赤水烏骨雞ADSL基因的組織表達(dá)特征及其干擾載體構(gòu)建

摘要：【目的】探究赤水烏骨雞胸肌組織中腺苷琥珀酸裂解酶基因（ADSL）表達(dá)特征及其目的基因的干擾載體構(gòu)建，為深入研究畜禽組織肌肉中肌苷酸（IMP）的表達(dá)規(guī)律及ADSL基因影響畜禽風(fēng)味的機(jī)制提供理論參考?！痉椒ā恳圆煌慢g（3、4、5和6月齡）的赤水烏骨雞（公雞和母雞各半）為試驗(yàn)材料，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同月齡及不同性別赤水烏骨雞胸肌組織中ADSL基因的表達(dá)情況；同時(shí)根據(jù)GenBank中雞ADSL基因mRNA序列（NM_205529.2）設(shè)計(jì)4對(duì)短發(fā)夾RNA（shRNA）干擾序列（shl-ADSL、sh2-ADSL、sh3-ADSL和sh4-ADSL）和1對(duì)陰性對(duì)照序列（sh-NC）與pGPH1/GFP/Neo載體連接后進(jìn)行測(cè)序，將構(gòu)建成功的ADSL基因干擾載體轉(zhuǎn)染至成肌細(xì)胞，檢測(cè)并篩選出干擾效率最高的干擾載體?！窘Y(jié)果】ADSL基因在不同月齡赤水烏骨雞胸肌組織中的相對(duì)表達(dá)量排序?yàn)?月齡gt;4月齡gt;6月齡gt;3月齡，赤水烏骨母雞3月齡母雞的ADSL基因相對(duì)表達(dá)量極顯著高于公雞（Plt;0.01，下同），4月齡母雞ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于公雞（Plt;0.05），6月齡母雞ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著低于公雞；ADSL基因質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果顯示干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后干擾組及陰性對(duì)照均可見(jiàn)綠色熒光，空白對(duì)照不發(fā)光，說(shuō)明各重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染赤水烏骨雞成肌細(xì)胞；ADSL基因沉默結(jié)果顯示，sh2-ADSL沉默效果最佳，干擾效率為90.30%.【結(jié)論】赤水烏骨雞胸肌中ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量隨著月齡增加表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢(shì)；3、4和5月齡赤水烏骨母雞ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量高于公雞，隨著月齡增加ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量增加，公雞和母雞間的差異減小。成功分離提取赤水烏骨雞成肌細(xì)胞，并篩選出RNA干擾效果最佳載體sh2-ADSL，為后續(xù)研究ADSL基因調(diào)控雞肉肌苷酸及風(fēng)味的分子機(jī)制提供參考。

關(guān)鍵詞：赤水烏骨雞；ADSL基因；組織表達(dá)；成肌細(xì)胞；干擾載體；肉質(zhì)風(fēng)味

中圖分類號(hào)：S831.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）01-0226-09

Expression characteristics of ADSL gene in pectoral muscle tissue of Chishui black-bone chicken and the construction of ADSL gene interference vector

YU Huan'，WANG Cheng-dong2，LI Hui'*，CHEN You-bo'，SHI Yu-shi1，ZHAO De-peng1，LONG Xia1，TAN Qi-song'

（'Key Laboratory of Genetic Breeding and Reproduction of Plateau Mountain Animals，Ministry of Education，Guizhou University/Guizhou Provincial Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding and Reproduction，Guiyang，Guizhou550025，China;2Bijie Economic Crops Workstation，Bijie，Guizhou551700，China）

