靶向山羊痘病毒GPCR基因SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

摘 要： 基于山羊痘病毒（goat pox virus， GTPV）的基因組序列，建立靶向G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體（G-protein-coupled chemokine receptor，GPCR）基因的熒光定量PCR檢測(cè)方法?；贕TPV全基因序列設(shè)計(jì)6對(duì)qPCR引物，并進(jìn)行特異性和靈敏性的篩選和檢測(cè)，最終篩選得到1對(duì)高特異性和靈敏性的熒光定量PCR引物；根據(jù)GTPV/AV41疫苗株GPCR基因序列，設(shè)計(jì)普通PCR引物，擴(kuò)增GPCR基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體，建立熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：篩選得到1對(duì)靶向于GPCR基因的特異性qPCR引物；構(gòu)建pCAGGS-GPCR真核表達(dá)質(zhì)粒，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.5289x+49.07，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.997 2，擴(kuò)增效率為92.7%；驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該引物最低檢測(cè)限為2.0拷貝·μL-1，各批次內(nèi)與批次間重復(fù)性結(jié)果的變異系數(shù)均小于2%，表明其具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。建立了靶向山羊痘病毒GPCR基因的qPCR檢測(cè)方法，為防控山羊痘提供了高效的檢測(cè)手段。

關(guān)鍵詞： 山羊痘病毒；GPCR；熒光定量PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.654

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）10-4779-06

收稿日期：2023-12-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（32302850）；甘肅省科技計(jì)劃資助（22JR5RA035）；甘肅省科技重大專項(xiàng)（22ZD6NA001）；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（1610312021008）

作者簡(jiǎn)介：張紅強(qiáng)（1993-），男，甘肅漳縣人，碩士生，主要從事草食動(dòng)物病毒病感染致病機(jī)制研究，E-mail：2306590936@qq.com

*通信作者：樊江峰，主要從事家畜生殖生理、動(dòng)物胚胎工程研究，E-mail：fanjf@gsau.edu.cn；任善會(huì)，主要從事草食動(dòng)物病毒病致病機(jī)制相關(guān)研究，E-mail：renshanhui@caas.cn

The Establishment of a SYBR Green Fluorescence Quantitative PCR Detection Method by

Targeting the G-protein Coupled Chemokine Receptor Gene of Goat Poxvirus

ZHANG Hongqiang1， REN Shanhui2*， YAO Wei3， GONG Zhenli2， YANG Xue1， MA Chunling2，

YOU Ting1， ZHANG Yuzhe1， LIU Minyi1， QIAN Wenjie1， LI Liuyang1， YU Zhipeng1， SUN Yuefeng2， CHEN Haotai2， FAN Jiangfeng1*

（1. College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China;

2. Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology， Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Scicences， Lanzhou 730046， China;

3. Wanzhou Center for Animal Husbandry Industry Development， Chongqing 404100， China）

Abstract：" Based on the genomic sequence of the goat pox virus （GTPV）， we have established a fluorescence quantitative PCR method targeting the G-protein-coupled chemokine receptor （GPCR） gene. Six pairs of specific qPCR primers were designed based on the whole genomic sequence of GTPV. The specificity and sensitivity of these six qPCR primers were screened and detected. A pair of qPCR primers with high specificity and sensitivity was finally screened and obtained. According to the GPCR gene sequence of the GTPV AV41 vaccine strain， we designed an ordinary PCR primer pair to amplify the GPCR gene to construct the eukaryotic expression vector， which was used to establish the standard curve. Results showed that A pair of specific qPCR primers targeting the GPCR gene was obtained. The eukaryotic expression plasmid named pCAGGS-GPCR was constructed. The standard curve of y=-3.5289x+49.07 was established， whose linear correlation coefficient is R2=0.997 2 and amplification efficiency is 92.7%. The results of the replication experiment suggested that the lowest detective limitation of this primer was 2.0 copies·μL-1， and the coefficient variation of the reproducibility results within and between batches was 2%， indicating the advantages of reasonable specificity， repeatability， and sensitivity. We have successfully established a specific fluorescence quantitative PCR method targeting the GPCR gene of GTPV， which provides adequate detecting support for the veterinary clinical diagnosis and the prevention and control of goat poxvirus.

