馬鈴薯StWRKY51基因的克隆及在高溫脅迫下的表達分析

摘" " 要：為研究馬鈴薯StWRKY51基因在高溫脅迫下的響應(yīng)特性，利用RT-PCR技術(shù)從Russet Burbank馬鈴薯葉片中克隆得到StWRKY51基因，并對其進行了生物信息學(xué)分析和高溫脅迫下的表達分析。結(jié)果表明，馬鈴薯StWRKY51基因開放閱讀框為696 bp，編碼231個氨基酸，與潘那利番茄、番茄和辣椒的氨基酸序列相似性高于80%。生物信息學(xué)分析表明，StWRKY51屬于酸性穩(wěn)定親水性蛋白，其二級結(jié)構(gòu)元件中無規(guī)則卷曲比例最高達63.64%。結(jié)構(gòu)域分析顯示，StWRKY51含有1個典型的WRKY保守結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為 C2H2型，屬于第II亞家族。熒光定量PCR結(jié)果顯示，馬鈴薯StWRKY51基因在高溫處理后被顯著誘導(dǎo)表達，表明StWRKY51基因可能在馬鈴薯抵御高溫脅迫中起到一定的調(diào)控作用。該結(jié)果為進一步探究 StWRKY51 在馬鈴薯熱脅迫中發(fā)揮的功能提供參考。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；基因克?。槐磉_分析

中圖分類號：S532 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）07-052-07

Cloning and expression analysis of StWRKY51 gene in potato under heat stress

NIU Suyan1， ZHANG Zhenhua1， CHEN Man2， JIANG Suhua1， ZHANG Yan1， XU Shenping1， WANG Mofei1， CUI Bo1

（1. Zhengzhou Normal University， Zhengzhou 450044， Henan， China; 2. Zhengzhou Academy of Agricultural Science and Technology， Zhengzhou 450015， Henan， China）

Abstract： To explore the response characteristics of potato StWRKY51 gene under high temperature stress， the StWRKY51 gene was cloned from leaf of the potato cultivar Russet Burbank by RT-PCR technology， and bioinformatics analysis of this gene and the real-time fluorescence quantitative PCR for StWRKY51 expression in potato under the high temperature stress were performed in this study. The results were as follows： The open reading frame of StWRKY51 gene is 696 bp， encoded 231 amino acids; the amino acid sequence of StWRKY51 protein was more than 80% similar to that of Solanum pennellii， Solanum lycopersicum and Capsicum annuum; the StWRKY51 was belong to an acidic and stable hydrophilic protein， and the ratio of irregular curl in the secondary structure of protein was up to 63.64%. The domain analysis showed that StWRKY51 gene encoding protein had a typical WRKY conserved domain， and the zinc finger structure is C2H2 type， belonging to the Group Ⅱ subfamily. The qPCR results showed that the expression of StWRKY51 gene was significantly induced under high temperature treatment， indicating that StWRKY51 gene may play a regulation role in potato resistance to high temperature stress. The research provided a reference for further study on the function of StWRKY51 response to high temperature stress in potato.

Key words： Potato; WRKY transcription factor; Gene cloning; Expression analysis

全球氣候變暖引起的高溫是當(dāng)前影響作物生長發(fā)育和產(chǎn)量最嚴(yán)重的自然災(zāi)害之一[1]。高溫脅迫會影響細胞結(jié)構(gòu)和代謝功能等多個生理過程，如蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的改變，蛋白質(zhì)合成和酶活性的變化，細胞結(jié)構(gòu)和細胞膜的功能，有害物質(zhì)活性氧的產(chǎn)生，代謝途徑的解耦聯(lián)及光合系統(tǒng)的損害，從而影響植物的生長發(fā)育、品質(zhì)和產(chǎn)量[2]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是一類主要存在于植物中的鋅指型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)等多種生理活動[3-6]。越來越多的研究證明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與了植物響應(yīng)高溫脅迫[7-8]。例如，熱脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子文心蘭OnWRKY1和辣椒CaWRKY40 基因在高溫脅迫處理后表達量均顯著升高[9-10]。此外，在高溫脅迫下，擬南芥AtWRKY25和AtWRKY26的表達被誘導(dǎo)，而AtWRKY33的表達被抑制；通過對功能獲得性突變體和功能缺失性突變體的分析，發(fā)現(xiàn)AtWRKY25、AtWRKY26 和AtWRKY33蛋白能通過增強Hsps 基因Hsp101和Zat10的表達提高擬南芥的耐熱性，而缺失突變體植株對高溫脅迫的敏感性也顯著增強[11]。水稻OsWRKY11基因的表達也受高溫的誘導(dǎo)，HSP101啟動子啟動的OsWRKY11基因表達后提高了水稻的耐熱性[7]。另外，擬南芥的AtWRKY39 基因能夠通過SA（salicylicacid）和JA（jasmonic acid）介導(dǎo)的信號途徑促進高溫脅迫應(yīng)答[12]。