Abstract：[Objective]This experiment was carried out to investigate the expression characteristics of adenylosucci-nate lyase gene（ADSL）in the pectoral muscle tissue of Chishui black-bone chicken and to construct the interference vec-tor of the target gene，.which provided atheoretical reference for an in-depth study of theexpressionpattern of inosine mo-nophosphate acid（IMP）in the muscles of livestock tissues and the mechanism by which the ADSL gene affected the fla-vour of livestock and poultry.【Method]Chishui black-bone chicken（half male and half female）of different ages（3，4，5and6months old）were used as experimental materials.The expression ofADSL gene in the pectoral muscle tissue of Chishui black-bone chicken at different ages was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.Meanwhile，fourpairs of shorthairpinRNA（shRNA）interference sequences（sh1-ADSL，sh2-ADSL，sh3-ADSL and sh4-ADSL）and onepair of negative control sequences（sh-NC）were designed according to the mRNA sequence of chicken ADSL gene inGen-Bank（NM_205529.2）.They were sequenced after ligated with pGPHI/GFP/Neo vector.The constructed ADSL gene inter-fering vectors were transfected into myoblasts，and the most efficient interference vector was detected and screened.【Result]The relative expression level of ADSL gene in the pectoral muscle tissue of Chishui black-bone chicken at diffe-rent months age was in the order of5monthsgt;4monthsgt;6monthsgt;3months.The relative expression level of ADSL genein the pectoral muscle tissue of Chishui black-bone chicken was extremely significantly higher in3-month-old femalesthan inmales（Plt;0.01，the same bellow）.The relative expression level ofADSL gene was significantly higher in4-month-old females than in males（Plt;0.05）.The relative expression level of ADSL gene was extremely significant lower in6-month-old females than in males.The sequencing results of the ADSL plasmid showed that the interference plasmid wassuccessfully constructed and the green fluorescewas observed in the interference group and the negative control afterplas-mid transfection，and the blank control showed no fluoresce，indicating that each recombinant plasmid successfully trans-fected the myoblasts of Chishui black-bone chicken.The ADSL gene silencing results showed that sh2-ADSL silencingeffect was the optimal，with an interference efficiency of90.30%.【Conclusion]The relative expression level of ADSLgene shows atrend of increasing and then decreasing with the increase of month age.The relative expression level of ADSL gene in the pectoral muscle tissueof females at3，4and5months old higherthan that of males.The relative expres-sion level of ADSL genes increases with increasing month age，and the differences between males and females decrease.The experiment is successful in isolating and extracting myoblast from Chishui black-bone chicken，and screening out thesh2-ADSL vector with the best RNA interference effect.This study provides areference for further research on the molecu-lar mechanism of ADSL gene regulation of meat inosinate and flavor

Key words：Chishui black-boned chicken;ADSL gene;tissue expression;myoblast;interference vectors;meat flavor

Foundation items：Guizhou Science and Technology Support Project（Key Project in Agriculture）（QKHZC〔2022〕034）;Scientific Research Projectof Guizhou Department of Education（Qianjiaoji[2022]061）

0引言

【研究意義】腺苷琥珀酸裂解酶（Adenylosucci-nate lyase，ADSL）基因作為影響肌肉肌苷酸（Ino-sine monophosphate acid，IMP）含量的主效基因，在IMP合成代謝中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。諸多研究表明，ADSL基因與畜禽IMP含量具有顯著相關(guān)性（豆騰飛等，2017;Mao et al.，2018;曹少奇等，2019）。研究發(fā)現(xiàn)，ADSL基因在北京油雞（劉長(zhǎng)青等，2008）和靜原雞（虎紅紅等，2020）胸肌中高表達(dá)。因此，加強(qiáng)ADSL基因在不同畜禽組織中的表達(dá)研究，對(duì)深入研究畜禽組織IMP的表達(dá)規(guī)律，探究ADSL基因影響畜禽風(fēng)味的機(jī)制及其在畜禽育種中的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ADSL是IMP合成酶系中唯一雙功能酶，屬于精氨酸琥珀酸裂解酶/富馬酸酶C超家族（Tsai et al.，2007），可在同一活化位點(diǎn)有2個(gè)重要的生成IMP的非連續(xù)催化反應(yīng)。已有研究表明，ADSL對(duì)機(jī)體的糖代謝起調(diào)節(jié)作用（Wang et al.，2021），低能量攝入狀態(tài)下，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)白豬肝臟、肌肉和脂肪等組織中ADSL基因表達(dá)量顯著上調(diào)（李慶海等，2013）。季從亮（2005）在ADSL基因中發(fā)現(xiàn)5個(gè)分布情況與雞種相關(guān)的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)；常山等（2008）發(fā)現(xiàn)ADSL基因外顯子2中有2個(gè)中度多態(tài)性突變位點(diǎn)；Shu等（2009）發(fā)現(xiàn)雞肌肉中TT基因型突變位點(diǎn)的ADSL基因在IMP含量中占優(yōu)勢(shì)；石浩等（2015）預(yù)測(cè)米易雞ADSL基因第9外顯子與IMP含量顯著關(guān)聯(lián)；Mao等（2018）通過(guò)檢測(cè)家鴿胸肌IMP含量，發(fā)現(xiàn)ADSL基因的11個(gè)外顯子中AA和AB基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，ADSL基因與家鴿肉質(zhì)和胴體性狀有密切的相關(guān)性，其單核苷酸多態(tài)性可作為家鴿分子標(biāo)記輔助育種的遺傳標(biāo)記。張梅（2018）研究表明，玫瑰冠雞ADSL基因表達(dá)量與肌肉IMP含量呈顯著正相關(guān)。此外，ADSL基因在人體和動(dòng)物體內(nèi)的分布及表達(dá)量有著明顯差異，在人體不同組織器官中均能檢測(cè)到ADSL基因的存在（Kmoch et al.，2000），而北京油雞的胸肌為ADSL基因的優(yōu)勢(shì)表達(dá)組織（劉長(zhǎng)青等，2008）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】赤水烏骨雞作為貴州省優(yōu)良地方品種，具有肉質(zhì)鮮美、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，但目前關(guān)于ADSL基因在赤水烏骨雞上的研究鮮有報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ADSL基因在赤水烏骨雞不同發(fā)育階段胸肌組織中的表達(dá)情況，探究其在赤水烏骨雞胸肌發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律；同時(shí)構(gòu)建ADSL基因干擾載體，驗(yàn)證ADSL基因的干擾效果，以期為研究畜禽組織IMP的表達(dá)規(guī)律，探究ADSL基因調(diào)控肌苷酸的分子機(jī)制及其在畜禽育種中的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

