干擾和過表達(dá)CHRNG對牛成肌細(xì)胞增殖分化的影響

摘 要： 旨在研究CHRNG基因?qū)ε３杉〖?xì)胞增殖分化的影響及其潛在的分子作用途徑。本研究從健康3日齡秦川牛背最長肌和后腿肌中分離到成肌細(xì)胞，利用腺病毒在秦川牛成肌細(xì)胞中過表達(dá)及干擾CHRNG基因，分為干擾組（sh-CHRNG）、干擾對照組（sh-NC）、過表達(dá)組（OE-CHRNG）、過表達(dá)對照組（OE-NC），每組3個重復(fù)，采用CCK-8、EdU、qRT-PCR、Western blot、免疫熒光染色等方法分別檢測了干擾及過表達(dá)CHRNG基因?qū)ε３杉〖?xì)胞增殖分化的作用；通過RNA-Seq進(jìn)一步篩選差異基因，富集信號通路。結(jié)果表明，過表達(dá)及干擾CHRNG均顯著下調(diào)了細(xì)胞周期因子 PCNA、CCNB1、CCND2 的表達(dá)（Plt;0.01），顯著上調(diào)了CDKN1A的表達(dá)（Plt;0.01），減少了發(fā)生增殖的細(xì)胞數(shù)量（CCK-8，Plt;0.01）且減少了處于S復(fù)制期的陽性細(xì)胞比例（EdU）。在牛成肌細(xì)胞上過表達(dá)和干擾CHRNG并誘導(dǎo)分化后D2、4、6進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和免疫熒光染色，結(jié)果表明干擾和過表達(dá)CHRNG抑制牛成肌細(xì)胞的分化和肌管形成。qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明，過表達(dá)及干擾CHRNG下調(diào)了MYOD1、MYOG、MYH3基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)（Plt;0.01）。通過RNA-Seq測序分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CHRNG篩選到的差異基因主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、IL-17、甲狀腺激素合成、PPAR、PI3K-Akt等信號通路，KEGG分析富集的前20條通路中有10條通路與細(xì)胞分化相關(guān)；干擾CHRNG篩選到的差異基因主要富集在軸突導(dǎo)向、MAPK、PI3K-Akt等信號通路，KEGG分析富集的前20條通路中有8條通路與細(xì)胞分化相關(guān)。本研究結(jié)果表明，過表達(dá)和干擾CHRNG基因均能抑制牛成肌細(xì)胞的增殖和分化，且過表達(dá)和干擾CHRNG引起的差異基因所富集的通路大多與細(xì)胞分化相關(guān)。

關(guān)鍵詞： CHRNG基因；增殖和分化；成肌細(xì)胞；RNA-Seq

中圖分類號： S823.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：0366-6964（2024）10-4360-17

收稿日期：2024-03-13

基金項目：陜西省科技計劃項目-重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（2022GD-TSLD-46-0104）；楊凌示范區(qū)青年育種專家培育支持計劃；2023年陜西省畜禽種業(yè)發(fā)展項目

作者簡介：毛曉宇（1999-），女，陜西西安人，碩士，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail：maoxiaoyu@163.com

*通信作者：王洪寶，主要從事肉牛肌肉生長和脂肪沉積的分子調(diào)控機(jī)制及中國地方黃牛品種遺傳改良與新品種（系）培育的研究，E-mail：wanghongbao@nwsuaf.edu.cn

Effects of CHRNG Gene on Proliferation and Differentiation of Bovine Myoblasts

and Its Mechanism

MAO" Xiaoyu1， DU" Jiawei1， TANG" Jiayu1， PAN" Jinhai1， JIANG" Lei1， SUN" Xiaolei1， ZAN" Linsen

1，2， WANG" Hongbao1，2*

（1.College of Animal Science and Technology， Northwest Aamp;F University， Yangling 712100，" China;

2.National Beef Cattle Improvement Center， Northwest Aamp;F University， Yangling" 712100， China）