馬鈴薯是世界上僅次于水稻、小麥和玉米的第四大糧食作物，既可作為蔬菜也可作為主食，其可持續(xù)生產(chǎn)對全球糧食安全起著至關(guān)重要的作用。馬鈴薯對溫度非常敏感，當(dāng)土壤溫度高于18 ℃，且環(huán)境氣溫白天高于30 ℃或晚上高于23 ℃時，就會導(dǎo)致馬鈴薯源庫關(guān)系失衡，延遲塊莖的形成和膨大，最終導(dǎo)致塊莖畸形和壞死，從而嚴(yán)重影響馬鈴薯產(chǎn)量[13-16]。此外，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在高溫（35 ℃/28 ℃，白天/黑夜）脅迫下，馬鈴薯葉片的葉綠素含量增加，葉片變小且葉片的長度和寬度比例下降，同時馬鈴薯地上部分徒長[8]；早熟型馬鈴薯品種的產(chǎn)量受高溫脅迫的影響小于晚熟型馬鈴薯品種，且高溫脅迫下多數(shù)品種的塊莖被誘導(dǎo)發(fā)芽[17-18]。因此，發(fā)掘和克隆馬鈴薯耐熱相關(guān)基因?qū)ε嘤蜔嵝择R鈴薯新品種具有重要意義。

筆者所在的馬鈴薯分子育種課題組前期對高溫脅迫下Russet Burbank馬鈴薯品種的幼苗進行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子WRKY51 在高溫處理的品種中表達量顯著上調(diào)[17]。筆者從馬鈴薯品種Russet Burbank中克隆獲得StWRKY51基因，通過生物信息學(xué)網(wǎng)站和軟件對該基因編碼的蛋白進行了結(jié)構(gòu)域預(yù)測、理化性質(zhì)分析、多重序列比對、系統(tǒng)進化樹構(gòu)建等生物信息學(xué)分析，并通過熒光定量PCR 技術(shù)對該基因進行了表達分析，以期為進一步開展對StWRKY51 基因的研究和培育耐高溫馬鈴薯新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2021年3－8月在鄭州師范學(xué)院生物工程研究中心進行，馬鈴薯品種Russet Burbank由本實驗室保存。植物生長條件為溫度22 ℃/18 ℃（白天/黑夜），濕度70%，光周期14 h/10 h（光照/黑暗）。生長30 d后，選取長勢一致的植株分成2組進行不同溫度處理，每組3盆，3次重復(fù)。其中一組放置在32 ℃/26 ℃（白天/黑夜）作為高溫處理，其余放置在22 ℃/18 ℃（白天/黑夜）作為對照。處理3 d后，分別收集不同植株的第2片展開葉，將液氮速凍后放置在-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取及基因克隆

取0.8 g馬鈴薯葉片置于研缽中，加入液氮，快速研磨成粉末，嚴(yán)格按照MOEGA Hp plant RNA Kit植物總RNA提取試劑盒說明書進行葉片總RNA的提取。根據(jù)馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫Spud DB中的StWRKY51基因（PGSC0003DMG400031140）序列設(shè)計特異性引物（表1）。利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以該cDNA為模板利用引物StWRKY51-F和StWRKY51-R進行目的片段的擴增。擴增結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將符合預(yù)期大小的片段回收并連接到pMD19-T載體后進行DNA測序。

1.3 馬鈴薯WRKY51蛋白序列的生物信息學(xué)分析

利用ORF Finder（http：//www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html）在線軟件預(yù)測目的基因的開放閱讀框；利用NCBI BlastP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastp）在線分析軟件對WRKY51蛋白進行同源性比對分析，采用MEGA 7.0.14軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；利用ExPasy網(wǎng)站的ProtParam（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/）工具分析WRKY51蛋白的理化性質(zhì)和ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）工具進行親疏水性分析；利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma. html）工具預(yù)測馬鈴薯WRKY51的二級結(jié)構(gòu)。