赤水烏骨雞由貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心提供，受精蛋購(gòu)自貴州竹香雞養(yǎng)殖有限公司，將受精蛋放入孵化機(jī)，在37.8℃、相對(duì)濕度60%的環(huán)境中孵化至出殼。選取同一批孵化、體質(zhì)量相近、健康水平一致的赤水烏骨雞，屠宰處于不同月齡（3、4、5和6月齡）的赤水烏骨雞共48只（公雞和母雞各半）。胎牛血清（FBS）和Opti-MEMTM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；瓊脂糖、0.25%胰蛋白酶、4%多聚甲醛、青鏈霉素、DAPI細(xì)胞核染料、RIPA裂解液、TriX-100通透液、已過(guò)濾除菌型PBS緩沖液（pH7.2～7.4）、DMEM-F12培養(yǎng)基和I型膠原酶購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；LipofectamineM3000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitro-gen生命技術(shù)公司；TRIzol試劑盒、DEPC水、TAE、異丙醇、無(wú)水乙醇和液氮購(gòu)自貴州格瑞恩生物技術(shù)有限公司；T4DNA連接酶、RevertAid反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液、RT-qPCR Mix和cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；DL2000DNAMark購(gòu)自北京擎科生物有限公司；2×Taq PCR Master Mix、DNA凝膠回收試劑盒和無(wú)內(nèi)毒素小提中量試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。動(dòng)物試驗(yàn)由貴州大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：EAE-GZU-2020-E019）。

1.2組織RNA提取及cDNA合成

使用根據(jù)TRIzol試劑盒提取赤水烏骨雞胸肌組織RNA，檢測(cè)RNA濃度和純度，低溫保存。采用RevertAid反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，檢測(cè)濃度和純度后保存在-20℃冰箱。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中雞ADSL和β-actin基因的mRNA序列編碼區(qū)（CDS），運(yùn)用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物（表1），送至重慶擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.4赤水烏骨雞成肌細(xì)胞分離及鑒定

取1日齡生理狀態(tài)良好的赤水烏骨雞胸肌，PBS緩沖液（pH7.2～7.4）清洗后剔除脂肪，剪碎后加入大約2倍體積的1%I型膠原酶，37℃搖床消化1～2h，依次過(guò)200和400目的細(xì)胞篩，在濾液中加入15%血清濃度的DMEM-F12培養(yǎng)基終止消化，1200r/min離心10min棄上清液，利用差速離心法獲得成肌細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基至細(xì)胞瓶和6孔板中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)、密度和貼壁狀態(tài)等。利用成肌細(xì)胞中的肌間線蛋白（Desmin），對(duì)細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光鑒定，具體操作參照吳玉麟（2021）。