Abstract：" This study aimed to investigate the effect of CHRNG gene on the proliferation and differentiation of bovine myoblasts and its potential molecular pathways. In this study， adenovirus was used to overexpress and interfere with CHRNG gene in Qinchuan cattle myoblasts. This study isolated myoblasts from the longissimus dorsi and hind leg muscles of healthy 3-day-old Qinchuan cattle. Adenovirus overexpression and interference with CHRNG gene were used in Qinchuan cattle myoblasts， which were divided into interference group （sh-CHRNG）， interference control group （sh-NC）， overexpression group （OE-CHRNG）， and overexpression control group （OE-NC）， with 3 replicates in each group. CCK-8， EdU， qRT-PCR， Western blot， immunofluorescence staining and other methods were used to detect the effects of interference and overexpression of CHRNG gene on the proliferation and differentiation of bovine myoblasts; Further screening of differential genes and enrichment of signaling pathways were performed through RNA-Seq. The results showed that overexpression and interference with CHRNG significantly downregulated the expression of cell cycle factors PCNA， CCNB1， and CCND2 （Plt;0.01）， significantly upregulated the expression of CDKN1A （Plt;0.01）， reduced the number of proliferating cells （CCK-8， Plt;0.01）， and reduced the proportion of positive cells in the S replication phase （EdU）. Overexpression and interference of CHRNG on bovine myoblasts and induction of differentiation were observed by morphological observation and immunofluorescence staining on D2， D4， and D6. The results showed that interference and overexpression of CHRNG inhibited the differentiation of bovine myoblasts and myotube formation. The qRT-PCR and Western blot results showed that overexpression and interference with CHRNG downregulated the mRNA and protein levels of MYOD1， MYOG and MYH3 genes （Plt;0.01）. Through RNA-Seq sequencing analysis， it was found that the differentially expressed genes screened by overexpressing CHRNG were mainly enriched in endoplasmic reticulum protein processing， IL-17， thyroid hormone synthesis， PPAR， PI3K-Akt and other signaling pathways. Among the top 20 enriched pathways analyzed by KEGG， 10 pathways were related to cell differentiation; The differentially expressed genes screened by CHRNG were mainly enriched in signaling pathways such as axon guidance， MAPK， and PI3K-Akt. Among the top 20 enriched pathways analyzed by KEGG， 8 pathways were related to cell differentiation. The results suggested that overexpression and interference with CHRNG gene can inhibit the proliferation and differentiation of bovine myoblasts， and the pathways enriched by differential genes caused by overexpression and interference with CHRNG are mostly related to cell differentiation.

Key words： CHRNG gene; proliferation and differentiation; myoblast; RNA-Seq

*Corresponding author： WANG Hongbao， E-mail：wanghongbao@nwsuaf.edu.cn

骨骼肌是人類和動物體內(nèi)最豐富的組織之一（占成年動物體重的40%～60%）［1］，參與機(jī)體的運(yùn)動和能量代謝。骨骼肌與畜禽的生產(chǎn)性狀息息相關(guān)［2］，其數(shù)量和質(zhì)量直接影響到肉制品的品質(zhì)［3］，在骨骼肌生長發(fā)育過程中導(dǎo)致的肌肉產(chǎn)量和肉質(zhì)的差異能夠直接決定動物的經(jīng)濟(jì)價值［4］。因此，研究肌肉分化再生的調(diào)控機(jī)制對畜牧業(yè)發(fā)展具有重要意義。骨骼肌發(fā)育是受遺傳調(diào)控和環(huán)境因素影響的多階段過程［5-7］，這一過程包括核前體細(xì)胞的肌源性定向分化及成肌細(xì)胞的增殖、分化和融合。成肌細(xì)胞分化是一個復(fù)雜而高度協(xié)調(diào)的過程，涉及退出細(xì)胞周期［8］、細(xì)胞形態(tài)變化［9］、細(xì)胞融合［10］及許多其他生物學(xué)變化。開始分化進(jìn)程后，增殖的成肌細(xì)胞暫停細(xì)胞周期，發(fā)生相互遷移和粘附，之后融合形成多核肌管［11-13］。肌生成依賴于許多細(xì)胞內(nèi)通路，如生長因子與激素信號通路、Wnt信號通路、MAPK信號通路，細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞外通訊，如粘附和內(nèi)吞作用［14］。因此，探究成肌細(xì)胞分化的分子機(jī)制能夠為提高畜禽肉產(chǎn)品質(zhì)量提供有價值的信息。