1.4 馬鈴薯高溫脅迫處理及WRKY51基因的表達分析

根據(jù)獲得的StWRKY51基因序列設(shè)計特異性引物，并以馬鈴薯EF1a基因作為內(nèi)參基因（表1）。利用熒光定量PCR技術(shù)，分析該基因在高溫脅迫（32 ℃/26 ℃，白天/黑夜）和正常溫度（22 ℃/18 ℃，白天/黑夜）下的表達狀況。采用FastStart Universal SYBR Green Master （ROX）（Roche Mannheim， Germany）試劑盒，按照說明書的操作步驟進行。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s；72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，每個樣本設(shè)3次重復(fù)。并計算基因的相對表達量，一般用2-△△Ct的方法進行標(biāo)準(zhǔn)化計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯WRKY51基因的克隆及蛋白結(jié)構(gòu)域分析

以Russet Burbank馬鈴薯葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進行PCR擴增，獲得1個核苷酸序列長度為884 bp的片段（圖1）。將該條帶回收純化后，連接到PMD9-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進行菌落PCR篩選，將獲得的陽性克隆送到生物公司測序。序列分析顯示，StWRKY51基因開放閱讀框為696 bp，編碼231個氨基酸（圖2）。通過 NCBI 保守結(jié)構(gòu)域分析網(wǎng)站對該蛋白進行預(yù)測，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子 StWRKY51在150～207個氨基酸殘基范圍內(nèi)含有一個 WRKY 保守結(jié)構(gòu)域（圖3），鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型，屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子第Ⅱ亞家族。

2.2 WRKY51氨基酸序列同源分析

利用NCBI BlastP在線分析軟件對WRKY51蛋白進行同源性比對分析，結(jié)果表明，WRKY51氨基酸序列與NCBI中報道的潘那利番茄（Solanum pennellii）序列一致性為86.64%，與番茄（Solanum lycopersicum）序列一致性為86.21%，與辣椒（Capsicum annuum）的一致性為81.06%，且都含有WRKY典型的保守結(jié)構(gòu)域WRKYGKK（圖4）。從NCBI下載了其他11種不同植物的WRKY51氨基酸序列，利用MEGA 7.0.14軟件采用相鄰連接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖5）。結(jié)果顯示，馬鈴薯WRKY51與茄科植物處于同一個分支上，與潘那利番茄和番茄進化距離最短，表明與番茄和潘那利番茄的親緣關(guān)系最近，與辣椒和煙草（Nicotiana tabacum）次之，與咖啡樹（Coffea arabica）、陸地棉（Gossypium hirsutum）、毛果楊（Populus trichocarpa）、栓皮櫟（Quercus suber）和橡膠樹（Hevea brasiliensis）等的親緣關(guān)系較遠。

2.3 WRKY51蛋白的理化性質(zhì)和親疏水性分析

通過Expasy ProtParam對WRKY51蛋白進行分析，結(jié)果顯示，WRKY51蛋白的正電殘基數(shù)目為25，負電殘基數(shù)目為27。理論等電點為6.59，相對分子質(zhì)量為26.68 kDa，不穩(wěn)定系數(shù)為34.42，預(yù)測為穩(wěn)定性蛋白。利用 Expasy ProtScale 軟件分析顯示，WRKY51蛋白質(zhì)序列具有較高的親水性，其中第 60 位氨基酸的疏水性最強（異亮氨酸，1.644），第133位氨基酸的親水性最強（賴氨酸，-3.300），親水性平均值為-1.065。整體來看，親水性氨基酸均勻分布在整個肽鏈中，且多于疏水性氨基酸，因此整個多肽鏈表現(xiàn)為親水性，可以判斷是親水性蛋白（圖 6）。

2.4 WRKY51的二級結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA軟件對馬鈴薯WRKY51蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示，α螺旋占比為12.99%、延伸占比為18.18%、β折疊占比為5.19%、無規(guī)則卷曲占比為63.64%。無規(guī)則卷曲相較于其他3種結(jié)構(gòu)所占比例最大（圖7）。

2.5 馬鈴薯StWRKY51基因在高溫脅迫下的表達分析

通過熒光定量PCR技術(shù)分析了StWRKY51基因在高溫處理下（32 ℃/26 ℃，白天/黑夜）和正常情況下（22 ℃/18 ℃，白天/黑夜，對照）馬鈴薯葉片中的表達情況。結(jié)果顯示，馬鈴薯StWRKY51基因在高溫處理后其相對表達量顯著升高，是正常溫度下相對表達量的3倍（圖8），說明馬鈴薯WRKY51基因可以被高溫脅迫誘導(dǎo)表達。