Key words： goat pox virus; GPCR; fluorescence quantitative PCR

*Corresponding authors：" FAN Jiangfeng， E-mail： fanjf@gsau.edu.cn;REN Shanhui， E-mail： renshanhui@caas.cn

羊痘（Capripox）是影響山羊和綿羊養(yǎng)殖的二類(lèi)動(dòng)物疫病，包括山羊痘（goat pox）和綿羊痘（sheep pox）［1］。山羊痘是由山羊痘病毒（goat pox virus， GTPV）傳播感染引起的一種高度致死性的惡性病毒性疫病［2］。

GTPV基因組與綿羊痘病毒（SPPV）和牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（lump skin disease virus， LSDV）的基因組序列相似性可達(dá)96%以上［3］，一般普通的分子生物學(xué)檢查很難區(qū)分，常規(guī)的檢測(cè)方法誤診率高，檢測(cè)速度慢、以及對(duì)樣本要求極高，尤其難以對(duì)隱性帶毒羊及早期發(fā)病動(dòng)物作出有效的診斷，易于造成疫病的流行［4］。王憲軍等［5］建立的羊口瘡病毒、小反芻獸疫病毒和羊痘病毒三重TaqMan 熒光定量RT-PCR方法，該方法對(duì)GTPV的最低檢測(cè)限為6.68拷貝·μL-1；岳帥等［6］建立了羊傳染性膿皰病毒及羊痘病毒雙重?zé)晒釶CR方法，對(duì)GTPV的最低檢測(cè)限為10拷貝·μL-1。為了能夠更加準(zhǔn)確、高效和快速的檢測(cè)出GTPV，本研究基于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的GTPV毒株全基因組序列，綜合qPCR引物設(shè)計(jì)的各項(xiàng)原則，最終篩選到一對(duì)靶向于GPCR基因熒光定量PCR引物（F：ACCAACACTACTTGTGCTATGA；R：GTATGGCATTAAGATTTGTCAACCT）。且GPCR基因測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育研究，證明可以用GPCR基因來(lái)區(qū)分LSDV、GTPV和SPPV。另外GPCR基因在山羊痘病毒中高度保守，可以檢測(cè)不同變異株［7］。

1 材料與方法

1.1 主要病毒和試劑

GTPV疫苗毒株（AV41毒株）、GTPV野毒株（GTPV-WT）、羊口瘡病毒（OrfV）、牛結(jié)節(jié)性皮膚病毒（LSDV）、改造的牛痘病病毒（MVA）和綿羊痘病毒（SPPV）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所草食動(dòng)物病毒病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)分離與保存。

TIANamp Virus DNA/RNA Kit病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自天跟生化科技有限公司（DP315）；Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix （No Rox） qPCR購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司（貨號(hào)：11201ES03）；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司（貨號(hào)：P505d1）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA（D2500-02）。

1.2 qPCR引物的設(shè)計(jì)與合成

基于GTPV/AV41毒株全基因序列（GenBank登錄號(hào)：MH381810），借助引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站（IDT）設(shè)計(jì)6對(duì)熒光定量PCR引物。與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中其它代表性GTPV毒株全基因序列比對(duì)分析，結(jié)合試驗(yàn)對(duì)引物的要求，既特異性和靈敏性等特點(diǎn)，選擇了最符合要求的2號(hào)qPCR引物對(duì)（#2）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)（表1）。并且設(shè)計(jì)了擴(kuò)增qPCR引物靶向基因（GPCR）的普通PCR引物7（表2）。構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒。

1.3 GPCR真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以GTPVAV41 cDNA為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：GTPV（AV41）cDNA 2 μL，上下游引物各2 μL，2×phanta Max Buffer 25 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA 1 μL，dNTP Mix 1 μL，ddH2O 17 μL，總反應(yīng)體積50 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，58℃退火15 s，72 ℃延伸1.5 min，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，將與預(yù)期大小符合的條帶，按照膠回收試劑盒（omega gel extration kit）操作步驟回收，產(chǎn)物置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用同源重組的方法將雙酶切空載體pCAGGS與插入片段連接，推薦插入片段與空載比例為3∶1，連接體系10 μL。各組分加入體積：5×CE Multis Buffer 2 μL，Exnase Multis 1 μL，目的片段3 μL，空載vector 1 μL，ddH2O 3 μL，PCR反應(yīng)條件為37 ℃ 持續(xù)1 h。轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，搖床培養(yǎng)1 h，離心濃縮菌液后涂布于含氨芐的瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后挑取單個(gè)菌落，接至液體培養(yǎng)基（含氨芐）置于37 ℃搖床培養(yǎng)12 h。提取質(zhì)粒并測(cè)量濃度。送測(cè)符合要求的質(zhì)粒，正確質(zhì)粒粒命名為pCAGGS-GTPV-GPCR。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒構(gòu)建完成。根據(jù)文獻(xiàn)中的公式［8］：質(zhì)?？截悢?shù)（拷貝·μL-1）=（質(zhì)粒濃度×10-9×稀釋倍數(shù)×6.02×1023）/（660道爾頓/堿基×堿基數(shù)）。將質(zhì)粒濃度轉(zhuǎn)化為拷貝數(shù)。