CHRNG（cholinergic receptor nicotinic gamma subunit）基因編碼的蛋白是肌肉型乙酰膽堿受體（nAChR）的一個γ亞基，在神經(jīng)肌肉器官發(fā)生及配體結(jié)合中發(fā)揮重要作用［15-16］，破壞γ亞基的表達(dá)會阻礙乙酰膽堿受體在細(xì)胞膜中的正確定位［17］。有研究稱nAChR在調(diào)節(jié)系統(tǒng)血壓方面發(fā)揮著重要作用［18］；CHRNG基因的突變可導(dǎo)致埃斯科巴爾綜合征和多發(fā)性翼狀胬肉綜合征（Escobar syndrome and multiple pterygium syndrome）［17，19-20］；一些報道還證明，CHRNG可能在細(xì)胞分化、生長等的生物過程中發(fā)揮重要作用［21］。目前尚未有文獻(xiàn)報道關(guān)于CHRNG基因在成肌細(xì)胞中的功能。本實驗室前期成肌細(xì)胞-前脂肪細(xì)胞的共培養(yǎng)相關(guān)研究中（結(jié)果尚未發(fā)表），通過轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)合生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)下肌細(xì)胞可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞中CHRNG基因的表達(dá)，提示基因可能參與調(diào)控牛成肌細(xì)胞分化。因此本研究通過CCK-8、EdU、qRT-PCR、Western blot、免疫熒光染色等試驗技術(shù)，探究CHRNG對牛成肌細(xì)胞增殖和分化的影響，為揭示CHRNG在牛肌肉發(fā)育過程中的分子機(jī)理提供重要的理論支持，為肉牛肌肉組織生長發(fā)育的分子機(jī)制提供依據(jù)，進(jìn)而為肉牛分子育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品準(zhǔn)備

本試驗中使用的牛原代成肌細(xì)胞均采自西北農(nóng)林科技大學(xué)國家肉牛改良中心良繁場飼養(yǎng)的健康3日齡秦川牛后腿肌和背最長肌，具體分離步驟參照實驗室前期建立的方法［22］。

1.1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清 （FBS， Gibco）; TransDetect? Cell Counting Kit （北京全式金生物技術(shù)有限公司）; DMEM/F-12、 PBS （Gibco）; Cell-LightTM EdU Apollo567 In Vitro Kit （廣州銳博）; PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time） kit、TB Green Premix ExTaqTMII （Tli RNaseH Plus） kit （TaKaRa）; LipofectamineTM3000試劑盒、 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisher）; mRNA-Seq sample preparation kit （Illumina）; 實時熒光定量PCR儀 （Biorad）; 倒置熒光顯微鏡 （Olympus）; 活細(xì)胞工作站 （Biotek）; 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) （Biorad）; 多功能酶標(biāo)儀 （TECAN）。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

牛原代成肌細(xì)胞復(fù)蘇于6孔板中，用生長培養(yǎng)基（含20% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12）進(jìn)行培養(yǎng)（37℃和5% CO2的生長環(huán)境），每隔2 d更換1次生長培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 95%～100%時，通過將生長培養(yǎng)基換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（含2%馬血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12）來啟動肌源性分化，培養(yǎng)基每2 d更換1次。

1.2.2 腺病毒包裝及侵染

CHRNG過表達(dá)腺病毒 （OE-CHRNG）及其空載對照 （OE-NC），干擾腺病毒（sh-CHRNG）及其空載對照（sh-NC）由上海和元生物科技有限公司包裝完成。腺病毒侵染試驗具體參照先前文獻(xiàn)［23］。

1.2.3 EdU染色

將牛成肌細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)至匯合度達(dá)到40%～50%時進(jìn)行腺病毒侵染，每組生物學(xué)重復(fù)3次。細(xì)胞侵染48 h后，使用EdU染色試劑盒 （Cell-LightTM EdU Apollo567 In Vitro Kit） 進(jìn)行染色。根據(jù)制造商的說明，將細(xì)胞在EdU溶液中培養(yǎng)2 h，用PBS洗滌細(xì)胞2次，室溫下在細(xì)胞固定液（含有4%多聚甲醛的PBS）中孵育30 min，然后用PBS沖洗2次，之后用100 μL 0.5% Triton X-100滲透液孵育10 min；每個孔加入100 μL染色反應(yīng)溶液并在搖床上室溫孵育培養(yǎng)30 min；用PBS清洗3次，之后將100μL 1×Hoechst 33342反應(yīng)溶液添加到每個孔中在室溫下孵育30 min，最后用PBS清洗3次，將細(xì)胞放置在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 CCK-8細(xì)胞增殖檢測

將牛成肌細(xì)胞接種于96孔板，分別用OE-NC、OE-CHRNG、sh-NC、sh-CHRNG處理（每組樣本重復(fù)數(shù)n=9）48 h后按照CCK-8說明書（TransDetect? Cell Counting Kit，全式金生物）將10% CCK-8溶液加入每個孔中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，使用酶標(biāo)儀 （Infinite M200PRO， TECAN） 測定450 nm處的吸光度。