3 討論與結(jié)論

馬鈴薯是一種糧菜兼用型作物，自農(nóng)業(yè)部于2016年2月正式發(fā)布《關(guān)于推進馬鈴薯產(chǎn)業(yè)開發(fā)的指導(dǎo)意見》，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)規(guī)?；l(fā)展開來，其種植面積逐年增加。馬鈴薯喜涼且不耐高溫，對熱脅迫非常敏感，當(dāng)土壤溫度高于18 ℃時，就會嚴(yán)重影響其塊莖的產(chǎn)量和品質(zhì)[15]，而我國夏季多地普遍高溫，因此嚴(yán)重制約了馬鈴薯的生產(chǎn)。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族參與調(diào)控植物生長發(fā)育過程中遇到的多種生物脅迫和非生物脅迫，包括高溫脅迫 [3-4，19-20]。本課題組前期分析馬鈴薯高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出響應(yīng)高溫脅迫的馬鈴薯轉(zhuǎn)錄因子StWRKY51。為了進一步探究該基因的功能，利用RT-PCR技術(shù)成功克隆了馬鈴薯StWRKY51基因，該基因開放閱讀框為696 bp，編碼231個氨基酸。蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，α螺旋占12.99%、延伸占18.18%、β折疊5.19%、無規(guī)則卷曲占63.64%。StWRKY51蛋白的氨基酸序列與潘那利番茄、番茄和辣椒的氨基酸序列相似性分別為86.64%、86.21%和81.06%。親緣關(guān)系分析的結(jié)果表明，馬鈴薯StWRKY51蛋白與番茄和潘那利番茄的親緣關(guān)系最近，表明馬鈴薯StWRKY51蛋白可能與潘那利番茄和番茄WRKY51蛋白具有相似的功能和作用機制。

根據(jù)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域N端包含的七肽保守域（WRKYGQK）數(shù)量和C端的鋅指結(jié)構(gòu)類型，可將WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為三大類。有研究表明，第Ⅱ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子的七肽保守域和鋅指結(jié)構(gòu)總是發(fā)生不同程度的變異，是由Ⅰ類通過N端和C端WRKY保守結(jié)構(gòu)域不斷變異而演化來的[21-22]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)馬鈴薯WRKY51屬于第Ⅱ大類WRKY家族成員，且七肽保守結(jié)構(gòu)域變異為WRKYGKK，該現(xiàn)象和已報道的其他物種如水稻、擬南芥和高粱中出現(xiàn)的第Ⅱ類WRKY成員中七肽保守域中Q突變?yōu)镵的情況一致[22-24]。

WRKY第Ⅱ類家族成員的變異性決定了其功能的多樣性，在擬南芥中，AtWRKY51基因可通過JA或ABA信號途徑實現(xiàn)對干旱和鹽脅迫的正調(diào)控作用 [25]；在小麥中，TaWRKY51基因在不同的非生物脅迫（包括低溫、氯化鈉、ABA等）條件下被顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達 [26]；此外，在TYZ.1號油橄欖中，發(fā)現(xiàn)WRKY51基因可通過調(diào)節(jié)細胞中脯氨酸、丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白含量來抵御脅迫的危害[27]。在馬鈴薯中，StWRKY51基因在高溫脅迫植株中的表達量是正常生長條件下的3倍，與這些作物的基因表達趨勢一致，表明其可能與他們有相似的功能，不僅僅局限于響應(yīng)高溫脅迫。本研究結(jié)果為馬鈴薯WRKY51轉(zhuǎn)錄因子的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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收稿日期：2023-08-20；修回日期：2024-03-27

基金項目：河南省科技攻關(guān)計劃項目（242102110258）；河南省高等學(xué)校重點科研項目（24A210027）；鄭州師范學(xué)院高層次人才科研啟動專項經(jīng)費（2018）；鄭州師范學(xué)院“提質(zhì)工程”項目（ZHJX-2022001232253）；鄭州師范學(xué)院開放研究基金資助項目（2019）

作者簡介：牛蘇燕，講師，主要研究方向為薯類作物育種及功能基因組學(xué)。E-mail：niusuyan@zznu.edu.cn

通信作者：崔" " 波，教授，主要研究方向為植物分子育種。E-mail：laocuibo@163.com