1.4 熒光定量PCR方法的建立及條件的優(yōu)化

多次試驗(yàn)確定體系中的模板和引物使用量：cDNA加入量分別為0.25、0.50、0.75、1.00 μL，引物使用量分別為0.2、0.4、0.6、0.8 μL。依次進(jìn)行優(yōu)化處理，確定最終qPCR體系：cDNA 0.5 μL，上下游引物各0.4 μL，SYBR GreenⅡ PCR mix 5 μL，ddH2O 3.7 μL，并設(shè)計(jì)退火溫度梯度（分別是56、58、60和62 ℃），qPCR最佳反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，40個(gè)循環(huán)，熔解曲線為95 ℃預(yù)變性15 s，58℃退火1 min。退火延伸后收集熒光信號(hào)。

1.5 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行連續(xù)的10倍梯度稀釋，選擇的拷貝數(shù)為2.0×101～2.0×1011。 拷貝數(shù)每微升之間的質(zhì)粒為模板，ddH2O為模板作為陰性對(duì)照，進(jìn)行qPCR，每個(gè)拷貝數(shù)重復(fù)3次。以3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)組Ct值平均值為縱坐標(biāo)，以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

1.6 熒光定量PCR引物特異性試驗(yàn)

利用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取綿羊痘（SPPV）、羊口瘡病毒（OrfV）、牛結(jié)節(jié)皮膚病病毒（LSDV）和改造痘苗病毒（MVA）基因組DNA。以2×1011拷貝·μL-1標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒、SPPV、OrfV、LSDV、MVA DNA為模板，進(jìn)行qPCR，驗(yàn)證該方法的特異性。對(duì)照組模板為ddH2O。

1.7 熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)

將構(gòu)建的pCAGGS-GTPV-GPCR標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行連續(xù)的10倍梯度稀釋，2.0×10-0～2.0×10-8拷貝·μL-1作為模板，進(jìn)行qPCR，每個(gè)濃度重復(fù)3次，ddH2O為陰性對(duì)照。檢測(cè)qPCR的敏感性。

1.8 熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)

將陽(yáng)性重組質(zhì)粒稀釋為2.0×108、2.0×107和2.0×106拷貝·μL-1。組內(nèi)檢測(cè)以2.0×108、2.0×107和2.0×106拷貝·μL-1作為模板，各濃度重復(fù)3次。以2.0×108、2.0×107和2.0×106拷貝·μL-1在不同組次稀釋的樣品進(jìn)行組間檢測(cè)，各濃度重復(fù)3次。計(jì)算變異系數(shù)（CV）評(píng)價(jià)方法重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.9 臨床樣品的檢測(cè)

隨機(jī)選取20份由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所草食動(dòng)物病毒病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室采集的疑似GTPV陽(yáng)性樣品，其中皮膚痘疹樣品10份、EDTA抗凝血清樣品6份和鼻咽拭子樣品4份，利用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取該30份臨床樣品基因組DNA并測(cè)量其濃度大小，利用已優(yōu)化建立的qPCR方法檢測(cè)，同時(shí)采用《綿羊痘和山羊痘熒光PCR檢測(cè)方法》（T/SAIA 005—2021）推薦通用GTPV熒光PCR檢測(cè)方法作為對(duì)照來(lái)評(píng)估建立的檢測(cè)方法。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

使用本研究中設(shè)計(jì)的普通PCR引物（GPCR-F/R）對(duì)GPCR基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，GPCR基因與雙酶切的pCAGGS空載體同源重組連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（2.0×1011拷貝·μL-1）。