1.2.5 免疫熒光染色

在腺病毒侵染后細(xì)胞分化D4時，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，然后用4%多聚甲醛固定30 min，之后每孔細(xì)胞加入含有0.5% Triton X-100的PBS滲透 10 min，然后用1% BSA/10%驢血清/0.3 mol·L-1甘氨酸溶液封閉1 h；將MYH3抗體（1∶200；PA5-103935；Thermo Fisher）在封閉溶液中稀釋后加入細(xì)胞，在4℃下過夜孵育；用PBS洗滌2次后，用在封閉液中稀釋后的驢抗小鼠IgG二抗（1∶500；ab150106；Abcam）室溫下孵育細(xì)胞2 h，除去二抗后用PBS洗滌細(xì)胞3次，最后加入DAPI染色劑（Sigma）（6孔板中每孔1 μL），在室溫下孵育10 min，將細(xì)胞放置在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 RNA反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR

使用RNAiso Plus（TaKaRa）提取細(xì)胞總RNA，按照制造商的說明進(jìn)行提取。按照 TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Primix ExTaqTM Ⅱ試劑盒（TaKaRa）說明書進(jìn)行 RNA 反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量 PCR。PCR體系總計15 μL：TB GreenⅡ7.5 μL，cDNA 1.2 μL，上游和下游引物各0.3 μL以及DEPC水5.7 μL。PCR反應(yīng)在Bio-Rad熒光定量PCR儀（CFX Connect）進(jìn)行。根據(jù)Gen-Bank中牛的基因序列，使用Primer premier 5軟件設(shè)計qRT-PCR上、下游引物，所有引物的序列如表1所示，引物均由陜西西安擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.7 Western blot

用于增殖和分化檢測的牛成肌細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次后，使用蛋白質(zhì)提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）根據(jù)制造商說明從細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)。將20 μg蛋白質(zhì)樣品上樣于12% SDS PAGE凝膠上電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，PVDF膜用5%脫脂牛奶密封2 h，之后將膜與Anti-GAPDH、MYOD1、MYOG等一抗4℃孵育過夜，回收抗體后將膜用TBST漂洗3次，然后在室溫避光環(huán)境中孵育二抗2 h，之后用TBST溶液漂洗膜3次，最后使用發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影。

1.2.8 cDNA文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序

在成肌細(xì)胞中過表達(dá)和干擾CHRNG基因后，收集分化D2的細(xì)胞，使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，分為過表達(dá)組和過表達(dá)對照組、干擾組和干擾對照組4組，每組3個生物學(xué)重復(fù)，根據(jù)制造商說明使用RNA 6000 Nano Kit （Agilent）和RINgt;7.0的安捷倫2100生物分析儀分析總RNA質(zhì)量和純度。之后根據(jù)制造商說明，使用mRNA-Seq sample preparation kit（Illumina）構(gòu)建cDNA文庫。在Illumina測序平臺上進(jìn)行雙端測序，使用Illumina雙末端RNA-Seq方法對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，共產(chǎn)生數(shù)百萬個堿基的雙末端讀數(shù)，產(chǎn)生了千兆堿基（Gb）的序列。組裝前，去除低質(zhì)量讀數(shù)（1.含有測序銜接子的讀數(shù)；2.含有測序引物的讀數(shù)；3.q質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于20的核苷酸）。之后使用StringTie軟件組裝每個樣本中的映射讀數(shù)，合并樣本中的所有轉(zhuǎn)錄組，使用Perl腳本建立一個全面的轉(zhuǎn)錄組。生成最終轉(zhuǎn)錄組后，使用StringTie和Ballgroove軟件來估計轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。用StringTie軟件通過計算FPKM值來確定mRNA的表達(dá)水平，按照log2 （Fold change）gt;1或log2 （Fold change）lt;-1和統(tǒng)計學(xué)顯著性（Plt;0.05）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)基因（DEGs）篩選。在獲得差異表達(dá)基因后，對過表達(dá)組和干擾組中的DEGs進(jìn)行GO和KEGG分析。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究中，所有數(shù)據(jù)分析均使用2-ΔΔCt的方法，GAPDH作為內(nèi)參基因使所有基因表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化。使用Excel表格分析處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用“Means±SD”表示，單獨(dú)兩樣本之間利用t檢驗法檢測差異顯著性；*.Plt;0.05為差異顯著，**.Plt;0.01為差異極顯著；樣本重復(fù)數(shù)n=3，最后利用GraphPad prism 9.0軟件繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 CHRNG基因在成肌細(xì)胞中不同分化時期的表達(dá)分析