1.5shRNA引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)雞ADSL基因mRNA序列（NM_205529.2），結(jié)合shRNA原則，利用在線網(wǎng)站（https：/rnaidesigner.Thermofisher.com/rnaiexpress）設(shè)計(jì)ADSL基因效率相對(duì)較高的4個(gè)干擾靶序列與1個(gè)陰性對(duì)照序列（sh-NC）。設(shè)計(jì)4對(duì)shRNA片段并分別命名為shl-ADSL、sh2-ADSL、sh3-ADSL和sh4-ADSL。在引物正義鏈端添加Bbs I酶切位點(diǎn)，反義鏈端添加BamH I酶切位點(diǎn)，中間加入loop結(jié)構(gòu)，引物委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，ADSL基因shRNA序列信息見(jiàn)表2。

1.6ADSL基因干擾載體構(gòu)建及鑒定

取10μg pGPH1/GFP/Neo載體，37℃酶切1h，回收目的條帶，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并估算濃度，稀釋濃度至50ng/μL，酶切體系共150.0μL：10×Buffer G15.0μL、Bbs I3.0μL、BamH I3.0μL、pGPH1/GFP/Neo載體10μL，ddH?O補(bǔ)足至150.0μL。隨后在22℃下連接24h，載體連接體系23.0μL：10×T4連接酶緩沖液2.0μL，經(jīng)Bbs I/BamHI酶切后的pGPH1/GFP/Neo載體1.0μL，shRNADNA1.0μL，T4連接酶4.0μL，ddH?O15.0μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，倒置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h，挑菌擴(kuò)繁后提取質(zhì)粒，送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.7ADSL基因干擾載體轉(zhuǎn)染赤水烏骨雞成肌細(xì)胞

待6孔細(xì)胞板中細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)60%～80%時(shí)，提前2h將培養(yǎng)基更換成新鮮的只含15%血清的DMEM-F12培養(yǎng)基，然后用250μLOpti-MEMTM和3.75μL P3000稀釋2500ng測(cè)序成功后的無(wú)內(nèi)毒素重組質(zhì)粒，將轉(zhuǎn)染混合液放入37℃培養(yǎng)箱孵育15min后加入到6孔細(xì)胞板中培養(yǎng)24～36h，每樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞RNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)胸肌組織及細(xì)胞ADSL基因的表達(dá)情況。反應(yīng)體系10.0μL：cDNA模板0.8μL，上、下游引物各0.5μL，2×SYBRqPCR Master Mix5.0μL，ddH?O補(bǔ)足至10.0μL。擴(kuò)增程序：50℃激活2min;95℃預(yù)變性2min;95℃15s，58℃15s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72℃延伸1min。以β-actin為內(nèi)參基因，對(duì)ADSL基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，ADSL基因相對(duì)表達(dá)量以其對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照組（NC）表達(dá)量為1，采用24^-??Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組內(nèi)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，并使用LSD法和鄧肯法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1ADSL基因引物特異性檢測(cè)結(jié)果

為檢測(cè)ADSL引物特異性，試驗(yàn)采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1）顯示，目的條帶清晰且單一，與預(yù)測(cè)片段大小一致，不存在非特異性擴(kuò)增，可用于后續(xù)試驗(yàn)。對(duì)ADSL基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，由圖2可知，擴(kuò)增曲線表現(xiàn)為平滑的S形，熔解曲線呈單峰，證明引物特異性良好、cDNA第一鏈質(zhì)量良好，該引物可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2ADSL基因在赤水烏骨雞不同時(shí)期的表達(dá)情況

由圖3可知，5月齡赤水烏骨雞胸肌組織ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量最高，3月齡最低，二者間差異極顯著（Plt;0.01，下同）;4月齡赤水烏骨雞胸肌組織中ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于3月和6月齡，但3月和6月齡間無(wú)顯著差異（Pgt;0.05，下同），ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量排序?yàn)?月齡gt;4月齡gt;6月齡gt;3月齡。

2.3赤水烏骨公雞和母雞胸肌組織中ADSL基因表達(dá)差異分析結(jié)果

由赤水烏骨雞公雞和母雞ADSL基因表達(dá)譜（圖4）可知，3、4和5月齡母雞胸肌組織中ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量均高于公雞，其中，二者差異在3月齡時(shí)達(dá)極顯著水平，在4月齡達(dá)顯著水平（Plt;0.05），5月齡差異不顯著。6月齡赤水烏骨雞母雞ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著低于公雞。

2.4赤水烏骨雞成肌細(xì)胞培養(yǎng)鑒定結(jié)果

如圖5所示，赤水烏骨雞成肌細(xì)胞細(xì)胞核在DAPI核染下呈藍(lán)色（圖5-A），加入Desmin一抗孵育后的表達(dá)為紅色（圖5-B），細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間Merge后完全重合（圖5-C），表明成功培養(yǎng)出赤水烏骨雞成肌細(xì)胞，經(jīng)鑒定細(xì)胞純度在90%以上，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.5測(cè)序鑒定ADSL基因的干擾載體結(jié)果