2.2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及結(jié)果顯示，在濃度2.0×1010～2.0×102拷貝·μL-1標(biāo)準(zhǔn)品平均Ct值呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2 = 0.997 2，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.5289x+49.07，而且溶解曲線峰單一，溫度為77.5 ℃±1.5 ℃，證明引物具有良好的特異性，根據(jù)公式E=10-1/斜率-1計(jì)算，計(jì)算得出擴(kuò)增效率為92.7%（圖1）。

2.3 熒光定量PCR引物特異性試驗(yàn)

結(jié)果顯示，該方法對(duì)GTPV陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品有特異性的擴(kuò)增曲線，而對(duì)于羊口瘡病毒、綿羊痘病毒、牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒、小反芻獸疫病毒和改造后的牛痘病病毒基因組和陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增信號(hào)（圖2）。

2.4 熒光定量PCR引物敏感性試驗(yàn)

熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示（圖3），重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品均有典型的擴(kuò)增曲線，所有梯度均可檢測(cè)到熒光信號(hào)，并且最低有效檢測(cè)量為2.0×100 拷貝·μL-1，表明建立的方法敏感性高。

2.5 熒光定量PCR引物重復(fù)性試驗(yàn)

以2.0×108、2.0×107、2.0×106拷貝·μL-1及弱陽(yáng)性樣品（2.0×100拷貝·μL-1）在不同批次稀釋的樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果所示，批次內(nèi)與批次間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果的變異系數(shù)均小于2%。

2.6 臨床樣品檢測(cè)

建立的熒光定量PCR檢出率平均為80%。相比下，推薦通用方法檢出率平均為70%。兩種檢測(cè)方法結(jié)果不一致樣品有2份，經(jīng)測(cè)序鑒定為GTPV陽(yáng)性樣品，以上結(jié)果表明，本研究建立的檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、敏感性高，適用于GTP的臨床樣品鑒別檢測(cè)。

3 討 論

本研究所設(shè)計(jì)的qPCR引物靶向的GTPV GPCR基因?yàn)镚TPV基因組中非常保守的序列，該方法可以準(zhǔn)確的檢測(cè)出GTPV其他變異毒株的感染。結(jié)果表明，所建立的方法與這4種病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，且與GTPV親緣性較高的SPPV和LSDV三者之間無(wú)交叉反應(yīng)，能夠特異性地區(qū)分SPPV和LSDV。

常規(guī)檢測(cè)GTPV的方法如病毒中和試驗(yàn)，普通PCR，多重PCR等靈敏度低，耗費(fèi)大量時(shí)間，檢出率低，不能滿足臨床上診斷山羊痘病毒的要求［9-11］。該病在我國(guó)及周邊國(guó)家和地區(qū)流行［12］，其易感動(dòng)物的肉產(chǎn)品及動(dòng)物源性產(chǎn)品特別是乳產(chǎn)品出口會(huì)受到世界各貿(mào)易國(guó)的嚴(yán)格限制，對(duì)當(dāng)?shù)匦竽琉B(yǎng)殖業(yè)發(fā)展影響巨大［13］，嚴(yán)重制約全球以山羊?yàn)橹鞯男竽翗I(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展［14］。本研究建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該qPCR引物最低檢測(cè)限為2.0拷貝·μL-1。該引物能夠高效地?cái)U(kuò)增GTPV基因組，同時(shí)臨床樣品重復(fù)性試驗(yàn)中批次內(nèi)與批次間重復(fù)性結(jié)果的變異系數(shù)均小于2%。

4 結(jié) 論

本研究中，根據(jù)GTPV全基因組序列，與GTPV疫苗毒株（AV41毒株）、GTPV野毒株（GTPV-WT）、羊口瘡病毒（OrfV）、牛結(jié)節(jié)性皮膚病毒（LSDV）、改造的牛痘病毒（MVA）和綿羊痘病毒（SPPV）進(jìn)行序列比對(duì)，參考qPCR引物設(shè)計(jì)原則優(yōu)化評(píng)估，最終建立了一種特異性靶向GTPV基因組中GPCR基因的熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法具有靈敏性高、重復(fù)性好和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為山羊痘疫情的早期診斷及疫情防控提供一種有效的檢測(cè)技術(shù)手段。

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（編輯 白永平）