本研究提取了秦川牛原代成肌細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化D0、D2、D4、D6、D8的細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過qRT-PCR檢測CHRNG基因在成肌細(xì)胞分化過程中的時序表達(dá)譜。CHRNG基因的mRNA表達(dá)水平在成肌細(xì)胞分化D0到 D8總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，誘導(dǎo)分化開始后CHRNG基因的表達(dá)量逐漸升高，并在D4時表達(dá)量達(dá)到峰值；分化D4之后CHRNG基因的表達(dá)量開始下降（圖1）。

2.2 腺病毒最佳MOI值的測定

當(dāng)成肌細(xì)胞生長至匯合程度達(dá)80%時，將OE-NC、OE-CHRNG、sh-NC、sh-CHRNG以不同感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）侵染細(xì)胞。感染48 h后，觀察侵染效率和細(xì)胞狀態(tài)（圖2A）。經(jīng)篩選，OE-CHRNG腺病毒最佳MOI=60，sh-CHRNG腺病毒最佳MOI=80。qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明，OE-CHRNG腺病毒能顯著上調(diào)細(xì)胞中CHRNG基因的表達(dá)，sh-CHRNG腺病毒能顯著下調(diào)細(xì)胞中CHRNG基因的表達(dá)。與對照組相比，過表達(dá)組CHRNG基因mRNA水平上調(diào)了約160倍（圖2B，Plt;0.01），干擾組CHRNG基因mRNA水平約為對照組的15%（圖2C，Plt;0.01）。

2.3 過表達(dá)CHRNG基因抑制成肌細(xì)胞增殖

首先，用熒光顯微鏡在不同時間觀察成肌細(xì)胞的形態(tài)（圖3A）。48 h后，對照組的細(xì)胞數(shù)量明顯多于過表達(dá)組，表明過表達(dá)CHRNG的成肌細(xì)胞增殖速度減慢。EdU染色結(jié)果顯示，CHRNG過表達(dá)后減少了EdU陽性細(xì)胞數(shù)量，表明DNA復(fù)制受到抑制（圖3B）；CCK-8結(jié)果（圖3C）顯示，對照組的生長能力極顯著高于過表達(dá)組（Plt;0.01），這與EdU分析的結(jié)果一致。通過qRT-PCR和Western blot檢測細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)組中細(xì)胞周期蛋白（PCNA）、細(xì)胞周期蛋白B1（CCNB1）和細(xì)胞周期蛋白D2（CCND2）mRNA和蛋白表達(dá)水平極顯著降低（Plt;0.01），細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑1A（CDKN1A）mRNA和蛋白表達(dá)水平極顯著增加（Plt;0.01）（圖3D-E）。以上結(jié)果表明過表達(dá)CHRNG基因可以抑制成肌細(xì)胞增殖。

2.4 干擾CHRNG基因抑制成肌細(xì)胞增殖

使用sh-CHRNG腺病毒侵染牛成肌細(xì)胞后，通過熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)，在24、48 h時，細(xì)胞數(shù)量明顯少于對照組（圖4A）。EdU染色結(jié)果顯示（圖4B），EdU陽性細(xì)胞的數(shù)量少于對照組。CCK-8結(jié)果表明，對照組細(xì)胞的生長能力顯著高于干擾組（Plt;0.01）（圖4C）。通過檢測細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在干擾CHRNG后，PCNA、CCNB1和CCND2的表達(dá)水平顯著降低（Plt;0.01），CDKN1A顯著增加（Plt;0.01）（圖4D）。Western blot分析和定量結(jié)果顯示PCNA、CCNB1和CCND2的蛋白水平降低（Plt;0.01）（圖4E）。綜上所述，所有結(jié)果表明干擾CHRNG基因抑制了成肌細(xì)胞的增殖。