將雙酶切后的pGPH1/GFP/Neo載體與目的條帶在22℃水浴中連接24h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，倒置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16h后，挑菌擴(kuò)繁提取質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序比對(duì)結(jié)果如圖6，發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致，說(shuō)明目的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.6ADSL基因轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞結(jié)果

待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，使用Lipo-fectamineIM3000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，另設(shè)陰性對(duì)照（sh-NC），上述每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。結(jié)果如圖7所示，在倒置顯微鏡下，干擾組（sh1-ADSL、sh2-ADSL、sh3-ADSL和sh4-ADSL）及陰性對(duì)照（sh-ADSL）均可見(jiàn)綠色熒光，空白對(duì)照不發(fā)光，說(shuō)明各重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染赤水烏骨雞成肌細(xì)胞。

2.7ADSL基因沉默效果分析結(jié)果

將4個(gè)沉默表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞后，以sh-NC為陰性對(duì)照，提取細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量驗(yàn)證干擾效率。如圖8所示，發(fā)現(xiàn)4個(gè)沉默表達(dá)質(zhì)粒均能極顯著降低ADSL基因在赤水烏骨雞成肌細(xì)胞中的表達(dá)，其中sh2-ADSL轉(zhuǎn)染后ADSL基因的沉默效果最佳，干擾效率為90.30%，因此選擇sh2-ADSL作為目的沉默表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)研究。表明ADSL基因的沉默干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功，可用于后續(xù)研究。

3討論

ADSL基因作為調(diào)控家禽IMP的重要候選基因，在雞的肌肉組織中高表達(dá)（欒德琴，2012），對(duì)家禽肉質(zhì)品質(zhì)的改良有著重要參考價(jià)值（豆騰飛等，2017）。IMP作為影響畜禽肌肉風(fēng)味性狀的重要指標(biāo)，其含量與ADSL基因存在正相關(guān)關(guān)系（張梅，2018;Mao et al.，2018;曹少奇等，2019）。地方雞種IMP含量普遍比快大型肉雞含量高，王玨等（2020）對(duì)3個(gè)地方雞種和快大型肉雞的肌苷酸含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)3種地方雞更具風(fēng)味優(yōu)勢(shì)。如皋雞（龔琳琳，2011）和中國(guó)環(huán)頸雉（吳瓊等，2012）的胸肌是ADSL基因的優(yōu)勢(shì)表達(dá)組織。本研究發(fā)現(xiàn)，赤水烏骨雞胸肌組織中ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量隨月齡增加呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，其中3、4和5月齡胸肌中ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量隨月齡增加呈極顯著上升趨勢(shì)，5月齡最高。6月齡赤水烏骨雞胸肌組織ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著低于5月齡。本研究結(jié)果與豆騰飛等（2017）的研究結(jié)果相反，豆騰飛等（2017）以90～150日齡武定雞和大圍山微型雞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)胸肌組織中ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量隨日齡增加呈下降趨勢(shì)。推測(cè)差異原因與試驗(yàn)材料的品種及生長(zhǎng)時(shí)期不同有關(guān)（黃正洋等，2022）。本研究中，赤水烏骨雞ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量從3月齡至5月齡持續(xù)升高，可能與赤水烏骨雞表現(xiàn)出的市場(chǎng)規(guī)律有關(guān)。劉基偉等（2010）研究發(fā)現(xiàn)通城豬背腰最長(zhǎng)肌ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量從剛出生至65日齡持續(xù)升高；龔琳琳（2011）的研究結(jié)果表明，如皋雞胸肌組織中ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量自出生到2周齡持續(xù)上升，隨后逐漸下降；路宏朝等（2016）通過(guò)檢測(cè)黃羽雞和略陽(yáng)烏雞肌肉中ADSL基因在不同時(shí)間（8日胚齡和6、180日齡）的相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，隨養(yǎng)殖時(shí)間的增加，ADSL基因相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，且2個(gè)雞種的ADSL基因相對(duì)表達(dá)量均于6日齡達(dá)峰值；曹少奇等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，不同周齡巨型玫瑰冠雞與良鳳花雞胸肌的ADSL基因相對(duì)表達(dá)量均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，且最終保持在較高水平。本研究結(jié)果與曹少奇等（2019）的研究結(jié)果相似，ADSL基因在不同日齡的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，推測(cè)與肌肉IMP合成變化有關(guān)，IMP合成隨時(shí)間增加逐漸減少，但由于體內(nèi)IMP不斷積累，使其保持在較高的水平（豆騰飛等，2017）。

