存在-80 ℃～-70 ℃的比例為69.6%，儲(chǔ)存前刮除骨膜的比例為31.2%，不使用冷凍保護(hù)劑的比例為95.8%，在室溫下解凍的比例為79.1%。本研究的儲(chǔ)存方法是刮除骨膜，生理鹽水沖洗兩遍，雙層無(wú)菌袋包裝后置于-80 ℃冰箱保存。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)新方案應(yīng)用之后，顱內(nèi)感染率由3.4%降低到1.7%，腦脊液漏發(fā)生率由0.9%降低到0%，腦積水的發(fā)生率由2.6%降低到0%，頭痛的發(fā)生率沒(méi)有發(fā)生變化。如何降低自體顱骨回植后感染率及并發(fā)癥，對(duì)于臨床醫(yī)生一直是一個(gè)挑戰(zhàn)。而且，Sahoo等^[18]研究發(fā)現(xiàn)，任何重建術(shù)的并發(fā)癥都是多因素的，顱骨成形術(shù)的并發(fā)癥廣泛歸因于最初基礎(chǔ)病理的性質(zhì)、重建材料的類型以及顱骨成形術(shù)手術(shù)的技術(shù)。近年來(lái)，對(duì)于自體顱骨的保存方法的探索報(bào)道很少。陳小川等^[19]提供了一種自體顱骨深低溫保存方法，通過(guò)改變骨組織的包裝介質(zhì)（納米羥基磷灰石聚乙烯醇凝膠），來(lái)降低骨組織因感染而廢棄的情況，同時(shí)能夠提高植入后的成骨效果。林衛(wèi)軍等^[20]將顱骨瓣進(jìn)行超聲波清洗后進(jìn)行真空包裝，然后用放射性元素（鈷60的輻照劑量為20 kGy～25 kGy）對(duì)真空包裝的顱骨瓣進(jìn)行輻照滅菌，之后放入溫度為-80～-40 ℃的環(huán)境下保存即可。該方法雖然對(duì)細(xì)胞有破壞，但蛋白活性未被滅，骨引導(dǎo)物活性存在，與高壓高溫消毒比較有明顯優(yōu)點(diǎn)。Melin等^[21]的研究顯示，在冷凍保存前，使用脈沖灌洗的方法處理骨瓣，可有效降低細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率，且不增加顱骨成形術(shù)后SSI感染頻率。

綜上，經(jīng)過(guò)不斷優(yōu)化和改良，本研究已制定專用的顱骨凍存架和相應(yīng)的管理流程，其不僅可以隔絕外界環(huán)境對(duì)顱骨的污染，而且可以準(zhǔn)確快速定位，杜絕查找時(shí)出現(xiàn)差錯(cuò)，降低存取操作對(duì)其他顱骨溫度的影響。另外，新保存方案和管理流程應(yīng)用之后，顱內(nèi)感染率由3.4%降低到1.7%，這說(shuō)明本研究的保存方案是可行的。本研究會(huì)進(jìn)一步優(yōu)化自體顱骨保存方法（-80 ℃和-196 ℃）和相對(duì)應(yīng)的管理流程，并通過(guò)臨床病案調(diào)查和電話隨訪調(diào)查研究、實(shí)驗(yàn)室研究、影像學(xué)檢查等對(duì)創(chuàng)新管理保存方案應(yīng)用之前和應(yīng)用之后的數(shù)據(jù)進(jìn)行回植效果評(píng)價(jià)研究。最終的目標(biāo)是優(yōu)化一套標(biāo)準(zhǔn)的自體顱骨冷凍保存的管理方案及流程，在寧夏地區(qū)乃至周邊省份的縣級(jí)醫(yī)療單位進(jìn)行推廣應(yīng)用，為更多的病患減輕就醫(yī)負(fù)擔(dān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：趙芳負(fù)責(zé)論文的整體實(shí)施、包括研究設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)收集、整理和分析以及論文的撰寫(xiě)和修改；馬佳祥主要負(fù)責(zé)凍存架的設(shè)計(jì)和協(xié)助隨訪數(shù)據(jù)的收集；趙丹、張慶主要協(xié)助隨訪數(shù)據(jù)的收集、整理；潘小亮主要協(xié)助管理流程的制定和隨訪數(shù)據(jù)的收集；崔鵬主要負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析以及論文修改。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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（收稿2023-07-19 修回2023-08-02）