2.5 過表達(dá)CHRNG基因抑制成肌細(xì)胞分化

為了探究CHRNG基因?qū)Τ杉〖?xì)胞分化的影響，使用OE-CHRNG腺病毒侵染牛成肌細(xì)胞。在分化D2、4、6用熒光顯微鏡觀察成肌細(xì)胞分化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)成肌細(xì)胞的分化受到抑制（圖5A）。分化D4 MYH3免疫熒光染色結(jié)果顯示過表達(dá)組的肌管融合程度低，肌管數(shù)量較少（圖5B）。qRT-PCR 和 Western blot分析表明，分化的D4和D6，過表達(dá)組MYOD1、MYOG和MYH3的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（Plt;0.01）（圖5C-E）?；谏鲜鼋Y(jié)果得出過表達(dá)CHRNG基因抑制成肌細(xì)胞分化。

2.6 干擾CHRNG基因抑制成肌細(xì)胞分化

用sh-CHRNG腺病毒感染成肌細(xì)胞并誘導(dǎo)分化，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)干擾組細(xì)胞的分化受到抑制（圖6A），分化D4 MYH3免疫熒光染色結(jié)果顯示干擾組的肌管較少，長度較短（圖6B）。通過qRT-PCR檢測成肌分化相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)干擾組中MYH3和MYOG的表達(dá)在分化的D2、D4、D6顯著降低（圖6C），MYOD1的表達(dá)在分化的D2 和D4 顯著降低。Western blot分析和定量結(jié)果顯示，干擾組中MYOD1、MYOG和MYH3的蛋白表達(dá)量在D4和D6顯著降低（圖6D-E）。上述結(jié)果表明，干擾CHRNG抑制成肌細(xì)胞分化。

2.7 轉(zhuǎn)錄組測序分析CHRNG影響成肌細(xì)胞分化的潛在信號通路

為了進(jìn)一步探究干擾和過表達(dá)CHRNG抑制牛成肌細(xì)胞分化的分子調(diào)控機(jī)制，對分化D2的成肌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

2.7.1 RNA-Seq結(jié)果可靠性驗證

熱圖結(jié)果顯示，sh-CHRNG、sh-NC、OE-CHRNG、OE-NC能明顯分為4組，表明測序結(jié)果良好（圖7A）。與對照組相比，CHRNG過表達(dá)組有105個基因表達(dá)顯著上調(diào)，85個基因表達(dá)顯著下調(diào)；CHRNG干擾組有133個基因表達(dá)顯著上調(diào)，286個基因表達(dá)顯著下調(diào)（圖7B、7C，圖8A：log2 （Fold Change）gt;1或log2 （Fold Change）lt;-1）。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)組和干擾組存在56個相同的差異表達(dá)基因（differential expression genes，DEGs）（圖8B），其中有18個基因在過表達(dá)組和干擾組均上調(diào)，25個基因在過表達(dá)組和干擾組均下調(diào)（表2和表3）。從過表達(dá)組和干擾組隨機(jī)選擇部分DEGs，使用qRT-PCR檢測其表達(dá)水平（圖9），結(jié)果顯示RNA-Seq測序結(jié)果可靠。

2.7.2 共同DEGs的GO和KEGG分析結(jié)果

通過對過表達(dá)和干擾組共同的差異基因進(jìn)行基因功能（Gene Ontology， GO）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析，細(xì)胞外空間和細(xì)胞因子活性信號通路具有最高的顯著性，這兩個信號通路包含的DEGs最多（圖10A）。KEGG分析顯示（圖10B），有12條信號通路與細(xì)胞分化相關(guān)，其中6條信號通路在過表達(dá)組和干擾組單獨(dú)的KEGG分析結(jié)果中沒有出現(xiàn)，如趨化因子信號通路和NOD樣受體信號通路。蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）結(jié)果顯示，CXCL8是蛋白質(zhì)相互作用的核心蛋白質(zhì)（圖10C），CXCL8參與12條信號通路。

2.7.3 過表達(dá)組中DEGs的GO和KEGG分析結(jié)果

對過表達(dá)組的DEGs進(jìn)行GO和KEGG分析。前20個通路包括了與細(xì)胞因子相關(guān)的細(xì)胞外空間和細(xì)胞外區(qū)域這兩條通路。前20條KEGG通路中（圖11B），有10條信號通路，如PI3K-AKT信號通路和IL-17信號通路等與細(xì)胞分化有關(guān)，DEGs顯著富集在這些信號通路中。