本研究表明，赤水烏骨雞母雞胸肌組織中ADSL基因（除6月齡外）的相對(duì)表達(dá)量高于公雞，6月齡母雞ADSL基因相對(duì)表達(dá)量低于公雞。此外，3～5月齡ADSL基因相對(duì)表達(dá)量在公雞和母雞間的差異逐漸減小。該結(jié)果與如皋雞的檢測(cè)結(jié)果不一致，如皋公雞自出生后ADSL基因相對(duì)表達(dá)量明顯高于母雞（龔琳琳，2011）。赤水烏骨雞胸肌組織中ADSL基因相對(duì)表達(dá)量在母雞和公雞均呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，該結(jié)果與龔琳琳（2011）發(fā)現(xiàn)的如皋公雞和隱形白羽雞ADSL基因相對(duì)表達(dá)量均隨日齡增加而增高，至峰值后下降的結(jié)果一致。潘愛(ài)鑾等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，地方品種洪山雞、江漢雞和白羽肉雞的肌苷酸均表現(xiàn)為母雞肌苷酸含量高于公雞。連城白鴨、金陵白鴨及櫻桃谷鴨中均整體上表現(xiàn)出母鴨ADSL基因相對(duì)表達(dá)量極顯著高于公鴨（徐善金，2011）。12周齡巢湖鴨不同性別胸肌中IMP含量差異極顯著（夏婷婷，2014）。本研究結(jié)果（除6月齡外）與上述結(jié)論一致，推測(cè)這種差異是由于性別不同導(dǎo)致的性激素和代謝情況改變?cè)斐桑ń痤５龋?021）。

ADSL基因在家禽胸肌組織中具有高表達(dá)量的特點(diǎn)。成肌細(xì)胞作為研究肌肉的理想載體，研究其體外分化過(guò)程有助于了解骨骼肌的生長(zhǎng)和發(fā)育（王紅娜等，2016）。骨骼肌發(fā)育過(guò)程主要包括成肌細(xì)胞的增殖分化和發(fā)育中特異基因的激活，在胚胎形成過(guò)程中，成肌細(xì)胞就已大量存在，在發(fā)育過(guò)程中不斷增殖生長(zhǎng)，最后分化成肌纖維（王紅楊，2015）。沉默表達(dá)則是由dsRNA誘導(dǎo)的同源性mRNA特異性降解的現(xiàn)象（Imaeda et al.，2019）。很多關(guān)于細(xì)胞及蛋白的研究都會(huì)通過(guò)構(gòu)建目的基因的RNA干擾載體來(lái)探究目的基因在不同細(xì)胞或不同物種中的功能。本研究在成功提取赤水烏骨雞成肌細(xì)胞的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了ADSL基因RNA干擾載體，通過(guò)檢測(cè)ADSL基因相對(duì)表達(dá)量篩選出最佳干擾載體。至今，關(guān)于ADSL基因的研究多集中于ADSL基因與IMP的相關(guān)性及ADSL基因的多態(tài)性方面，本研究構(gòu)建的ADSL基因干擾載體可用于研究成肌細(xì)胞分化和肌纖維轉(zhuǎn)化，進(jìn)而為深入探究ADSL基因在細(xì)胞和蛋白水平影響肌肉風(fēng)味的機(jī)制提供參考。

4結(jié)論

赤水烏骨雞胸肌中ADSL基因相對(duì)表達(dá)量隨著月齡增加表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢(shì)；3、4和5月齡赤水烏骨母雞ADSL基因的相對(duì)表達(dá)量高于公雞，隨著月齡的增加ADSL基因相對(duì)表達(dá)量增加，公雞與母雞間的差異減少；推測(cè)5月齡的赤水烏骨雞的風(fēng)味最好，建議5月齡上市。成功分離提取赤水烏骨雞成肌細(xì)胞，構(gòu)建ADSL基因干擾細(xì)胞系，并篩選出RNA干擾效果最佳載體sh2-ADSL，為后續(xù)研究ADSL基因調(diào)控雞肉肌苷酸及風(fēng)味的分子機(jī)制提供參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 李洪艷）