2.7.4 干擾組中DEGs的GO和KEGG分析結(jié)果

對干擾組的DEGs進(jìn)行GO和KEGG分析。前20個GO terms的結(jié)果（圖12A）顯示，DEGs更顯著的富集在細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外空間和細(xì)胞外基質(zhì)通路中。通過分析前20條KEGG通路（圖12B），發(fā)現(xiàn)其中8條信號通路，包括MAPK信號通路和PI3K-Akt信號通路與細(xì)胞分化有關(guān)，其中軸突導(dǎo)向、Rap1信號通路、Wnt信號通路和ECM受體相互作用這4條信號通路僅在干擾組中富集。

3 討 論

肌肉的發(fā)育離不開成肌細(xì)胞的增殖和分化，成肌細(xì)胞增殖和分化的過程極其復(fù)雜，除了受生肌調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)之外，還受到不同離子通道的調(diào)控［24］。CHRNG基因編碼肌肉型nAChR復(fù)合物的γ亞基，該基因作為構(gòu)成煙堿乙酰膽堿受體的亞基之一，參與nAChR復(fù)合物行使配體門控離子通道的重要功能。nAChR與乙酰膽堿結(jié)合后，構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致橫跨質(zhì)膜的離子傳導(dǎo)通道打開，細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子濃度發(fā)生變化。Ca2+作為第二信使之一，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中發(fā)揮著重要作用，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)主要依靠機(jī)體細(xì)胞中存在的多種鈣離子通道［25］。骨骼肌發(fā)育進(jìn)程中，成肌細(xì)胞的融合與分化嚴(yán)格依賴于鈣離子，并且鈣離子內(nèi)流是成肌細(xì)胞肌管形成的先決條件［26］。CHRNG基因在胎兒神經(jīng)肌肉信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及在建立肌肉和運(yùn)動神經(jīng)末梢的主要接觸中發(fā)揮重要作用［27］，有研究表明CHRNG基因可被選為肉質(zhì)嫩度相關(guān)的候選基因，與肉牛肌原纖維斷裂指數(shù)（MFI）相關(guān)［28］，但CHRNG對肌肉生長發(fā)育的具體功能仍未見有研究。

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的基本過程，在CDK及Cyclin的相互調(diào)控下進(jìn)行，通過G1/S 期與G2/M期兩個檢查點(diǎn)，S期在DNA解旋酶（MCM2-7）與DNA復(fù)制酶下進(jìn)行DNA復(fù)制。本研究發(fā)現(xiàn)，PCNA、CCNB1和CCND2的表達(dá)量在干擾和過表達(dá)CHRNG基因后顯著降低，CDKN1A的表達(dá)量則顯著增加。PCNA是DNA聚合酶δ的輔因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞DNA的合成，與細(xì)胞的增殖周期關(guān)系密切［29］；CCNB1是有絲分裂主要調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞分裂G2期并且可以與周期蛋白依賴激酶1（CDK1）結(jié)合形成復(fù)合物，從而促進(jìn)細(xì)胞從G2期向M期的轉(zhuǎn)變［30］；CCND2是一種D型細(xì)胞周期蛋白，通過與周期蛋白依賴激酶4（CDK4）、周期蛋白依賴激酶6（CDK6）的結(jié)合參與G1/S點(diǎn)的調(diào)控；CDKN1A編碼一種有效的周期蛋白依賴性激酶抑制劑，該蛋白與周期蛋白依賴激酶2（CDK2）或CDK4結(jié)合并抑制其活性，因此作為細(xì)胞G1期進(jìn)程的調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)展［31］。有研究發(fā)現(xiàn)，干擾和過表達(dá)LRRN1抑制牛成肌細(xì)胞增殖［32］；在探究ACTC1基因?qū)ε３杉〖?xì)胞和前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的作用時發(fā)現(xiàn)ACTC1的干擾和過表達(dá)均抑制成肌細(xì)胞的增殖［33］。產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是由于細(xì)胞中基因本底表達(dá)水平高，因此CHRNG過表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)紊亂；另一種原因可能是干擾和過表達(dá)CHRNG對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生反向調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞周期的正常運(yùn)行受到影響。Bax和Bcl-2是細(xì)胞凋亡通路的核心調(diào)控因子，據(jù)前人研究，Bcl-2介導(dǎo)抗凋亡信號，Bax介導(dǎo)促凋亡信號，抗凋亡和促凋亡相互制衡，共同維系細(xì)胞凋亡進(jìn)程的穩(wěn)態(tài)［34-35］。因此還需深入探究CHRNG基因在細(xì)胞凋亡中的功能，從而對本研究結(jié)果進(jìn)行深入解釋。

本研究通過過表達(dá)和干擾CHRNG基因發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)和干擾CHRNG基因抑制了成肌細(xì)胞分化和肌管形成。對于這一結(jié)果，我們推測可能由于干擾和過表達(dá)CHRNG同時促進(jìn)或抑制某些調(diào)控成肌分化的基因或者信號通路，也可能由于干擾和過表達(dá)CHRNG對某些成肌分化相關(guān)基因或信號通路分別造成影響，從而導(dǎo)致過表達(dá)和干擾CHRNG基因抑制成肌細(xì)胞的分化和肌管形成。接下來進(jìn)行了RNA-Seq分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)和干擾CHRNG都上調(diào)了HSPA1A、HSPA6、HSPA4L、MYBL1等基因的表達(dá)，下調(diào)了PIl6、TTR、ANGPTL2、COLEC12等基因的表達(dá)，HSPA1A、HSPA6、HSPA4L均屬于HSP70超家族，HSP70在釋放到細(xì)胞外環(huán)境中時，會觸發(fā)細(xì)胞因子TNF-α、IL-12和干擾素γ（IFN-γ）等的釋放［36］，這些促炎細(xì)胞因子反過來可以抑制C2C12細(xì)胞的肌源性分化［37］；通過誘導(dǎo)HSP70及其向細(xì)胞外環(huán)境釋放能通過直接抑制C2C12中的肌生成素抑制肌生成［36，38］。HSPA1A基因編碼熱休克蛋白HSP70-1，作為HSP70超家族的一員，HSP70-1主要作為防止錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集的分子伴侶來發(fā)揮作用，在維持細(xì)胞對炎癥、氧化應(yīng)激、低氧或高氧、低熱或高熱和感染等細(xì)胞應(yīng)激條件的反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用［39］；已有報道顯示，HSPA1A顯著抑制了C2C12肌細(xì)胞的增殖和肌管的分化［40］；HSPA1A基因的過表達(dá)通過Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路促進(jìn)骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化［41］；HSPA1A誘導(dǎo)小鼠肌肉萎縮［42］。因而成肌分化抑制可能由于干擾和過表達(dá)CHRNG同時上調(diào)的HSPA1A所導(dǎo)致。

KEGG分析得到過表達(dá)和干擾CHRNG共同調(diào)節(jié)的DEGs主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、IL-17、MAPK、TNF、PI3K/Akt等信號通路，這些經(jīng)典的信號通路在細(xì)胞當(dāng)中發(fā)揮重要作用，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路涉及多個信號傳導(dǎo)途徑，對細(xì)胞的生長、分化、生存和功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響；MAPK信號通路調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長、分化、對環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理/病理過程［43］；PI3K/Akt信號通路在胰島素的刺激以及細(xì)胞生存當(dāng)中發(fā)揮著重要作用［44］。

前人在探究MEF2A調(diào)控牛骨骼肌成肌細(xì)胞增殖和分化的機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，干擾和過表達(dá)MEF2A抑制了成肌細(xì)胞分化［45］，過表達(dá)MEF2A導(dǎo)致成肌細(xì)胞嚴(yán)重凋亡并產(chǎn)生大量細(xì)胞碎片，在本研究中未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡情況，過表達(dá)和干擾CHRNG對成肌細(xì)胞分化調(diào)控與細(xì)胞異常凋亡無關(guān)，仍需對RNA-Seq結(jié)果進(jìn)行深入驗證。盡管過表達(dá)和干擾是研究基因功能的有效手段，但由于細(xì)胞中復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，基因的過表達(dá)和干擾并不總是相反地調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理過程，這提醒我們在探究基因功能時，要進(jìn)行功能獲得和功能喪失的雙向研究。綜上所述，CHRNG基因?qū)∪獍l(fā)育十分重要，在牛成肌細(xì)胞內(nèi)CHRNG基因的表達(dá)量需要保持穩(wěn)態(tài)，否則將會抑制牛成肌細(xì)胞的增殖和分化。本研究為秦川牛肌肉生長發(fā)育的分子機(jī)制提供了重要信息，有助于提高牛肉品質(zhì)。

4 結(jié) 論

本研究通過腺病毒侵染技術(shù)實現(xiàn)在秦川牛成肌細(xì)胞中干擾和過表達(dá)CHRNG基因，并通過CCK-8、EdU、RT-qPCR、Western blot、免疫熒光染色等試驗發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)和干擾CHRNG基因均抑制牛成肌細(xì)胞的增殖和分化。

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（編輯 郭云雁）